(1.海南醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室，海南?？?71199;2.海南大學(xué)農(nóng)學(xué)院，海南?？?70228;3.中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所分析測試中心，海南?？?71101)

李崇奇1，2，3，周 鵬2，3* ，蔡望偉1*

桉屬(Eucalyptus)植物統(tǒng)稱桉樹，分類學(xué)上屬桃金娘科(Myrtaceae)，原產(chǎn)于澳大利亞。由于其具有生長速度快、適應(yīng)性強(qiáng)、材質(zhì)優(yōu)良等特點，與松樹和楊樹并稱為世界3大速生樹種之一。我國從1890年開始引種栽培桉樹，目前栽培面積已達(dá)360萬hm2，占我國人工林面積的5.8%，占我國木材產(chǎn)量的20%［1］。目前桉樹廣泛用于房屋建筑、人造板、造紙等領(lǐng)域，同時也是重要的潛在能源植物之一。近年來有研究發(fā)現(xiàn)，桉樹種植對礦山生態(tài)環(huán)境的恢復(fù)具有積極意義［2］。桉樹具有重要的經(jīng)濟(jì)價值，也是分子遺傳育種改良的重要目標(biāo)植物之一。識別影響桉樹生長速率和其他品質(zhì)相關(guān)的基因?qū)﹁駱渖踔疗渌帜緲浞N的遺傳品質(zhì)改良具有重要的意義。Lacombe等［3］首次克隆表達(dá)了岡尼桉(Eucalyptus gunnii)的木質(zhì)素合成關(guān)鍵酶肉桂酰CoA還原酶(cinnamyl-CoA reductase，CCR)。Paux 等［4］應(yīng)用消減雜交技術(shù)在岡尼桉中識別224個與木質(zhì)形成相關(guān)的基因，其中1/3的基因與細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和細(xì)胞壁的合成相關(guān)。Ranik和Myburg［5］克隆了6個巨桉(Eucalyptus grandis)全長的纖維素合酶基因，發(fā)現(xiàn)纖維素合酶1、2和3主要參與植物次生壁的形成，而纖維素合酶4和5則參與初生壁的合成。Rengel等［6］發(fā)現(xiàn)岡尼桉中與木質(zhì)形成相關(guān)的基因主要是與植物初生壁和次生壁形成相關(guān)基因及部分轉(zhuǎn)錄因子序列。近年來對桉樹轉(zhuǎn)錄圖譜的研究［7-8］更是為從全基因組水平識別和篩選木質(zhì)相關(guān)基因提供了理論基礎(chǔ)。然而物種內(nèi)部很多基因尤其是一些轉(zhuǎn)錄因子都受到miRNA的調(diào)控，對人類的研究發(fā)現(xiàn)30%的基因都受到miRNA的調(diào)控［9］。miRNA被認(rèn)為參與了植物器官的發(fā)育、代謝的調(diào)節(jié)和抗逆反應(yīng)等一系列復(fù)雜生物學(xué)過程。筆者擬應(yīng)用miRtour在線分析工具(http://bio2server.bioinfo.uni-plovdiv.bg/miRTour/)［10］對岡尼桉(Eucalyptus gunnii)、粗皮桉(Eucalyptus pellita)、藍(lán)桉(Eucalyptus globulus)、垂尾桉(Eucalyptus urophylla)和赤桉(Eucalyptus camaldulensis)的表達(dá)序列標(biāo)簽(expressed sequence tag，EST)進(jìn)行分析，然后進(jìn)行miRNA和靶基因預(yù)測，識別與桉樹品質(zhì)相關(guān)或疾病相關(guān)的miRNA和其調(diào)控的靶基因，以期為未來桉樹以及其它林木分子遺傳育種奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 從美國國家生物技術(shù)信息中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI)的網(wǎng)站(www.ncbi.nlm.nih.gov)的EST數(shù)據(jù)庫中分別下載岡尼桉、粗皮桉、藍(lán)桉、垂尾桉和赤桉的EST序列，分別為19 841、8 871、28 949、7 440條和58 584條。另外分別從rfam(http://rfam.sanger.ac.uk/)網(wǎng)站和pfam(http://pfam.sanger.ac.uk/)網(wǎng)站下載非編碼RNA數(shù)據(jù)庫和蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫。

