胡 雪，李翠枝*，劉麗君，康 愷，白艷梅，段國霞，張立佳

UPLC-MS-MS法測定飼料、原料乳及乳制品中3 種氯霉素類藥物殘留

胡 雪，李翠枝*，劉麗君，康 愷，白艷梅，段國霞，張立佳

（內(nèi)蒙古伊利實(shí)業(yè)集團(tuán)股份有限公司，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010110）

建立超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法檢測飼料、牛乳及廣義乳制品中氯霉素類藥物殘留的通用檢測方法。研究適用于檢測飼料、原料乳、液體乳、發(fā)酵乳、含乳飲料、乳粉、奶片、冷凍飲品中氯霉素類藥物的前處理方法以及適用的超高效液相色譜及質(zhì)譜條件。樣品經(jīng)低溫冷凍沉淀蛋白質(zhì)后，乙腈提取，飽和氯化鈉使乙腈、水分層，取上清液氮?dú)獯蹈啥ㄈ莺螅和槌?，乙腈、水梯度洗脫，電噴霧負(fù)離子多反應(yīng)監(jiān)測模式進(jìn)行檢測。氯霉素、甲砜霉素、氟甲砜霉素定量限0.1 μg/kg。氯霉素類藥物添加范圍0.1～2.5 μg/kg時，基質(zhì)效應(yīng)為57.9%～139.2%，回收率為64.3%～120.2%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.1%～10.0%。該方法具有簡單方便、檢測周期短、適用于更廣泛樣品檢測的特點(diǎn)。

超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用；氯霉素類藥物；飼料；乳制品

農(nóng)業(yè)部235號公告中規(guī)定，乳中不得檢出氯霉素，甲砜霉素殘留限量為50 μg/kg，GB/T 22338—2008《動物源性食品中氯霉素類藥物殘留量測定》中規(guī)定動物源性食品中氯霉素的定量限0.1 μg/kg。對于大型的乳品企業(yè)或者檢測機(jī)構(gòu)來說，經(jīng)常要同時監(jiān)測原料乳及各種乳制品中的氯霉素類藥物殘留，有時還要溯源到奶牛食用的飼料。但是在檢測的時候飼料和乳制品需要用不同的檢測方法[1-2]，而且國標(biāo)和參考文獻(xiàn)中涉及到的樣品都有一定的適用范圍[3-9]，步驟較為繁瑣[10-15]，檢驗成本較高[16]，不適用于大量、快速地對飼料、原料乳及乳制品中氯霉素類藥物殘留進(jìn)行排查。廣義的乳制品除了常規(guī)認(rèn)為的液體乳、乳粉，還包括發(fā)酵乳、奶片、含乳飲料及含乳冷凍飲品等。雖然有針對含乳冷凍飲品的檢測方法[17]，但其乙酸乙酯的提取方法只適用于純?nèi)檠└饧袄媳?，大部分成分?fù)雜的冷凍飲品在液-液萃取的時候會出現(xiàn)嚴(yán)重的乳化現(xiàn)象。本工作擬利用一種簡單并適用于更多樣品的前處理方法結(jié)合超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，UPLC-MS-MS）法實(shí)現(xiàn)對乳品行業(yè)所涉及到的飼料及產(chǎn)品中氯霉素類藥物殘留的快速、高效、準(zhǔn)確排查。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

飼料包括青貯飼料和豆粕飼料；液體乳包括純牛乳和核桃乳；發(fā)酵乳包括原味發(fā)酵乳和大果粒發(fā)酵乳；乳粉包括嬰幼兒配方乳粉和成人乳粉；冷凍飲品包括含巧克力的和含豆類的。

氯霉素、甲砜霉素和氟甲砜霉素（純度均大于97%） 德國Dr.Ehrenstorfer GmbH公司；同位素標(biāo)準(zhǔn)品氯霉素-D5美國Cambridge Isotope Laboratories公司；乙腈（色譜純）、正己烷（色譜純） 德國Meker公司。

1.2 儀器與設(shè)備

SIGMA 3K30低溫高速離心機(jī)（溫度可設(shè)置0 ℃，轉(zhuǎn)速可設(shè)置20 000 r/min） 德國Sigma公司；TQ Detector超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（配有電噴霧離子源）美國Waters公司。

