趙 強(qiáng)，索有瑞*，李天才，趙海福，董曉寧

響應(yīng)面法優(yōu)化苦蕎皮中總黃酮超聲波提取工藝

趙 強(qiáng)1,2，索有瑞1,*，李天才1，趙海福3，董曉寧2

（1.中國科學(xué)院西北高原生物研究所，青海 西寧 810001；2.天水師范學(xué)院生物工程與技術(shù)學(xué)院，甘肅 天水 740001；3.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，甘肅 蘭州 730070）

以苦蕎皮為研究對(duì)象，在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用Box-Behnken響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)法，對(duì)苦蕎皮中總黃酮提取工藝條件進(jìn)行研究，并對(duì)提取物進(jìn)行高效液相色譜法檢測(cè)。結(jié)果表明，影響苦蕎皮中總黃酮含量的因素大小順序?yàn)橐掖俭w積分?jǐn)?shù)、液料比、回流時(shí)間、超聲時(shí)間，最佳提取工藝為乙醇體積分?jǐn)?shù)65%、液料比14∶1（mL/g）、回流時(shí)間1.6 h、超聲時(shí)間28 min，苦蕎皮中總黃酮最高含量為1.49520%，高效液相色譜法檢測(cè)重復(fù)性良好。

苦蕎皮；總黃酮；響應(yīng)面法；高效液相色譜法

苦蕎，又稱韃靼蕎麥，是一種適合于在冷涼氣候下生長的短季蓼科蕎麥屬雙子葉藥食兼用植物，在我國主要分布于甘肅、四川、云南、貴州等地?？嗍w的性味甘苦、平、寒、有益氣力，有利耳目，降氣寬腸健胃的作用[1-3]。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)表明，苦蕎中富含蛋白質(zhì)、維 生素、礦物元素等，具有抗氧化、降三高、抗腫瘤等多種藥理活性，其含有極為豐富的生物活性成分——黃酮類化合物，總黃酮含量為普通蕎麥的10～100 倍[3-5]。黃酮類化合物主要是指結(jié)構(gòu)為2-苯基色原酮的一類天然有機(jī)化合物，在植物體內(nèi)通常與糖結(jié)合成苷類，小部分以游離態(tài)（苷元）的形式存在。近年來，有研究表明食用富含黃酮類的食物還可以降低癌癥的發(fā)病率，增強(qiáng)人體免疫力，對(duì)糖尿病、高血壓、冠心病、中風(fēng)等疾病有輔助療效[6]。我國苦蕎常年播種面積約30萬 ha，總產(chǎn)量約30萬 t，資源豐富?？嗍w皮作為苦蕎制粉過程中的副產(chǎn)物，產(chǎn)率約為224 g/kg，亦富含黃酮類化合物，可作為一種廉價(jià)而豐富的總黃酮提取材料，具有較好的市場前景[7-8]。

目前，提取總黃酮的方法有恒溫水浴振蕩提取、有機(jī)溶劑浸提、堿性水或堿性稀醇提取以及酶法提取等，但這些方法提取時(shí)間較長，提取率較低[9]。而超聲波輔助提取則是利用超聲波在液體中的空化作用，加速植物有效成分迅速進(jìn)入溶劑，從而提高提取效率，縮短提取時(shí)間[10-11]。本實(shí)驗(yàn)以苦蕎皮為原料，采用統(tǒng)計(jì)軟件Design-Expert中響應(yīng)面法的Box-Behnken模式，對(duì)苦蕎皮中總黃酮的超聲波輔助提取工藝進(jìn)行研究。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

苦蕎皮（采集于甘肅省天水市農(nóng)業(yè)高新科技園區(qū)規(guī)范化種植的苦蕎），自然風(fēng)干。

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品（批號(hào)：F20051222） 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑公司；95%乙醇、Al(NO3)3、NaOH、NaNO2均為分析純。

1100型高效液相色譜儀 美國安捷倫公司；RE52-99型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器廠；Q-500DE型數(shù)控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；UV751GD型紫外-可見分光光度計(jì)、FA22048型電子天平上海精密科學(xué)儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的繪制