1.2 試驗設(shè)計 分別將5中桉屬植物的EST序列分批遞交到miRtour在線界面上傳后參數(shù)設(shè)置如下，與已知miRNA序列能夠比對的最小數(shù)量(Minimum number of known miRNAs to be aligned)設(shè)置為1，miRNA序列與其互補(bǔ)序列的不配對數(shù)(Maximum unpaired nt in miR/miR*)設(shè)置為6，其他參數(shù)默認(rèn)。下載分析結(jié)果可以得到miRNA序列、前體序列、最小自由能、最小自由能指數(shù)等相關(guān)參數(shù)。然后應(yīng)用blast-2.2.27+軟件中的blastn程序?qū)㈩A(yù)測到的miRNA前體序列與rfam數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，應(yīng)用blastx程序與pfam數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，將evalue參數(shù)設(shè)置為1e-6，其他參數(shù)默認(rèn)，去除非miRNA序列，即為預(yù)測到的miRNA序列前體，相應(yīng)的miRNA序列即為桉樹miRNA序列。將預(yù)測到的成熟桉樹miRNA序列以fasta格式上傳到psrobot網(wǎng)站(http://omicslab.genetics.ac.cn/psRobot/index.php)［11］，應(yīng)用靶基因預(yù)測在線工具進(jìn)行預(yù)測，選擇巨桉轉(zhuǎn)錄組作為對照，參數(shù)選擇嚴(yán)格模式，同時將分值(score)設(shè)置為2.5。

1.3 數(shù)據(jù)分析 應(yīng)用bioedit統(tǒng)計miRNA及其前體的序列長度，然后統(tǒng)計miRNA序列每個位點的堿基組成，對其堿基偏倚進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 m iRNA預(yù)測 5種桉屬所有EST序列經(jīng)過miRtour分析發(fā)現(xiàn)有30條序列具有莖環(huán)結(jié)構(gòu)，分別與rfam和pfam數(shù)據(jù)庫比對后發(fā)現(xiàn)1條rRNA序列和3條蛋白質(zhì)序列。共預(yù)測到26條miRNA前體序列和19條不同的成熟miRNA序列(表1)。表1中 eca-mir857和 egu-mir857相同，eca-mir164、eglmir164和eur-mir164相同，eca-mir167b和egl-mir167b相同，eca-mir167a和egl-mir167a，但由于在不同物種中發(fā)現(xiàn)，所以共命名為24個miRNA。赤桉中發(fā)現(xiàn)miRNA序列最多，為12條;而粗皮桉和垂尾桉分別僅發(fā)現(xiàn)1條成熟miRNA序。前體序列最小自由能為-19.6～-109.6 kcal/mol，最小自由能指數(shù)為0.71～0.94，GC含量為14.0% ～67.9%。

表1 新預(yù)測的桉樹m iRNA及其前體序列相關(guān)參數(shù)

2.2 m iRNA和前體的堿基組成特征 預(yù)測的miRNA長度為18～24 bp，其中長度為21個堿基的miRNA數(shù)量最多，達(dá)12個。miRNA序列中嘌呤與嘧啶的比值為1∶1.26，其堿基組成 A∶G∶C∶U 為1∶1.05∶1.15∶1.43，尿嘧啶比例明顯偏高。同時發(fā)現(xiàn)A、G、C、U出現(xiàn)頻率最高的位置分別為5’端第11堿基、第13堿基、第19堿基、第1堿基，其頻率分別為52.6%、42.1%、61.1%和52.6%。miRNA前體長度為91～221 bp，平均長度為173 bp，嘌呤與嘧啶的比值為1.00∶1.03，堿基組成 A∶G∶C∶U 為1.00∶1.15∶0.96∶1.25，尿嘧啶的比例最高。

2.3 m iRNA靶基因預(yù)測 19個miRNA中有11個預(yù)測到了靶基因，共發(fā)現(xiàn)104條編碼序列受到miRNA調(diào)控，去除不能夠被注釋的序列后共發(fā)現(xiàn)87條靶基因序列(表2)。其中32條序列為與疾病抗性相關(guān)基因，13條序列為轉(zhuǎn)錄因子，16條序列為酶。靶基因數(shù)目最多的是mir482，發(fā)現(xiàn)40個靶基因。靶基因中與木質(zhì)形成相關(guān)的基因主要為調(diào)節(jié)MYB轉(zhuǎn)錄因子、NAC轉(zhuǎn)錄因子和過氧化酶，相應(yīng)調(diào)控木質(zhì)形成的miRNA主要為mir828、mir902和mir477。

