姜啟興，宋素梅，夏文水，劉富俊，許艷順，劉冬梅，王海鷗,*

大孔樹(shù)脂分離純化南極磷蝦殼中的蝦青素

姜啟興1，宋素梅1，夏文水1，劉富俊2，許艷順1，劉冬梅2，王海鷗1,*

（1.江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇 無(wú)錫 214122；2.遼寧省大連海洋漁業(yè)集團(tuán)公司，遼寧 大連 116113）

研究AB-8大孔吸附樹(shù)脂對(duì)蝦青素的靜態(tài)、動(dòng)態(tài)吸附效果。結(jié)果表明，AB-8樹(shù)脂對(duì)蝦青素的最大吸附量為476.2 μg/g干樹(shù)脂，乙酸乙酯對(duì)蝦青素的解吸率為98.7%；動(dòng)態(tài)吸附條件為蝦青素上樣質(zhì)量濃度2 μg/mL、上樣流速4BV/h。此條件下，皂化液中蝦青素的回收率為78.9%，純度為92.4%。

南極磷蝦殼；大孔吸附樹(shù)脂；分離純化；蝦青素

近年來(lái)，隨著資源問(wèn)題的日益嚴(yán)峻，遠(yuǎn)洋資源的開(kāi)發(fā)利用成為各國(guó)爭(zhēng)相研究的課題。據(jù)估計(jì)，南極磷蝦的生物量為6.5～10.0億 t，幾乎遍布整個(gè)南極海域，資源極其豐富[1-4]。而蝦青素是南極磷蝦殼中含量比較豐富的活性成分，具有超強(qiáng)的抗氧化活性以及顯著的著色能力，在食品、醫(yī)藥、化妝品和飼料等行業(yè)具有重要作用[5-12]。目前，國(guó)內(nèi)研究更多關(guān)注南極磷蝦肉中蛋白、脂溶性成分等的分離和應(yīng)用[13]，國(guó)外則側(cè)重于對(duì)酶、脂肪酸等的分離純化及其性質(zhì)分析[14-16]，對(duì)南極磷蝦殼資源的研究較少。而蝦殼大多作為廢棄物丟棄，亟需有效的開(kāi)發(fā)利用。

目前，大孔吸附樹(shù)脂不僅廣泛應(yīng)用于水溶性總類胡蘿卜素的吸附和分離，如蘆丁、綠原酸、牛蒡以及苷類物質(zhì)[17-19]，還越來(lái)越多地應(yīng)用于非水體系總類胡蘿卜素的吸附和分離，如葛根素、芹黃素和香豆素等[20-22]。然而，有關(guān)大孔吸附樹(shù)脂分離純化蝦青素的研究較少。本實(shí)驗(yàn)在探索大孔樹(shù)脂對(duì)蝦青素吸附條件的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步分析了大孔樹(shù)脂分離純化皂化液中游離蝦青素的效果。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

南極磷蝦由遼寧省大連海洋漁業(yè)集團(tuán)公司提供，蝦殼經(jīng)有機(jī)溶劑提取、脫溶得色素油，經(jīng)NaOH皂化后得皂化液；蝦青素標(biāo)準(zhǔn)樣品（純度≥97.1%） 德國(guó)Dr.Ehrenstorferg公司；皂化液（游離蝦青素含量為55.75 μg/mL） 實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)配；丙酮、乙醇、正己烷、乙酸乙酯（均為分析純），二氯甲烷、甲醇、乙腈（均為色譜純） 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；AB-8、S-8、D3520樹(shù)脂 南開(kāi)合成公司；LX-16、LX-10G、LX-17樹(shù)脂 西安藍(lán)曉科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

1525高效液相色譜儀、二極管陣列檢測(cè)器、色譜柱Spherisorb?Silica（4.6 mm×250 mm，5 μm） 美國(guó)Waters公司；AB104-N電子天平 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 大孔吸附樹(shù)脂的預(yù)處理

取樹(shù)脂，用無(wú)水乙醇浸泡24 h，醇洗至流出液與水1∶5（V/V）不混濁，再用去離子水沖洗至無(wú)醇味；然后用5% HCl溶液浸泡2～4 h，用去離子水沖洗至中性；最后用2% NaOH溶液浸泡2～4 h，用去離子水沖洗至中性。