準(zhǔn)確稱取0.200 8 g蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品，用三重水溶解，移入100 mL容量瓶中定容、搖勻。再次稀釋，得到質(zhì)量濃度為1.34 mg/L蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別移取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液0.50、1.00、1.50、2.00、2.50、3.00、3.50、4.00、4.50 mL和5.00 mL，置于50 mL容量瓶中，分別加入10.00 mL蒸餾水、3.00 mL 5% NaNO2溶液，6 min后加入6.00 mL 1% Al(NO3)3溶液，6 min后加入20.00 mL 4% NaOH溶液，15 min后定容、搖勻、靜置。以三重水做空白對(duì)照，在510 nm波長處測(cè)其吸光度。以質(zhì)量濃度（mg/mL）為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.2 苦蕎皮中總黃酮的制備

準(zhǔn)確稱取6.00 g干燥的苦蕎皮，按設(shè)計(jì)的時(shí)間浸泡，在不同的溫度與功率條件下超聲振蕩處理；采用索氏回流法提取苦蕎皮中的總黃酮，將提取液轉(zhuǎn)入旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，減壓濃縮至無醇味，轉(zhuǎn)入100 mL錐形瓶，加入少許活性炭脫色，靜置過夜，抽濾，將濾液按編號(hào)裝入容量瓶，并定容至50 mL，靜置待測(cè)定[12]。

1.2.3 苦蕎皮中總黃酮含量的測(cè)定

以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品，用亞硝酸鈉-硝酸鋁顯色法處理后，在510 nm波長處測(cè)其吸光度，計(jì)算苦蕎皮中總黃酮的含量[12-15]。即將待測(cè)液2.00 mL于50 mL容量瓶內(nèi)，分別加入10.00 mL蒸餾水、3.00 mL 5% NaNO2溶液，6 min后加入6.00 mL 1% Al(NO3)3溶液，6min后加入20.00 mL 4% NaOH溶液，15 min后定容、搖勻。以三重水做空白對(duì)照，在510 nm波長處，測(cè)其吸光度A。對(duì)照蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出提取液中總黃酮質(zhì)量濃度，最后計(jì)算出苦蕎皮提取液中總黃酮含量，其計(jì)算公式為：

式中：c為苦蕎中總黃酮質(zhì)量濃度/（mg/mL）；V為待測(cè)液的體積/mL；N為稀釋倍數(shù)；m為苦蕎皮的質(zhì)量/mg。

1.2.4 苦蕎皮中總黃酮的提取工藝

選取乙醇體積分?jǐn)?shù)、液料比、超聲時(shí)間、回流時(shí)間、浸泡時(shí)間、超聲溫度、超聲功率、浸提液pH值8 個(gè)因素依次進(jìn)行單因素輪換提取試驗(yàn)[10,15]。各因素的水平梯度設(shè)置分別為乙醇體積分?jǐn)?shù)35%、50%、65%、80%、95%，液料比5∶1、10∶1、15∶1、20∶1、25∶1（mL/g），超聲時(shí)間15、30、45、60、70 min，回流時(shí)間0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h，浸泡時(shí)間6、12、18、24、30 h，超聲溫度35、40、45、50、55 ℃，超聲功率200、250、300、350、400 W，浸提液pH 4.0、5.0、6.0、7.0、8.0。根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，采用極差分析法篩選出4 個(gè)主要影響因素。然后按照響應(yīng)面法試驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行苦蕎皮中總黃酮提取工藝優(yōu)化，最后建立苦蕎皮中總黃酮提取工藝。

1.2.5 響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平的選擇

采用極差分析對(duì)8 組單因素水平進(jìn)行篩選，最終選用乙醇體積分?jǐn)?shù)、回流時(shí)間、超聲時(shí)間、液料比4個(gè)因素為主要考察因素，進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)，按響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行總黃酮提取，試驗(yàn)因素與水平見表1。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels used in response surface design

1.2.6 高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）檢測(cè)

以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品，將最佳工藝下提取的苦蕎皮中的總黃酮進(jìn)行高效液相色譜法測(cè)定，并且進(jìn)行回收率的測(cè)定。

1.2.6.1 色譜條件

色譜柱：Zorbax eclipse XDB C18柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）；流動(dòng)相：甲醇-0.2%磷酸溶液（65∶35，V/V）；流速：1.0 mL/min；檢測(cè)波長：254 nm；柱箱溫度（30±1）℃；進(jìn)樣量：20 μL。