1.3 方法

1.3.1 前處理

牛乳、液體乳、發(fā)酵乳、含乳飲料等液體樣品稱取5 g試樣，置于30 mL具塞離心管中，加入2 g氯化鈉、10 mL乙腈和100 μg/mL的內(nèi)標(biāo)溶液50 μL，渦旋混勻。在4 ℃冰箱中靜置20 min，之后0 ℃、10 000 r/min離心5 min。取5 mL上清液于35 ℃氮?dú)饬飨麓蹈?，?.5 mL 20%甲醇溶液溶解，旋渦振蕩，加入0.5 mL正己烷，旋渦振蕩，轉(zhuǎn)移至1.5 mL離心管中，4 ℃、20 000 r/min離心5 min，吸取下層液體至進(jìn)樣瓶中，供超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀分析使用。飼料、乳粉、奶片、冷凍飲品等固體樣品均質(zhì)粉碎后取0.5 g試樣，置于30 mL具塞離心管中，加入5 mL、40 ℃超純水，混勻后前處理步驟與液體樣品相同。成分復(fù)雜的冷凍飲品用正己烷除脂兩次，可以得到清澈的待測液。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

分別準(zhǔn)確稱取適量的氯霉素、氯霉素-D5、甲砜霉素和氟甲砜霉素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，用乙腈配制成100 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液，4 ℃避光保存，標(biāo)準(zhǔn)儲備液在6 個月內(nèi)穩(wěn)定。將氯霉素、甲砜霉素和氟甲砜霉素用20%甲醇溶液配制成100 μg/L的混標(biāo)，氯霉素-D5單獨(dú)稀釋成100 μg/L的中間工作液。將100 μg/L的混標(biāo)用20%甲醇溶液配制為適當(dāng)質(zhì)量濃度（0.25、0.5、1、2.5、5、10、25 μg/L）的標(biāo)準(zhǔn)工作液，標(biāo)準(zhǔn)工作液含內(nèi)標(biāo)質(zhì)量濃度為2.5 μg/L。氯霉素用內(nèi)標(biāo)法定量，甲砜霉素、氟甲砜霉素用外標(biāo)法定量。

1.3.3 空白基質(zhì)標(biāo)線的制備及添加回收率

樣品相同的前處理方法得到空白基質(zhì)液，用該空白基質(zhì)液將混標(biāo)配制成所需質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作液，上機(jī)后得到空白基質(zhì)標(biāo)線。添加回收率實(shí)驗，在陰性樣品中添加一定質(zhì)量濃度的混標(biāo)，混勻后按照樣品前處理方法進(jìn)行處理，上機(jī)后得到的結(jié)果與理論添加值的比值，即為回收率。

1.3.4 色譜條件

色譜柱：Acquity UPLC BEH C18柱（50 mm×2.1 mm，1.7 μm）；柱溫：40 ℃；進(jìn)樣量：10 μL；流動相：A為乙腈，B為水；流速：300 μL/min；線性梯度洗脫條件：0～2 min，5%～45% A；2～3 min，45%～55% A；3.0～3.5 min，55%～100% A；3.5～4.0 min，100%～5% A；4～5 min，5% A。

1.3.5 質(zhì)譜條件

電離模式：電噴霧負(fù)離子模式；毛細(xì)管電壓：2.8 kV；源溫：120 ℃；脫溶劑溫度：400 ℃；脫溶劑氣流量：600 L/h；碰撞室壓力：0.31 Pa（3.1×10-3mbar）。多反應(yīng)監(jiān)測方式檢測，其他質(zhì)譜條件見表1。

2 結(jié)果與分析

2.1 前處理方法選擇

乙腈和乙酸乙酯是氯霉素類藥物常用的提取液，經(jīng)過實(shí)驗發(fā)現(xiàn)大多數(shù)成分復(fù)雜的嬰幼兒乳粉及冷凍飲品用乙酸乙酯提取時會發(fā)生嚴(yán)重的乳化現(xiàn)象，因此選擇乙腈作為提取液。但是乙酸乙酯可以和水分層，乙腈和水互溶，因此添加氯化鈉，使得飽和氯化鈉溶液和乙腈分層明顯。經(jīng)過實(shí)驗發(fā)現(xiàn)，常溫離心和冷凍離心的區(qū)別非常明顯，樣品經(jīng)過充分降溫并在0 ℃高速離心后，脂肪蛋白沉淀增多，上清液更加透明，因此選擇冷凍離心。除了成分復(fù)雜的冷凍飲品以外，其他的樣品經(jīng)過正己烷一次除脂以后可達(dá)到上機(jī)要求，部分冷凍飲品經(jīng)過正己烷一次除脂以后依然混濁，此時棄去上層正己烷，進(jìn)行二次除脂可達(dá)到上機(jī)要求。