1.3.2 大孔樹(shù)脂對(duì)蝦青素的吸附和解吸效果

稱取預(yù)處理后的樹(shù)脂AB-8、S-8、D3520、LX-17、LX-10G、LX-16各5.0 g（干質(zhì)量1.0 g左右，下同）于具塞錐形瓶中，分別加入4 μg/mL的蝦青素乙醇溶液（蝦青素標(biāo)樣溶于乙醇，下同）50 mL，搖床振蕩4 h（30 ℃、70 r/min），用絹布過(guò)濾，濾液于472 nm（光譜掃描所得最大吸收波長(zhǎng)）處測(cè)定吸光度，向樹(shù)脂中加入50 mL丙酮，恒溫水浴振蕩4 h（30 ℃、70 r/min），于472 nm波長(zhǎng)處測(cè)定解吸液的吸光度。計(jì)算樹(shù)脂對(duì)蝦青素的吸附率、解吸率和吸附量。

1.3.3 樹(shù)脂靜態(tài)吸附動(dòng)力學(xué)曲線

取AB-8、LX-10G和LX-16樹(shù)脂各5.0 g于具塞錐形瓶中，加入4 μg/mL的蝦青素乙醇溶液50 mL，恒溫水浴振蕩（30 ℃、70 r/min），每20 min于472 nm波長(zhǎng)處測(cè)定總類胡蘿卜素液的吸光度，計(jì)算樹(shù)脂對(duì)蝦青素的吸附量，直至吸附平衡。

1.3.4 樹(shù)脂靜態(tài)吸附等溫線

稱取AB-8樹(shù)脂 5.0 g于具塞錐形瓶中，分別加入2、4、6、8、10 μg/mL的蝦青素乙醇溶液10 mL，于25 ℃恒溫水浴振蕩5 h，吸附平衡后于472 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。

1.3.5 不同溶劑對(duì)蝦青素的解吸效果

稱取AB-8樹(shù)脂5.0 g于具塞三角瓶中，加入4 μg/mL的蝦青素乙醇溶液10 mL，于25 ℃恒溫水浴振蕩3 h，達(dá)到吸附平衡。然后分別用10 mL乙醇、丙酮、正己烷、乙酸乙酯進(jìn)行解吸，用氮?dú)獯蹈扇軇掖紡?fù)溶，于472 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，計(jì)算蝦青素的解吸率。

1.3.6 蝦青素上樣質(zhì)量濃度對(duì)AB-8動(dòng)態(tài)吸附的影響

稱取AB-8樹(shù)脂 5.0 g，濕法裝柱（D10 mm× 200 mm），樹(shù)脂高度13 cm，柱床體積10 mL（1 BV），用恒流泵以2 BV/h的流速分別將1、2、4 μg/mL的蝦青素乙醇溶液泵入玻璃柱內(nèi)，每10 mL即1 BV收集1管，于472 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，計(jì)算流出液質(zhì)量濃度。以流出液體積為橫坐標(biāo)，流出液中蝦青素質(zhì)量濃度為縱坐標(biāo)，繪制動(dòng)態(tài)吸附曲線。

1.3.7 上樣流速對(duì)AB-8樹(shù)脂動(dòng)態(tài)吸附的影響

稱取AB-8樹(shù)脂5.0 g于具塞三角瓶中，加入4 μg/mL的蝦青素乙醇溶液10 mL，于25 ℃恒溫水浴振蕩3 h，達(dá)到吸附平衡。然后分別用10 mL乙醇、丙酮、正己烷、乙酸乙酯進(jìn)行解吸，用氮?dú)獯蹈扇軇?，乙醇?fù)溶，于472 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，計(jì)算蝦青素的解吸率。

1.3.8 AB-8樹(shù)脂再生對(duì)蝦青素吸附率的影響

稱取5.0 g經(jīng)過(guò)預(yù)處理的AB-8樹(shù)脂于具塞三角瓶中，加入4 μg/mL的蝦青素乙醇溶液50 mL，按照吸附-解吸-再生的順序重復(fù)操作，測(cè)定蝦青素溶液吸附前后的吸光度，分析吸附率的變化。其中，吸附條件：恒溫水浴振蕩（30 ℃、70 r/min），4 h；解吸條件：恒溫水浴振蕩（30 ℃、70 r/min），10 mL乙酸乙酯解吸2 h；再生方法同1.3.1節(jié)方法。