1.2.6.2 HPLC測(cè)定的工作曲線的繪制

準(zhǔn)確配制質(zhì)量濃度為0.025 0 mg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液，靜置備用。將其依次配成質(zhì)量濃度為0.187 5、0.375 0、0.750 0、1.500 0、3.000 0 μg/mL的梯度溶液，進(jìn)行HPLC檢測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線

根據(jù)系列質(zhì)量濃度梯度的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品在510 n m波長處測(cè)得的吸光度，以質(zhì)量濃度（mg/mL）為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程：Y=7.121 4X＋0.029 1，R2=0.999 8（n=8）；在0.01～0.15 mg/mL范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

2.2 單因素篩選試驗(yàn)

圖1 單因素試驗(yàn)結(jié)果Fig.1 Results of single-factor experiments

由圖1可知，所選8 個(gè)單因素的最佳值條件分別為乙醇體積分?jǐn)?shù)65%、液料比15∶1（mL/g）、超聲時(shí)間30 min、回流時(shí)間1.5 h、浸泡時(shí)間30 h、超聲溫度50 ℃、超聲功率300 W、浸提液pH 8.0。

2.3 苦蕎皮中總黃酮的響應(yīng)面試驗(yàn)方案設(shè)計(jì)及結(jié)果

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 2 Experimental designs and results for response surface analysis

采用Design-Expert 7.0分析軟件，利用Box-Behnken設(shè)計(jì)原理[16-17]，以蘆丁的含量為響應(yīng)值，以A（乙醇體積分?jǐn)?shù)）、B（回流時(shí)間）、C（超聲時(shí)間）、D（液料比）4 個(gè)因素為自變量，進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)。設(shè)計(jì)四因素三水平（共29 個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)，5 個(gè)中心點(diǎn)）的響應(yīng)面試驗(yàn)，其設(shè)計(jì)及結(jié)果見表2。

表2中共有29 組試驗(yàn)，其中1～24 組是析因試驗(yàn)，25～29 組是中心試驗(yàn)。29 個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)分別為析因點(diǎn)和零點(diǎn)；中心試驗(yàn)進(jìn)行3 次，中心試驗(yàn)用以估計(jì)試驗(yàn)的誤差，其中析因點(diǎn)為A、B、C和D所構(gòu)成的三維空間的頂點(diǎn)，零點(diǎn)為區(qū)域的中心點(diǎn)。

2.4 不同因素對(duì)苦蕎皮中總黃酮含量的影響

采用SAS RSREG程序?qū)λ脭?shù)據(jù)進(jìn)行響應(yīng)面分析，得到4 個(gè)因子與苦蕎皮中總黃酮含量之間的模擬回歸方程為：Y=-48.100 9＋0.957 0A＋18.159 2B＋0.372 5C＋1.904 9D＋0.104 4AB＋0.000 1AC＋0.000 8AD-0.095 7BC-0.347 8BD＋0.004 8CD-0.008 9A2-5.773 1B2-0.005 3C2-0.054 5D2。

對(duì)該回歸模型進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)及方差分析，其結(jié)果見表3所示。

表3 響應(yīng)面試驗(yàn)方差分析Table 3 Analysis of variance for the response surface regression model

由表3中方差分析結(jié)果可知模型P=0.041 3（P＜0.05），表明回歸模型達(dá)到顯著水平，即各因素自身交互作用影響顯著。但是誤差項(xiàng)不顯著，其決定系數(shù)R2=0.853 4，說明該模型與實(shí)際情況接近，即試驗(yàn)誤差小，能充分反映出各因素與響應(yīng)值之間的關(guān)系，因此，可以用該方程對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析。

由于各種因素之間存在著一定的交互作用，A、B、D和AB、AD、BD呈顯著影響（P＜0.05）；而C、AC、BC、CD均呈不顯著交互作用。從模型中回歸方程系數(shù)顯著性檢驗(yàn)可知：二次項(xiàng)A2（P=0.001 4），D2（P= 0.009 4），即A2、D2為極顯著影響（P＜0.01）達(dá)到了極顯著水平；B2（P=0.012 7），C2（P=0.032 7），P值均小于0.05，達(dá)到顯著水平。

