楊玉紅，李 鑫，楊 建，劉長江，康宗利,*

軟棗獼猴桃根中蒽醌類化合物的分離純化和含量測定

楊玉紅1,2，李 鑫3，楊 建2，劉長江3，康宗利2,*

（1.沈陽工學(xué)院生命工程學(xué)院，遼寧 撫順 113122；2.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，遼寧 沈陽 110866；3.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，遼寧 沈陽 110866）

利用聚酰胺柱層析和硅膠柱層析法從軟棗獼猴桃根中分離純化蒽醌化合物，采用高效液相色譜法分析法檢測軟棗獼猴桃根中蒽醌類化合物的含量。結(jié)果表明：分離的最佳條件為200 目硅膠、φ1.1 cm×100 cm層析柱、洗脫劑流速1.5 mL/min；甲醇-水（90∶10，V/V）流動相、254 nm檢測波長的高效液相色譜測定軟棗獼猴桃根中蒽醌主要組分為大黃素和大黃酚，其含量分別為46 μg/g和157.5 μg/g。

軟棗獼猴桃根；蒽醌；分離純化；檢測

軟棗獼猴桃是一種豐富的天然資源，營養(yǎng)價值很高，含大量VC、淀粉、果膠質(zhì)、蒽醌化合物等物質(zhì)[1-3]，具有調(diào)節(jié)免疫功能[4]、抗感染、抗腫瘤作用[5]，不僅如此，軟棗獼猴桃還具有抗衰老作用[6-7]和抗疲勞及耐缺氧功能等作用[8]，根及根皮對消化道癌有一定治療和抑制作用[9-10]。國內(nèi)外關(guān)于軟棗獼猴桃根中蒽醌化合物成分的研究報道很少，開展這方面的研究具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

軟棗獼猴桃根，采自沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)軟棗獼猴桃研究基地。

無水乙醇、石油醚、飽和正丁醇、氯仿、乙酸乙酯、聚酰胺、硅膠（均為分析純）、甲醇（色譜純）國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；大黃素、大黃素甲醚、大黃酚 中國食品藥品檢定研究院。

1.2 儀器與設(shè)備

HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋 常州國華電器有限公司；BS-100A自動部份收集器、HL-2B恒流泵 上海滬西分析儀器廠；U2910紫外分光光度計 昆山安富利化工有限公司；RE-52旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠；LL3000凍干機(jī) 丹麥Heto公司；1100高效液相色譜儀（配二極管陣列檢測器） 美國Agilent公司；KQ-500DB超聲波清洗儀 上海道京儀器有限公司；Spuirl-C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm） 美國迪馬公司。

1.3 方法

1.3.1 軟棗獼猴桃根中蒽醌類化合物的分離與純化[11-16]取1 000 g軟棗獼猴桃根粉末，用5 000 mL的70%的乙醇回流提取3 次（1.5 h/次），減壓濃縮成膏狀物。水懸浮后依次使用石油醚、氯仿和飽和正丁醇萃取。氯仿萃取物經(jīng)聚酰胺柱色譜梯度洗脫，以石油醚-乙酸乙酯（150∶1、30∶1，V/V）系統(tǒng)梯度洗脫。分部收集洗脫液，用苯酚-硫酸法繪制洗脫曲線進(jìn)行檢測，根據(jù)洗脫曲線收集各均一組分，得到蒽醌類化合物Ⅲ。流程如下：

1.3.2 軟棗獼猴桃根中蒽醌類化合物的進(jìn)一步分離、純化

選擇不同型號的硅膠層析柱以及不同的洗脫劑流速進(jìn)行硅膠柱層析，對軟棗獼猴桃根蒽醌組分進(jìn)行進(jìn)一步分離，以確定最佳分離條件。分部收集洗脫液，根據(jù)洗脫曲線收集各均一組分，分別得到蒽醌類化合物Ⅰ、Ⅱ。

1.3.3 樣品處理[17-28]