1.3.9 AB-8樹(shù)脂分離純化皂化液中的蝦青素

稱取AB-8樹(shù)脂 5.0g，濕法裝柱（D10 mm× 200 mm），樹(shù)脂高度13 cm，柱床體積10 mL（1 BV）。制備皂化液 7.5 mL，皂化12 h時(shí)，用無(wú)水乙醇稀釋皂化液中的蝦青素至2 μg/mL。用恒流泵以4 BV/h的流速將稀釋后的皂化液泵入AB-8層析柱內(nèi)，每10 mL收集1管至吸附平衡。接著用H2O沖洗柱子至流出液的pH值為中性，然后無(wú)水乙醇沖洗除去H2O，最后用乙酸乙酯解吸。記錄吸附平衡時(shí)皂化液的體積、蝦青素吸附量以及解吸液中蝦青素的含量。濃縮除去乙酸乙酯，用高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）測(cè)定游離蝦青素的含量，根據(jù)蝦青素標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行計(jì)算，即S=123.15C-91.77，R2=0.996 4，式中：S為峰面積/（mAU·s）；C為蝦青素質(zhì)量濃度/（μg/mL）。

1.3.10 HPLC的色譜條件

色譜柱：Ecosil反相C18柱（4.6 mm×250 mm）；流動(dòng)相：包括A和B，其中A為二氯甲烷-甲醇-乙腈-水（5.0∶85.0∶5.5∶4.5，V/V），B為二氯甲烷-甲醇-乙腈-水（22.0∶28.0∶45.5∶4.5，V/V）；梯度洗脫：0%的B洗脫8 min，0%～100%的B洗脫24 min；流速0.8 mL/min；柱溫30 ℃；檢測(cè)器：二極管陣列檢測(cè)器（diode array detector，DAD）；進(jìn)樣量5 μL；檢測(cè)波長(zhǎng)476 nm（DAD掃描結(jié)果）。

1.4 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 18軟件；數(shù)據(jù)繪圖采用Origin 8.0軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同大孔樹(shù)脂對(duì)蝦青素的分離效果

2.1.1 樹(shù)脂的基本指標(biāo)及吸附解吸效果

根據(jù)蝦青素分子中含有共軛雙鍵和苯環(huán)的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，選擇常用的S-8、AB-8、D3520，以及LX系列樹(shù)脂，測(cè)定各樹(shù)脂的基本參數(shù)及吸附、解吸性能，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 樹(shù)脂的性質(zhì)及吸附解吸效果Table 1 Physical properties and absorption capacities of macroporous ressiinnss

從表1可以看出，AB-8、LX-10G和LX-16等弱極性或非極性樹(shù)脂的吸附率均大于85%，而強(qiáng)極性樹(shù)脂S-8、LX-17的吸附率分別為57.8%和25.8%。這主要由于蝦青素是弱極性分子，更容易與極性相似的樹(shù)脂大分子形成π-π共軛，成為樹(shù)脂吸附蝦青素的主要作用力。AB-8、LX-10G和LX-16的解吸率分別為93.4%、92.1%和84.3%，無(wú)明顯差異；吸附量分別為120.9、109.9 μg/g和92.1 μg/g干樹(shù)脂。因此，選擇AB-8、LX-10G和LX-16進(jìn)一步分析。

2.1.2 樹(shù)脂靜態(tài)吸附動(dòng)力學(xué)曲線

圖1 AB-8、LX-10G和LX-16樹(shù)脂吸附蝦青素的動(dòng)力學(xué)曲線Fig.1 Adsorption kinetics of astaxanthin on AB-8, LX-10G and LX-16

由圖1可見(jiàn)，在起始的60 min內(nèi)，3 種樹(shù)脂對(duì)蝦青素的吸附量快速增大，而后增速減緩，可能由于蝦青素向樹(shù)脂微孔中擴(kuò)散時(shí)存在傳質(zhì)阻力。3種樹(shù)脂都在約180 min時(shí)達(dá)到吸附平衡。吸附時(shí)間相同時(shí)，AB-8樹(shù)脂的吸附量總是高于LX-10G和LX-16。因此選擇AB-8樹(shù)脂為后序?qū)嶒?yàn)的吸附樹(shù)脂。

2.2 AB-8樹(shù)脂對(duì)蝦青素的靜態(tài)吸附和解吸效果

2.2.1 等溫吸附曲線

實(shí)驗(yàn)表明，AB-8樹(shù)脂對(duì)蝦青素的吸附量隨蝦青素質(zhì)量濃度的增加而增加，線性關(guān)系明顯。因此，考慮用Langmuir方程來(lái)表示吸附過(guò)程：

