張蕾，賈立軍，魯承

(延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院動物醫(yī)學(xué)系，吉林延吉133002)

新孢子蟲病(Neosporiasis)是由犬新孢子蟲引起的多種家畜的一種原蟲病，該病可引起孕畜的流產(chǎn)、死胎，以及新生胎兒的運動障礙和神經(jīng)系統(tǒng)疾?。?］。1988年Dubey等從癱瘓后肢的犬體分離了蟲體，將其命名為犬新孢子蟲［2］。犬新孢子蟲為專性細(xì)胞內(nèi)寄生原蟲，隸屬于復(fù)頂亞門原生動物門新孢子蟲亞綱孢子蟲綱新孢子蟲屬。新孢子蟲病分布于世界各地，瑞士、挪威、芬蘭、哥斯達(dá)黎加、愛爾蘭、菲律賓、越南、泰國、以色列、俄羅斯、古巴等國都有因為新孢子蟲病引發(fā)母牛流產(chǎn)的事件［3］。該病給畜牧業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失，嚴(yán)重危害了養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展［4－5］。IMP1是2011年在巨型艾美耳球蟲內(nèi)發(fā)現(xiàn)的一類具有免疫保護(hù)性的蛋白，但該蛋白的來源和功能尚不明確。Cui等對犬新孢子蟲IMP1基因蛋白進(jìn)行了鑒定和定位的初步研究［6］。為了解牛源犬新孢子蟲IMP1基因的生物學(xué)特性，筆者對IMP1基因進(jìn)行克隆與序列分析，旨在為IMP1基因的表達(dá)及后續(xù)研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與蟲株。Ecoli.DH5α 菌株、犬新孢子蟲吉林株和感受態(tài)，均來自延邊大學(xué)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)實驗室。

1.1.2 主要試劑。DNA Marker2000、pMD18-T Simple Vector、XhoⅠ、Eco RⅠ和 ExTaq DNA 聚合酶，購自寶生物工程公司(大連);質(zhì)粒提取試劑盒、蛋白酶K、溶菌酶和DNA凝膠回收試劑盒，購自O(shè)MEGA公司;其他試劑均為國產(chǎn)分析純級，市售。

1.2 方法

1.2.1 引物的設(shè)計及合成。應(yīng)用Primer Premier5.0及Oligo6.0軟件設(shè)計了一對引物P1、P2，引物由上海英駿生物技術(shù)公司合成。(P1)上游:5'CGGGATCCATGGGAGGCGTTTGCTCTAA 3';(P2)下游:5'CGGAATTCTTCAATGCCGGTCAGAAGC 3'。

1.2.2 IMP1基因的PCR擴增與鑒定。以犬新孢子蟲吉林株基因組DNA為模板，PCR反應(yīng)總體系為25μl:2μl dNTP，模板 DNA 5 μl，上下游引物各 1 μl，Taq 酶 0.25 μl，2.5 μl 10×PCR Buffer，ddH2O 13.25 μl。優(yōu)化 PCR 反應(yīng)條件為:95℃預(yù)變性5 min，94℃變性45 s，58℃退火1min，72℃延伸1 min，進(jìn)行30個循環(huán)，最后72℃條件下延伸10 min。PCR反應(yīng)結(jié)束后，將其產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.3 IMP1基因的克隆。用 pMD18-T Simple Vector與純化回收的IMP1片段進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)入E.coli.DH5α感受態(tài)細(xì)胞，涂布于LB固體培養(yǎng)基上(含有Amp抗性)篩選陽性菌落。

1.2.4 重組質(zhì)粒的PCR鑒定與酶切鑒定。提取重組質(zhì)粒DNA，應(yīng)用P1、P2進(jìn)行 PCR 鑒定;應(yīng)用 Eco RⅠ和 Bam HⅠ進(jìn)行雙酶切鑒定。

1.2.5 IMP1基因片段的序列測定與分析。將鑒定正確的陽性克隆質(zhì)粒送往上海英俊生物技術(shù)公司進(jìn)行測序，并使用分子生物學(xué)軟件DNAstar系統(tǒng)對測序結(jié)果進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 目的基因的擴增 以提取的犬新孢子蟲吉林株基因組DNA為模板，P1、P2為引物，擴增出片段長度為762 bp的IMP1基因片段(圖1)。