軟棗獼猴桃根80 ℃干燥8 h，取出粉碎成細(xì)粉，過0.250 mm篩，稱取0.2 g細(xì)粉置25 mL離心管中， 加入2.5 mol/L的H2SO4溶液10 mL， 于超聲器上混勻，置沸水浴中維持30 min，取出加水8 mL，振蕩使均勻，離心10 min（2 500 r/min），用注射器經(jīng)微孔濾膜壓濾，濾液棄去。濾膜和離心后沉淀反復(fù)加乙醇超聲振蕩提取6 次，每次加乙醇10 mL，超聲波破碎6 min（320 W），離心3 min（2 000 r/min），收集上清液于100 mL 容量瓶中，定容至刻度，搖勻。取適量溶液用0.45 μL的微濾膜過濾，備用供高效液相色譜進(jìn)樣。

1.3.4 色譜條件

色譜柱：C18柱；流動相：甲醇-水（90∶10，V/V）；檢測波長：254 nm；自動進(jìn)樣，進(jìn)樣量：10 μL；柱溫：25 ℃；流速：0.45 mL/min[13]。

2 結(jié)果與分析

2.1 軟棗獼猴桃根蒽醌的初步分離結(jié)果

圖1 軟棗獼猴桃根蒽醌聚酰胺柱層析結(jié)果Fig.1 Elution profile of anthraquinones from root of Actinidia arguta Sieb. et Zucc. by polyamide column chromatography

由圖1可知，聚酰胺柱層析對軟棗獼猴桃根蒽醌有良好地分離效果。洗脫得到3 個明顯洗脫峰，其中，軟棗獼猴桃根蒽醌-Ⅰ和軟棗獼猴桃根蒽醌-Ⅱ為石油醚-乙酸乙酯（150∶1，V/V）洗脫后的產(chǎn)物，該洗脫劑洗脫出的兩種蒽醌組分并沒有完全分離，需進(jìn)一步分離純化；軟棗獼猴桃根蒽醌-Ⅲ為石油醚-乙酸乙酯（30∶1，V/V）洗脫后的產(chǎn)物。其中，軟棗獼猴桃根蒽醌-Ⅰ和軟棗獼猴桃根蒽醌-Ⅱ，后續(xù)實驗對其進(jìn)行進(jìn)一步分離，并以該組分為研究對象。

2.2 軟棗獼猴桃根蒽醌組分的進(jìn)一步分離結(jié)果

圖2 洗脫劑流速為1.5 mL/min的層析柱層析結(jié)果Fig.2 Elution profile of anthraquinones from root of Actinidia arguta Sieb. et Zucc. by silica gel column chromatography with e flow rate of 1.5 mL/min

圖3 洗脫劑流速為2 mL/min的層析柱層析結(jié)果Fig.3 Elution profile of anthraquinones from root of Actinidia arguta Sieb. et Zucc. by silica gel column chromatography with flow rate of 2 mL/min

將體積比為150∶1的石油醚-乙酸乙酯洗脫產(chǎn)物復(fù)溶后的蒽醌溶液，選用200 目的硅膠對軟棗獼猴桃根蒽醌進(jìn)行硅膠柱層析，柱型規(guī)格φ 1.1 cm×100 cm。洗脫劑流速分別為1.5 mL/min、5 min/管和2 mL/min、4 min/管，分部收集，洗脫液用苯酚-硫酸法檢測繪制洗脫曲線，以選擇分離效果最好的洗脫劑流速，結(jié)果如圖2、3所示。

由圖2可以看出，當(dāng)洗脫劑流速為1.5 mL/min、5 min/管時，軟棗獼猴桃根蒽醌-Ⅰ和軟棗獼猴桃根蒽醌-Ⅱ完全分離，可以收集單一組分。由圖3可以看出，2 mL/min、4 min/管組分分離效果不是很好，流速大，易使譜帶擴(kuò)散，無法獲得單一組分。因此，選擇洗脫劑流速為1.5 mL/min、5 min/管進(jìn)行分離。

2.3 兩種蒽醌的標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖4 3 種蒽醌標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖Fig.4 Chromatogram of three anthraquinone standards

按照1.3.4節(jié)條件分別測定大黃素、大黃酚及大黃素甲醚的保留時間分別為4.836、9.470 min和12.540 min（圖4）。另外，在254 nm波長處分別測定0.1、0.2、0.5、1.0、2.0 μg/mL 5 種質(zhì)量濃度的大黃素標(biāo)準(zhǔn)溶液在保留時間為4.836 min時的峰面積；分別測定5、10、20、50、100 μg/mL 5 種質(zhì)量濃度的大黃酚標(biāo)準(zhǔn)溶液在保留時間為9.470 min時的峰面積，測定兩種蒽醌5 個不同質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，得到色譜峰面積，利用Excel，以峰面積為縱坐標(biāo)，以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，繪制得到兩種蒽醌的標(biāo)準(zhǔn)曲線，方程如表1所示，兩種蒽醌在0.5×10-4～20×10-4mg/mL范圍內(nèi)線性良好。