式中：Qe為平衡吸附量/（μg/g干樹(shù)脂）；Qm為最大吸附量/（μg/g干樹(shù)脂）；Ce為吸附平衡時(shí)蝦青素溶液質(zhì)量濃度/（μg/mL）；K為經(jīng)驗(yàn)常數(shù)。

圖2 AB-8樹(shù)脂的等溫吸附線Fig.2 Adsorption isotherm of AB-8 resin

如圖2所示，AB-8樹(shù)脂Langmuir模型的相關(guān)系數(shù)高達(dá)0.9973，說(shuō)明吸附過(guò)程屬于單分子層吸附。經(jīng)計(jì)算，最大吸附量為476.2 μg/g干樹(shù)脂。

2.2.2 不同溶劑對(duì)蝦青素的解吸效果

表2 不同溶劑對(duì)蝦青素的解吸率Table 2 Desorption rates of astaxantinon with different solvents

由表2可以看出，乙醇對(duì)蝦青素的解吸率最低，僅為10.3%，而丙酮、正己烷、乙酸乙酯的解吸率都在90%以上，且乙酸乙酯的解吸率最高，為98.7%。這可能由于乙醇為強(qiáng)極性有機(jī)溶劑，而蝦青素為弱極性化合物，根據(jù)相似相溶的原理，當(dāng)蝦青素吸附于樹(shù)脂上時(shí)，乙醇對(duì)其解吸能力低于中等極性或非極性溶劑。

2.3 AB-8樹(shù)脂對(duì)蝦青素的動(dòng)態(tài)吸附效果

2.3.1 蝦青素上樣質(zhì)量濃度對(duì)動(dòng)態(tài)吸附的影響

圖3 蝦青素上樣質(zhì)量濃度對(duì)AB-8樹(shù)脂動(dòng)態(tài)吸附曲線的影響Fig.3 Effect of astaxanthin concentration on dynamic adsorption curve of AB-8 resin

由圖3可知，隨著上樣量的增加，流出液中蝦青素的含量逐漸增加。蝦青素質(zhì)量濃度越大，初始階段的吸附速率越大，泄漏點(diǎn)也逐漸提前，如1、2、4 μg/mL的泄漏點(diǎn)分別為10、8、6 BV。質(zhì)量濃度低，耗時(shí)較長(zhǎng)，質(zhì)量濃度過(guò)高會(huì)增大傳質(zhì)阻力，能耗較大。因此，結(jié)合經(jīng)濟(jì)效益，選擇蝦青素質(zhì)量濃度為2 μg/mL。蝦青素質(zhì)量濃度2 μg/mL，流出液體積24 BV時(shí)，流出液中蝦青素的質(zhì)量濃度與初始質(zhì)量濃度幾乎相等，即達(dá)到吸附平衡。

2.3.2 上樣流速對(duì)動(dòng)態(tài)吸附的影響

表3 上樣流速對(duì)吸附效果的影響Table 3 Effect of flow rate on adsorption efficiency

由表3可知，隨著流速的增大，蝦青素的泄漏體積逐漸提前。當(dāng)流速達(dá)到6 BV/h時(shí)，蝦青素收集量?jī)H為4.0 BV時(shí)即發(fā)生泄漏；而流速為1.0 BV/h時(shí)，收集11 BV的蝦青素時(shí)才發(fā)生泄漏。這可能由于流速過(guò)大時(shí)，溶質(zhì)分子尚未被樹(shù)脂吸附就提前發(fā)生泄漏，樣品流失較多；然而流速過(guò)小，吸附時(shí)間延長(zhǎng)使得樣液中蝦青素過(guò)長(zhǎng)時(shí)間的與樹(shù)脂結(jié)合，可能導(dǎo)致蝦青素的降解，回收率下降，而且長(zhǎng)時(shí)間的吸附使得樹(shù)脂再生困難。因此選擇上樣流速為4 BV/h。

2.3.3 AB-8樹(shù)脂再生對(duì)蝦青素吸附率的影響

圖4 AB-8樹(shù)脂再生對(duì)蝦青素吸附率的影響Fig.4 Effect of AB-8 resin regeneration on adsorption rate of astaxanthin