2.2 液相條件選擇

色譜柱選擇Acquity UPLC BEH C18柱，氯霉素類藥物在C18柱上的保留性不是很強(qiáng)，為了推后出峰時間，實(shí)現(xiàn)更好地分離效果，減少基質(zhì)效應(yīng)，選用梯度洗脫，起始流動相中有機(jī)相含量選擇C18柱的最低耐受量5%。流動相體系選擇6 種進(jìn)行比較，分別為0.1%甲酸-甲醇、0.1%甲酸-乙腈、10 mmol/L乙酸銨-甲醇、10 mmol/L乙酸銨-乙腈、水-甲醇、水-乙腈，純牛乳空白基質(zhì)配制標(biāo)準(zhǔn)工作液質(zhì)量濃度為2.5 μg/L，不同液相條件下的總離子流色譜圖如圖1所示。甲醇體系雖然分離效果更好，但是都有嚴(yán)重的拖尾現(xiàn)象，乙腈體系峰形優(yōu)于甲醇體系，而且甲砜霉素在乙腈體系中響應(yīng)值更高。在3 種乙腈體系中，水-乙腈的響應(yīng)值最高。因此，綜合考慮基質(zhì)效應(yīng)、分離效果、峰形和響應(yīng)值高低，最終選擇水-乙腈體系。

圖1 不同液相條件下的總離子流色譜圖Fig.1 Total ion chromatograms obtained with different mobile phases

2.3 基質(zhì)效應(yīng)實(shí)驗

質(zhì)譜基質(zhì)效應(yīng)的影響因素有很多，可以優(yōu)化的條件包括樣品前處理、同位素內(nèi)標(biāo)、色譜分離、質(zhì)譜分析等[18-19]。本實(shí)驗采用的前處理方法和液相方法較簡便，同時檢測的樣品種類繁多，因此氯霉素采用內(nèi)標(biāo)法定量。針對不同類樣品，選擇具有代表性的樣品進(jìn)行了基質(zhì)效應(yīng)的考察。用每種空白基質(zhì)配制2.5 μg/L的標(biāo)準(zhǔn)工作液與用20%甲醇配制的標(biāo)準(zhǔn)工作液進(jìn)行比較，二者峰面積做比值，大于100%的有基質(zhì)增強(qiáng)作用，小于100%的有基質(zhì)抑制作用[20]。每個樣品重復(fù)條件下做5 次，取平均值，不同類樣品基質(zhì)效應(yīng)的結(jié)果見表2。飼料有明顯的基質(zhì)抑制作用，其他樣品都有不同程度的基質(zhì)增強(qiáng)作用，基質(zhì)增強(qiáng)較明顯的是發(fā)酵乳，因此在定量的時候，飼料和發(fā)酵乳要用空白基質(zhì)配制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

表2 各種樣品的基質(zhì)效應(yīng)Table 2 Matrix effects of different samples %

2.4 準(zhǔn)確度與精密度實(shí)驗

每類樣品選擇具有代表性的樣品進(jìn)行回收率實(shí)驗，6 次結(jié)果計算平均值，對于基質(zhì)效應(yīng)較強(qiáng)的樣品如飼料和發(fā)酵乳，用空白基質(zhì)配制標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量，測定數(shù)據(jù)見表3。

表3 不同樣品回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差實(shí)驗結(jié)果Table 3 Recovery and relative standard deviation (RSD) of different samples