3 結(jié)論與討論

EST序列是從一個隨機(jī)選擇的cDNA克隆進(jìn)行5’端和3’端單一次測序獲得的短的cDNA部分序列，目前被廣泛應(yīng)用于植物miRNA預(yù)測研究;尤其是對于缺少基因組信息的物種來說，EST序列是識別miRNA前體序列的重要途徑。Zhang等先后應(yīng)用EST序列分別識別了60個物種的338條miRNA序列［12］和71個物種的481條miRNA 序列［13］。試驗經(jīng)過對桉屬5種植物的123 685條序列進(jìn)行分析，識別了19條不同的miRNA序列，識別效率與多數(shù)應(yīng)用EST序列預(yù)測miRNA的研究一致。潘玉欣等對花生(Arachis hypogaea)的研究發(fā)現(xiàn)13條miRNA序列［14］;郭強(qiáng)等對馬鈴薯的研究發(fā)現(xiàn)22條miRNA序列［15］。然而目前在mirbase數(shù)據(jù)庫(www.mirbase.org)中超過200條成熟microRNA序列的植物已經(jīng)有13種，miRNA序列最多的蒺藜苜蓿(Medicago truncatula)有756條，因而應(yīng)用EST識別植物miRNA的效率相對是較低的。這主要可能是由于植物的miRNA序列的初級轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物很快在DCL等蛋白的作用下加工為為成熟的miRNA序列，從而導(dǎo)致前體序列存在時間較短有關(guān)。因而桉樹的miRNA還有待于進(jìn)一步的生物信息學(xué)挖掘，或通過芯片技術(shù)、基因克隆和小RNA測序等相關(guān)實驗技術(shù)進(jìn)行識別。

擬南芥和水稻的研究發(fā)現(xiàn)其miRNA序列的5’端第1堿基尿嘧啶比例最高［13］，而在大豆和亞麻的研究中也發(fā)現(xiàn)在第1堿基和第19堿基分別出現(xiàn)頻率最高的為尿嘧啶和胞嘧啶［16-17］。試驗也發(fā)現(xiàn)桉樹miRNA序列的5’端第1堿基尿嘧啶出現(xiàn)頻率和第19堿基胞嘧啶出現(xiàn)頻率都超過了50%。目前認(rèn)為miRNA 5’端堿基對于其與選擇不同Argonaute蛋白結(jié)合形成RISC復(fù)合物是至關(guān)重要的［18］。

桉樹是我國木材產(chǎn)量的重要來源之一，篩選與桉樹木質(zhì)形成相關(guān)的基因具有重要意義。目前認(rèn)為影響植物木質(zhì)形成的轉(zhuǎn)錄因子主要包括ARF家族、HD-ZIPIII家族、KAN家族、MYB家族和NAC家族［19］;影響木質(zhì)形成酶主要包括苯丙氨酸裂解酶、4-香豆酸輔酶A連接酶、肉桂醇脫氫酶、過氧化物酶、漆酶和dirigent蛋白［20］。試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，桉樹miRNA靶基因中與木質(zhì)形成相關(guān)的基因主要為調(diào)節(jié)MYB轉(zhuǎn)錄因子、NAC轉(zhuǎn)錄因子和過氧化酶，相應(yīng)參與調(diào)控木質(zhì)形成的miRNA主要為mir828、mir902 和 mir477。Goicoechea等［21］發(fā)現(xiàn)桉樹MYB2可以結(jié)合肉桂酰CoA還原酶基因和肉桂醇脫氫酶基因的啟動子區(qū)從而調(diào)節(jié)其轉(zhuǎn)錄水平，并在MYB2轉(zhuǎn)基因植物中發(fā)現(xiàn)次生細(xì)胞壁增厚現(xiàn)象。因而在桉樹中miRNA是否為通過影響轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)水平而影響木質(zhì)的形成，還是既調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子又同時調(diào)節(jié)木質(zhì)形成相關(guān)的酶，還需進(jìn)一步研究。

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