表1 標(biāo)準(zhǔn)曲線線性回歸方程Table 1 Linear regression equations for emodin and chrysophanol

2.4 軟棗獼猴桃根中蒽醌化合物的含量測定

前處理提取后樣品按1.3.4節(jié)條件進(jìn)樣測定，將大黃素及大黃酚色譜峰面積代入線性回歸方程計算得到提取液中二者的含量為9.2 μg/mL和31.5 μg/mL，經(jīng)換算最終得出軟棗獼猴桃根中大黃素及大黃酚的含量分別為46 μg/g和157.5 μg/g（圖5）。

圖5 樣品色譜圖Fig.5 Chromatogram of sample

2.5 回收率

采用加樣回收法，精密稱取已測含量的蒽醌樣品，分別加入大黃素、大黃素甲醚對照品貯備液1 mL，按樣品制備方法（1.3.3節(jié)）制得樣液，平行3 次進(jìn)樣分析。加樣量分別為大黃素0.5 mg、大黃酚1 mg。3 次平均回收量分別為大黃素0.498 mg、大黃酚0.997 mg。3 次平均回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為：大黃素99.6%、1.02%，大黃酚99.7%、1.04%。

3 結(jié) 論

利用聚酰胺柱層析和硅膠柱層析對軟棗獼猴桃根中蒽醌類化合物進(jìn)行分離純化，得到3 種軟棗獼猴桃蒽醌組分；選用200 目的硅膠，φ 1.1 cm×100 cm層析柱，洗脫劑流速1.5 mL/min的條件對軟棗獼猴桃根蒽醌組分進(jìn)一步分離，得到含量較高的軟棗獼猴桃蒽醌。甲醇-水（90∶10，V/V）為流動相、254 nm為檢測波長的高效液相色譜測定軟棗獼猴桃根中蒽醌主要組分為大黃素和大黃酚，其含量分別為：46 μg/g和157.5 μg/g。其中相對標(biāo)準(zhǔn)差均小于2%，回收率在99.5%～99.9%之間。色譜分析的結(jié)果準(zhǔn)確可靠，其線性關(guān)系、精密度和穩(wěn)定性均能滿足分析的需要。

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Isolation, Purification and Detection of Anthraquinone Compounds from the Root of Actinidia arguta Sieb. et Zucc.

YANG Yu-hong1,2, LI Xin3, YANG Jian2, LIU Chang-jiang3, KANG Zong-li2,*
(1. College of Life Engineering, Shenyang Institute of Technology, Fushun 113122, China; 2. College of Biological Science and Technology, Shenyang Agricultural University, Shenyang 110866, China; 3. College of Food Science, Shenyang Agricultural University, Shenyang 110866, China)

Anthraquinones from the root of Actinidia arguta Sieb. et Zucc. were isolated and purified by polyamide column chromatography and silica gel column chromatography and were determined by high performance liquid chromatography (HPLC). The results showed that the optimum silica gel column chromatographic conditions were selected as 200 mesh silica gel, column dimensions φ 1.1 cm × 100 cm, flow rate 1.5 mL/min and mobile phase composed of a mixture of methanol and water (90:10, V/V). The detection wavelength for anthraquinones was 254 nm. Emodin and chrysophanol as the major anthraquinones were detected in the root of Actinidia arguta Sieb. et Zucc. at levels of 46 and 157.5 μg/g, respectively.

root of Actinidia arguta Sieb. et Zucc.; anthraquinone; isolation and purification; detection

Q81

A

1002-6630（2014）16-0124-04

10.7506/spkx1002-6630-201416024

2013-10-07

公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專項（200903013）

楊玉紅（1973—），女，副教授，博士，研究方向為食品生物技術(shù)。E-mail：kzlyangyuhong@163.com

*通信作者：康宗利（1973—），男，副教授，博士，研究方向為植物次生物質(zhì)。E-mail：kangzongli@163.com