由表3可知，按已確定的樣品前處理條件和儀器條件測定添加回收率，其回收率達(dá)到64.3%～120.2%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在2.1%～10.0%，說明該方法適用于飼料、原料乳和廣義乳制品中不同含量氯霉素類藥物殘留的測定，均有較好的準(zhǔn)確度和精密度。選擇國標(biāo)規(guī)定的定量限0.1 μg/kg做回收率添加實(shí)驗，其中，基質(zhì)抑制最明顯，響應(yīng)值最低的青貯飼料，氯霉素信噪比為29.6，甲砜霉素信噪比為17.0，氟甲砜霉素信噪比為26.9，所有樣品在該添加水平測得的信噪比均大于定量限信噪比10。因此該方法定量限依據(jù)國標(biāo)定為0.1 μg/kg。

3 結(jié) 論

提供了一種適用于飼料、原料乳及更廣泛樣品快速簡單的UPLC-MS-MS檢測方法，對前處理、液相條件進(jìn)行了優(yōu)化，在氯霉素、甲砜霉素、氟甲砜霉素的添加量為0.1～2.5 μg/kg時，其準(zhǔn)確度和精密度均符合要求，定量限和國標(biāo)中規(guī)定的一致。考察了飼料、原料乳及廣義乳制品用冷凍法沉淀蛋白，乙腈提取，正己烷除脂的前處理條件下，不同樣品的基質(zhì)效應(yīng)，保證了該檢測方法的可靠性。與其他檢測方法相比，該檢測方法具有以下特點(diǎn)：前處理簡單，節(jié)省檢測成本，檢測周期短，適用于乳品行業(yè)從源頭（飼料）一直到產(chǎn)品（更廣泛樣品）所涉及到的樣品的檢測。

[1] 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測技術(shù)研究院, 國家飼料質(zhì)量監(jiān)督檢驗中心(北京). GB/T 21108—2007 飼料中氯霉素的測定: 高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法[S]. 北京: 中國標(biāo)準(zhǔn)出版社, 2007.

[2] 中國檢驗檢疫科學(xué)研究院, 山東出入境檢驗檢疫局. GB/T 22338—2008 動物源性食品中氯霉素類藥物殘留量測定[S]. 北京: 中國標(biāo)準(zhǔn)出版社, 2008.

[3] 馮婭, 程傳民. 超高效液相色譜測定飼料中氯霉素殘留量[J]. 中國飼料, 2008(4): 31-32.

[4] 馮民, 魏云計, 朱臻怡, 等. 高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時測定飼料中氯霉素、甲砜霉素與氟甲砜霉素殘留量[J]. 分析測試學(xué)報, 2013, 32(1): 117-121.

[5] 賈濤, 關(guān)洪英. 液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法檢測飼料中的氯霉素[J]. 監(jiān)測分析, 2012(4): 38-42.

[6] 任佳, 鄭小平, 黃菲菲. UPLC-MS/MS法測定乳制品中的氯霉素類藥物[J]. 安全與檢測, 2011, 27(4): 75-81.

[7] WANG Hao, ZHOU Xiangjuan, LIU Yanqin, et al. Simultaneous determination of chloramphenicol and aflatoxin M1residues in milk by triple quadrupole liquid chromatography tandem mass spectrometry[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2011, 59(19): 3532-3538.

[8] CHEN Xiaobin, WU Yinliang, YANG Ting. Simultaneous determination of clenbuterol, chloramphenicol and diethylstilbestrol in bovine milk by isotope dilution ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry[J]. Journal of Chromatography B, 2011, 879: 799-803.

[9] GRéGORY B, PIERRE P, PATRICE T. Rapid determination of chloramphenicol in honey by laser diode thermal desorption using atmospheric pressure chemical ionization-tandem mass spectrometry[J]. Journal of AOAC International, 2013, 96(3): 676-679.

[10] 呂飛, 周宇, 余優(yōu)軍, 等. LC-MS/MS測定飼料中氯霉素殘留量兩種不同前處理方法的比較[J]. 糧食與飼料工業(yè), 2012, 17(8): 61-64.

[11] REZENDE D R, FILHO N F, ROCHA G L. Simultaneous determination of chloramphenicol and florfenicol in liquid milk, milk powder and bovine muscle by LC-MS-MS[J]. Food Additives and Contaminants, 2012, 29(4): 559-570.