由圖4可知，AB-8樹(shù)脂經(jīng)過(guò)15 次吸附-解吸-再生的重復(fù)操作之后，對(duì)蝦青素的吸附能力略有降低，僅下降了3.28%，因此，AB-8樹(shù)脂用于非水介質(zhì)中蝦青素的分離純化將十分經(jīng)濟(jì)有效，可應(yīng)用于蝦青素的規(guī)?；a(chǎn)。

2.4 AB-8樹(shù)脂分離純化皂化液中的蝦青素

表4 AB-8樹(shù)脂對(duì)皂化液中蝦青素的吸附和解吸Table 4 Adsorption and desorption of astaxanthin in saponification solution on AB-8 resin

按表4的流程，用AB-8吸附皂化液中的蝦青素；通過(guò)H2O沖洗除去皂化反應(yīng)生成的鹽類物質(zhì)；接著用乙醇沖洗除去H2O（由表2可知，乙醇解吸率低，為除去H2O，同時(shí)減少蝦青素的損失，選擇乙醇除雜溶劑），最后用乙酸乙酯解吸，測(cè)定吸附和解吸過(guò)程的中各項(xiàng)指標(biāo)。

如表4所示，將稀釋至2 μg/mL的皂化液以4 BV/h的流速泵入柱內(nèi)，21 BV即210 mL時(shí)吸附游離蝦青素的總量為345.8 μg。首先用H2O以4 BV/h的流速洗脫，用精密pH試紙檢測(cè)洗脫液的pH值，約3 BV即可使pH值由9.0降至7.0，接著用約1 BV的無(wú)水乙醇沖洗柱內(nèi)的H2O，最后用乙酸乙酯洗脫，約2 BV，得到蝦青素溶液。通過(guò)濃縮除去乙酸乙酯，用HPLC測(cè)得蝦青素330.0 μg，即一次吸附的回收率為78.9%。通過(guò)HPLC檢測(cè)可知，純度為92.4%。H2O沖洗和乙醇沖洗過(guò)程中，將樹(shù)脂表面吸附的部分蝦青素沖洗下來(lái)，造成了回收率的下降。

3 結(jié) 論

在比較S-8、AB-8、D3520、LX-17、LX-10G和LX-16樹(shù)脂對(duì)蝦青素標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸附和解吸效果的基礎(chǔ)上，選擇AB-8為吸附樹(shù)脂。AB-8對(duì)蝦青素的最大吸附量為476.2 μg/g干樹(shù)脂，選擇乙酸乙酯作為解吸溶劑；動(dòng)態(tài)吸附條件為蝦青素質(zhì)量濃度2 μg/mL、上樣流速4 BV/h。此條件下，皂化液中的蝦青素回收率為78.9%，純度為92.4%。

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Separation and Purification of Astaxanth from Antarctic Krill Shells by Macroporous Resin

JIANG Qi-xing1, SONG Su-mei1, XIA Wen-shui1, LIU Fu-jun2, XU Yan-shun1, LIU Dong-mei2, WANG Hai-ou1,*
(1. School of Food Science and Technology, Jiangnan University, Wuxi 214122, China; 2. Liaoning Province Dalian Ocean Fishery Group, Dalian 116113, China)

In the present study, the static and dynamic adsorption capacities of AB-8 macroporous resins for astaxanthin from Antarctic krill shells were evaluated. The results showed that the maximum quantity of astaxanthin adsorbed was 476.2 μg per gram of dry AB-8. Ethyl acetate was selected as the elution solvent with a desorption rate of 98.7%. The dynamic adsorption conditions were optimized as 2 μg/mL and 4 BV/h for astaxanthin concentration and flow rate, respectively. Under the optimal condition, the astaxanthin in saponification solution was purified with recovery rate of 78.9% and purity of 92.4%.

Antarctic krill shells; macroporous resin; separation and purification; astaxanthin

TS254.9

A

1002-6630（2014）16-0001-05

10.7506/spkx1002-6630-201416001

2013-08-05

國(guó)家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃（863計(jì)劃）項(xiàng)目（2011AA090801）

姜啟興（1977—），男，副教授，博士，研究方向?yàn)槭称芳庸づc保藏。E-mail：qixingj@163.com

*通信作者：王海鷗（1956—），女，副教授，碩士，研究方向?yàn)槭称芳庸づc保藏。E-mail：howang@126.com