2.5 苦蕎皮中總黃酮提取的響應(yīng)面圖分析

圖2 各因素交互作用的等高線圖和響應(yīng)面圖Fig.2 Contour and response surface graphs for the interactive effect between four factors

根據(jù)響應(yīng)方程繪制的響應(yīng)面曲面圖和等高線圖，響應(yīng)面圖形能直觀地反映各因素和它們之間的交互作用對(duì)響應(yīng)值的影響[18-20]。響應(yīng)面圖形是響應(yīng)值Y與試驗(yàn)因素A、B、C、D相對(duì)應(yīng)構(gòu)成的三維空間曲線圖，具體做法是將2 個(gè)因素固定在零水平，然后將剩下的2 個(gè)因素交互作用繪制成響應(yīng)面曲線圖，見圖2。

從各因素之間兩兩相互作用的響應(yīng)面圖形觀察，各因素間有較為強(qiáng)的交互作用，發(fā)現(xiàn)其中曲線走勢(shì)越陡，其影響越顯著；曲線走勢(shì)越平滑，其影響越小。乙醇體積分?jǐn)?shù)與回流時(shí)間、超聲時(shí)間、液料比交互作用較為復(fù)雜，隨著各因素的水平值增加，總黃酮含量會(huì)出現(xiàn)一個(gè)峰值；當(dāng)再次持續(xù)升高各水平值時(shí)，總黃酮含量又會(huì)隨之下降，其坡度相對(duì)平緩，說明提取量可以忍受處理?xiàng)l件的變異，但是不經(jīng)濟(jì)，因此仍選取最高點(diǎn)的提取條件為最佳；回流時(shí)間與超聲時(shí)間和液料比的交互作用，超聲時(shí)間和液料比的交互作用同樣較為復(fù)雜，但在隨著各因素的水平值的變化，總黃酮含量同樣會(huì)出現(xiàn)一個(gè)峰值[21-25]。每個(gè)因素及其之間的交互作用對(duì)總黃酮含量的影響也存在差異，乙醇體積分?jǐn)?shù)、回流時(shí)間、液料比、乙醇體積分?jǐn)?shù)和回流時(shí)間、乙醇體積分?jǐn)?shù)和液料比、回流時(shí)間和液料比對(duì)總黃酮含量的影響呈顯著影響（P＜0.05）；而其余的均呈不顯著交互作用。

本實(shí)驗(yàn)中各因素顯著程度依次為乙醇體積分?jǐn)?shù)（P=0.014 2）＞回流時(shí)間（P=0.032 1）＞液料比（P=0.041 1）＞超聲時(shí)間（P=0.715 7）。使用Design-Expert軟件分析優(yōu)化得到苦蕎皮中總黃酮最佳模擬提取工藝為乙醇體積分?jǐn)?shù)64.72%、液料比14.18∶1（mL/g）、回流時(shí)間1.59 h、超聲時(shí)間28.12 min，在此工藝條件下，苦蕎皮中總黃酮含量為1.49700%?？紤]到實(shí)際操作過程中的局限性，對(duì)影響苦蕎皮中總黃酮含量的的因素加以修正，修正后的工藝條件為乙醇體積分?jǐn)?shù)65%、液料比14∶1（mL/g）、回流時(shí)間1.6 h、超聲時(shí)間28 min，在該工藝條件下，苦蕎皮中總黃酮含量為1.49270%。在該工藝條件下進(jìn)行3 次平行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果分別為1.494 30%、1.498 50%、1.492 90%，取其平均值為1.495 20%，與理論值誤差為0.018 0%，說明響應(yīng)面法優(yōu)化模型能較好地預(yù)測(cè)苦蕎皮中總黃酮含量，所得工藝條件比較可靠。

2.6 HPLC檢測(cè)結(jié)果

在實(shí)驗(yàn)設(shè)定的色譜條件下，將蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品和在優(yōu)化條件下提取的苦蕎皮中總黃酮進(jìn)行HPLC檢測(cè)，其結(jié)果見圖3。

圖3 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品（A）和樣品（B）HPLC檢測(cè)結(jié)果Fig.3 HPLC profiles of rutin standard (A) and sample (B)