[12] HAN Juan, WANG Yun, YU Cuilan, et al. Extraction and determination of chloramphenicol in feed water, milk, and honey samples using an ionic liquid/sodium citrate aqueous two-phase system coupled with high-performance liquid chromatography[J]. Analytical and Bioanalytical Chemistry, 2011, 399(3): 1295-1304.

[13] TIAN Hongzhen. Determination of chloramphenicol, enrofloxacin and 29 pesticides residues in bovine milk by liquid chromatographytandem mass spectrometry[J]. Chemosphere, 2011, 83(10): 349-355.

[14] 邢字, 郭麗娜, 孫偉. 液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法檢測乳制品中氯霉素的方法研究[J]. 質(zhì)量安全, 2013(10): 46-48.

[15] 鞏軍, 褚中秋, 姜金斗, 等. 超高效液相色譜-三重四級桿質(zhì)譜測定乳及乳制品中氯霉素的殘留[J]. 中國乳品工業(yè), 2012, 40(7): 50-52.

[16] 李應(yīng)國, 趙旭博, 張雷. 免疫親和柱-高效液相色譜法檢測乳制品中氯霉素[J]. 中國乳品工業(yè), 2011, 39(4): 53-62.

[17] 余曉麒, 韓飛, 朱虹, 等. UPLC-MS-MS法快速測定含乳冷凍飲品中氯霉素殘留量[J]. 化學(xué)分析計量, 2012, 21(3): 47-49.

[18] 向平, 沈敏, 卓先義. 液相色譜-質(zhì)譜分析中的基質(zhì)效應(yīng)[J]. 分析測試學(xué)報, 2009, 28(6): 753-756.

[19] 王立琦, 賀利民, 曾振靈. 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測獸藥殘留中的基質(zhì)效應(yīng)研究進(jìn)展[J]. 質(zhì)譜學(xué)報, 2011, 32(6): 321-332.

[20] 王立琦, 曾振靈, 束建花. 液相色譜-電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜測定豬組織中β-興奮劑殘留的基質(zhì)效應(yīng)[J]. 分析化學(xué)研究簡報, 2012, 40(9): 1455-1499.

Determination of Chloramphenicol, Thiamphenicol and Florfenicol Residues in Feed, Raw Milk and Dairy Products by UPLC-MS-MS

HU Xue, LI Cui-zhi*, LIU Li-jun, KANG Kai, BAI Yan-mei, DUAN Guo-xia, ZHANG Li-jia
(Inner Mongolia Yili Industrial Group Co. Ltd., Hohhot 010110, China)

An ultra-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (UPLC-MS-MS) method for simultaneous determination of chloramphenicol, thiamphenicol and florfenicol residues in feed, raw milk and dairy products was developed. The extraction procedures and the UPLC-MS-MS conditions for feed, raw milk, liquid milk, fermented milk, milk drinks, milk powder, milk tablet and frozen drinks were studied. After protein in samples was precipitated by cooling down, the compounds were extracted into acetonitrile, which was separated into layers in the presence of added saturated sodium chloride. The supernatant was dried under nitrogen, and then re-dissolved before the removal of fat by addition of n-hexane. The compounds were analyzed in a negative electrospray ion multiple reaction monitoring mode with a mobile phase composed of acetonitrile and water by means of gradient elution. The limit of quantification (LOQ) was 0.1 μg/kg for chloramphenicol, thiamphenicol and florfenicol. The matrix effects, recovery rates, and relative standard deviation (RSD) were 57.9%-139.2%, 64.3%-120.2% and 2.1%-10.0%, at fortification levels of 0.1-2.5 μg/kg for chloramphenicol, thiamphenicol and florfenicol, respectively. This method is simple, convenient, fast and suitable for the quantification and confirmation of chloramphenicol, thiamphenicol, and florfenicol in feed, milk and dairy products.

ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (UPLC-MS-MS); chloramphenicol; feed; dairy products

TS252.7

A

1002-6630（2014）16-0110-04

10.7506/spkx1002-6630-201416021

2013-10-23

“十二五”國家科技支撐計劃項目（2012BAK17B00）

胡雪（1981—），女，工程師，碩士，研究方向為檢測分析。E-mail：jthuxue@yili.com

*通信作者：李翠枝（1969—），女，高級工程師，碩士，研究方向為食品安全預(yù)防控制。E-mail：lczg@yili.com