2.2 重組質(zhì)粒pMD18-IMP1的鑒定 將IMP1基因與pMD18-T Simple Vector質(zhì)粒連接，從而獲得重組克隆質(zhì)粒pMD18-IMP1，進(jìn)行PCR擴增，得到與目的基因片段大小一致條帶，說明重組質(zhì)粒中含有IMP1基因。經(jīng)Eco RⅠ和Bam HⅠ雙酶切鑒定，得到762 bp的目的片段和2 692 bp的載體片段(圖2)，說明IMP1基因成功克隆到pMD18-T Simple Vector上。

圖1 目的基因PCR擴增結(jié)果

圖2 重組質(zhì)粒pMD18-IMP1的酶切鑒定結(jié)果

2.3 重組質(zhì)粒pMD18-IMP1的序列測定 測序結(jié)果表明，克隆得到的IMP1基因核苷酸長度為762 bp，編碼243個氨基酸。核苷酸序列197位上測序為A，而NCBI中為T，與Gen Bank(XM_003879531.1)中IMP1基因核苷酸的同源性為99.9%(圖3)。而氨基酸66位編碼的賴氨酸，突變之后編碼甲硫氨酸，氨基酸同源性為99.6%(圖4)。

圖3 IMP1基因序列與GenBank上(XM_003879531.1)序列同源性比較

圖4 IMP1基因編碼氨基酸序列的同源性比較

3 討論

禹海杰通過間接免疫熒光技術(shù)對弓形蟲速殖子不同時期IMP1蛋白的表達(dá)特性研究發(fā)現(xiàn)，在游離、吸附于細(xì)胞表面、入侵中、入侵后及納蟲空泡中的速殖子IMP1均有表達(dá)，均被定位于蟲體表面，且在有些蟲體的頂端表達(dá)更為強烈［7］。Cui等對犬新孢子蟲IMP1基因蛋白研究表明，IMP1基因蛋白編碼1 182 bp的開放閱讀框，編碼393個氨基酸，編碼的蛋白約42.9 kDa，該氨基酸序列沒有信號肽和跨膜區(qū)，但有9個?；稽c和14個磷酸化位點。試驗選擇IMP1開放閱讀框內(nèi)基因片段進(jìn)行擴增與克隆，目的是為IMP1基因的表達(dá)和生物學(xué)特性的研究奠定基礎(chǔ)。

試驗對構(gòu)建的IMP1基因重組質(zhì)粒進(jìn)行測序，得到的IMP1基因核苷酸長度為762 bp，編碼243個氨基酸。核苷酸序列197位上測序為A，而NCBI中為T，與GenBank(XM_003879531.1)中IMP1基因核苷酸的同源性為99.9%;氨基酸66位編碼的賴氨酸突變?yōu)榧琢虬彼幔被嵬葱詾?9.6%，該突變是否對蛋白的表達(dá)及其他特性造成影響還有待于進(jìn)一步研究。

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［2］DUBEY JP，CARPENTER JL，SPEERCA，etal.A newly recognized fatal protozoan disease of dogs［J］.JAm VetMed Assoc，1988，192(9):1269 －1285.

［3］OOIH K，H UANG C C，YANG C H，et al.Serological survey and first finding of Neospora caninum in Tai-wan，and the detection of its antibodies in various body fluids of cattle［J］.Veterinary Parasitology，2000，90:47 －55.

［4］鄧沖，張維，劉群，等.乳牛流產(chǎn)胎兒中新孢子蟲的鑒定［J］.中國獸醫(yī)科學(xué)，2007，37(1):16 －19.

［5］張守發(fā)，丁德，鞠玉琳，等.膠體金免疫層析法與ELISA法對牛的新孢子蟲血清抗體檢測結(jié)果的比較［J］.中國獸醫(yī)雜志，2008，44(8):54－55.

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［7］禹海杰.弓形蟲疫苗候選抗原IMP1生物學(xué)特性及其免疫原性研究［D］.杭州:浙江大學(xué)，2013.