由圖3可知，將蘆丁標(biāo)準(zhǔn)系列得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線為色譜峰面積Y，對(duì)進(jìn)樣質(zhì)量濃度進(jìn)行線性回歸分析可得：Y=70.299 0X-8.709 9，R2=0.999 7，0.375～25 μg/mL；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品保留時(shí)間為9.625 min，范圍為9.310～11.032 min。優(yōu)化條件下提取的苦蕎皮中總黃酮在9.457 min時(shí)出峰，峰形對(duì)稱，與標(biāo)樣接近。平均回收率為99.58%、相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.40%，表明HPLC檢測(cè)精密度良好、重復(fù)性較好。

3 結(jié) 論

我國富產(chǎn)苦蕎，但其利于目前仍局限于苦蕎粉、苦蕎掛面、苦蕎茶等食品加工，苦蕎皮主要作為枕心充填物和肥料使用，在對(duì)其總黃酮提取利用方面的研究還比較欠缺，尤其是對(duì)苦蕎皮中總黃酮的響應(yīng)面法提取工藝研究不多，通過本實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)分析，可以尋找到一種最有效的提取工藝，為苦蕎皮資源的開發(fā)和研究提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)[18]。在影響苦蕎皮總黃酮提取工藝的各實(shí)驗(yàn)步驟中，采用乙醇-索氏抽提影響效果最為顯著。在總黃酮提取劑中，從操作難易程度和成本角度考慮，雖然甲醇極性比乙醇大，沸點(diǎn)比乙醇低，但因甲醇有毒且不經(jīng)濟(jì)，丙酮揮發(fā)性較乙醇大，故選用乙醇作為總黃酮提取劑，其提取效果理想且相對(duì)安全。采用超聲波振蕩輔助索氏回流提取法，可使得植物細(xì)胞壁及整個(gè)植物體在瞬間被破碎，有效地加快了總黃酮溶解度，縮短了提取時(shí)間，提高了總黃酮得率，且操作簡單易行。通過響應(yīng)面法優(yōu)化苦蕎皮中總黃酮最佳提取工藝參數(shù)為乙醇體積分?jǐn)?shù)65%、液料比14∶1（mL/g）、回流時(shí)間1.6 h、超聲時(shí)間28 min，通過HPLC檢測(cè)進(jìn)一步驗(yàn)證了響應(yīng)面法提取工藝的可靠性，并對(duì)提取物含量做了進(jìn)一步準(zhǔn)確測(cè)定，在該工藝條件下，苦蕎皮總黃酮含量為1.495 20%。

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Optimization by Response Surface Methodoloy of Ultrasonic Extraction of Total Flavonoids from Tartary Buckwheat Hull

ZHAO Qiang1,2, SUO You-rui1,*, LI Tian-cai1, ZHAO Hai-fu3, DONG Xiao-ning2
(1. Northwest Institute of Plateau Biology, Chinese Academy of Sciences, Xining 810001, China; 2. College of Bioengineering and Technology, Tianshui Normal University, Tianshui 740001, China; 3. College of Veterinary Medicine, Gansu Agricultural University, Lanzhou 730070, China)

The ultrasonic extraction of total flavonoids from tartary buckwheat hull was optimized by response surface analysis with Box-Behnken design, and the flavonoid extract obtained was analyzed by high performance liquid chromatography (HPLC). The results showed that the extraction effi ciency of total fl avonoids was affected in decreasing order by ethanol concentration, liquid-to-solid ratio, refl uxing time and ultrasonication time, for which the optimal conditions were 65%, 14:1 (mL/g), 1.6 h and 28 min, respectively. Under the optimized conditions, the yield of total fl avonoids was 1.495 20%. The HPLC method used in this study was found to be highly repeatable.

tartary buckwheat hull; total flavonoids; response surface methodology; high performance liquid chromatography (HPLC)

TS202.3

A

1002-6630（2014）16-0064-07

10.7506/spkx1002-6630-201416012

2013-09-10

2013年甘肅省科技計(jì)劃資助項(xiàng)目（1308RJZE305）

趙強(qiáng)（1982—），男，副教授，博士后，研究方向?yàn)槲鞅碧厣鷳B(tài)經(jīng)濟(jì)植物資源利用與開發(fā)。

E-mail：zhaoq2000@163.com

*通信作者：索有瑞（1960—），男，研究員，博士，研究方向?yàn)樘烊凰幬锘瘜W(xué)。E-mail：yrsuo@nwipb.cas.cn