郝菊秋 董新榮 高德臣

鴨疫里氏桿菌病的診斷與藥敏試驗

郝菊秋①董新榮②高德臣①

（①遼寧職業(yè)學(xué)院 遼寧 鐵嶺 112099 ②山東濱州博萊威生物技術(shù)有限公司）

鴨疫里氏桿菌病是由鴨疫里氏桿菌(Riemerella anatipestifer，RA)引起雛多種禽類感染發(fā)病的病原，對1~7周齡的鴨危害最大，呈急性或慢性敗血癥。目前該病廣泛分布于我國各地區(qū)，幾乎所有的商品鴨場都有不同程度的感染，成為危害養(yǎng)鴨業(yè)最為嚴(yán)重的傳染病之一。2013年6月，遼寧省某鴨養(yǎng)殖場共有25日齡雛鴨280羽，有90余羽鴨患病，病死率可達(dá)45%左右。養(yǎng)殖場主送檢病鴨3只，剖檢懷疑為鴨疫里氏桿菌病，進(jìn)行了實驗室的診斷，并進(jìn)行了藥敏試驗，確診為鴨疫里氏桿菌病。現(xiàn)報告如下。

1 病理剖檢變化

全身漿膜以及肝臟表面、心包膜、氣囊有纖維素性滲出物附著，心包膜增厚，心臟、脾臟腫大，肝質(zhì)脆，腫脹、呈棕紅色或土黃色。腦膜出血、充血、腦積液增多、水腫。關(guān)節(jié)液增多，單側(cè)或雙側(cè)跗關(guān)節(jié)水腫。

2 細(xì)菌的分離培養(yǎng)與純化

（1）取3只病死鴨剖檢后，無菌取腦部組織分別接種血平板培養(yǎng)基和麥康凱養(yǎng)基板，麥康凱平板培養(yǎng)基直接放入37℃溫箱培養(yǎng)，血平板培養(yǎng)基放入?yún)捬豕拗?7℃溫箱培養(yǎng)。過夜后觀察。觀察結(jié)果，3份病料的血平板培養(yǎng)基中長出均一透明菌落，麥康凱平板中沒長出菌落。將培養(yǎng)好血平板取出，挑取單個菌落，革蘭氏染色后鏡檢觀察。結(jié)果均為革蘭氏陰性小桿菌。將鑒定為革蘭氏陰性小桿菌的血平板，挑選單個菌落，繼續(xù)劃線培養(yǎng)純化，收集菌液保存?zhèn)溆?。?）無菌取肝臟組織，分別接種麥康凱平板培養(yǎng)基，放入37℃溫箱培養(yǎng)，過夜。觀察結(jié)果，麥康凱平板培養(yǎng)基中沒長出菌落。分離培養(yǎng)的細(xì)菌經(jīng)鑒定符合鴨疫里氏桿菌的培養(yǎng)特性和染色特性。

3 PCR鑒定

將合成的RA特異性引物，直接加入菌液作為模板進(jìn)行PCR鑒定。引物為P1：5'-ATGGTTCAGAGACTAAGC G-3'，P2：5'-ACGACTTAGCCCTAGTTACT-3'，擴(kuò)增片段長度為643bp。引物由寶生物工程(大連)有限公司合成。PCR反應(yīng)體系總體積為25μL：10×buffer2.5μL，MgCl22μL，dNTPs0.5μL，上、下游引物各0.25μL，rTaq酶0.25μL，DNA模板2μL，加水至25μL。PCR反應(yīng)程序：95℃變性8min；94℃變性45s，61℃退火30s，72℃延伸1min，30個循環(huán)后；72℃終延伸8min。將PCR產(chǎn)物經(jīng)0.8%的瓊脂糖凝膠電泳分析。經(jīng)凝膠成像系統(tǒng)分析結(jié)果可見3樣品均擴(kuò)增出了643bp的特異性條帶(見圖1)。

圖1 PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖譜

M為DL2000 Marker；1~3為3份細(xì)菌培養(yǎng)物的PCR產(chǎn)物；4為空白對照

4 生化試驗

取分離的細(xì)菌接入蔗糖、乳糖、葡萄糖、半乳糖、果糖、木糖、山梨醇、甘露醇、甘露糖、麥芽糖生化反應(yīng)管中，過夜觀察結(jié)果。所有反應(yīng)均為陰性，符合鴨疫里氏桿菌生化特性(見表1)。

表1 生化試驗結(jié)果

5 玻片凝集試驗

將鑒定為鴨疫里氏桿菌的病料進(jìn)行玻片凝集試驗，取純化好的細(xì)菌，稀釋在生理鹽水中備用。分別吸取鴨疫里氏桿菌1、2、3、8、10型5種血清型各100ul滴到玻片上，再取稀釋好的菌液100ul分別與5種血清型混勻，室溫下靜止放置10min后觀察。結(jié)果均為血清型1型出現(xiàn)凝集反應(yīng)，其他血清型未出現(xiàn)凝集。根據(jù)結(jié)果可以確定為此次分離的鴨疫里氏桿菌為血清型1型。

6 藥敏試驗

表2 藥敏試驗結(jié)果 （mm）

取純培養(yǎng)細(xì)菌涂布血瓊脂，均勻貼上藥敏紙片，每個平皿5個藥敏片，37℃厭氧培養(yǎng)24h，讀取其抑菌圈計算平均值。判斷標(biāo)準(zhǔn)為:抑菌圈直徑小于10mm的為不敏感，10~15mm的為中度敏感，≥15mm的為高度敏感。根據(jù)表2可以看出對泰樂菌素、乙酰螺旋霉素、環(huán)丙沙星、新霉素、呋喃妥因、紅霉素、阿莫西林、頭孢噻肟敏感。對慶大霉素、萬古霉素中敏。

7 結(jié)論

通過從疑似患鴨疫里氏桿菌病鴨場進(jìn)行病料的分離培養(yǎng)、染色鏡檢、PCR鑒定、生化特性鑒定和血清型鑒定試驗，確定為10型鴨疫里氏桿菌感染。

通過藥物敏感性試驗進(jìn)行藥物篩選，其中頭孢噻肟、紅霉素最為敏感，對萬古霉素和慶大霉素中敏。因此可根據(jù)藥敏試驗選擇敏感性藥物進(jìn)行治療。

鴨疫里氏桿菌感染造成鴨養(yǎng)殖場巨大的經(jīng)濟(jì)損。我國各地流行的鴨疫里氏桿菌血清型多，且各地流行的血清型之間無交叉保護(hù)性，故本病的發(fā)生難于控制和預(yù)防，要預(yù)防鴨疫里氏桿菌病重要的是要加強(qiáng)飼養(yǎng)管理，分群飼養(yǎng)，飼喂?fàn)I養(yǎng)豐富的飼料和注意消毒以提高雛鴨的抗病能力。本病發(fā)生后最好進(jìn)行藥物敏感性試驗采用敏感性藥物進(jìn)行治療，以達(dá)到較好的治療效果，并要注意防止耐藥菌株的出現(xiàn)。

（2014–04–07）

S858.32

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1007-1733(2014)08-0037-02