袁曉慧，段安安，許玉蘭，2，劉惠民*

(1.西南林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，云南昆明650224;2.北京林業(yè)大學(xué)林木育種國家工程實驗室林木花卉遺傳育種教育部重點實驗室，北京100083)

云南松(Pinus yunnanensis)是分布于我國西南季風(fēng)影響下的亞熱帶山地暖性氣候條件下的重要樹種，具有適應(yīng)性強、耐干旱瘠薄以及木材用途廣泛等特點［1］，是我國西南特有種，也是組成滇黔桂亞熱帶山地針葉林植被的主要成分之一。其面積、蓄積量分別占云南省有林地面積、蓄積量的29.2%和15.8%，在云南林業(yè)生產(chǎn)中占有重要的地位，對生態(tài)經(jīng)濟建設(shè)也具有舉足輕重的作用［2］。

高質(zhì)量的基因組DNA是進行云南松遺傳多樣性研究及其他相關(guān)分子生物學(xué)研究的前提和基礎(chǔ)，是研究云南松種質(zhì)資源、調(diào)查云南松基因多樣性以及制定有效保護措施的前提。云南松針葉中含有較多的松脂(萜烯類化合物)和酚類等次生代謝產(chǎn)物，這些物質(zhì)容易與基因組DNA形成復(fù)合物，導(dǎo)致高純度的DNA的提取相對比較困難。將簡易提取法所得DNA充分溶解于TE后，再經(jīng)過高鹽沉淀法的進一步處理，可有效去除多糖和其他次生代謝雜質(zhì)，獲得可滿足試驗要求的高質(zhì)量的 DNA［3］。筆者采用正交試驗設(shè)計［4］，對簡易－高鹽沉淀法提取云南松針葉基因組DNA的提取條件進行優(yōu)化，并以定性和定量檢測為指標(biāo)，從而得出簡易－高鹽沉淀法提取云南松針葉基因組DNA的最佳處理組合，以期為云南松分子水平的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 研究對象。云南松針葉，采集于云南省昆明市西南林業(yè)大學(xué)格林溫室內(nèi)種植的云南松新鮮幼嫩的針葉。

1.1.2 主要儀器。Beckman Avanti－30高速冷凍離心機，購自北京時代北利離心機廠;Synoptics Genegenius凝膠成像分析儀和Bio-Rad Pac-300電泳儀，購自Bio-Rad公司;微量紫外分光光度計，購自上海元析儀器有限公司。

1.1.3 主要試劑。Tris和PVP，購自Sigma公司;β －巰基乙醇，購自Amresco公司;CTAB，購自Solarbio公司;TE緩沖液，購自生工生物工程(上海)有限公司;DL2000 Marker和Loading buffer，購自TaKaRa公司;100mmol/L Tris－HCL(pH 8.0)、1.4 mmol/L NaCl、20 mmol/L、EDTA、2%CTAB、3%PVP、3%β－巰基乙醇、氯仿、異戊醇、TE緩沖液(10 mmol/L Tris－HCL，pH 8.0;0.1 mmol/L EDTA)和無水乙醇等均為國產(chǎn)分析純，市售。

1.2 方法

1.2.1 材料的采集及保存。隨機采集云南松當(dāng)年生嫩針葉，平均分成16份，分別放入自封袋中，加入標(biāo)簽，擠壓出自封袋內(nèi)的空氣，置于－20℃的冰箱中保存。

1.2.2 DNA的提取。DNA提取的因素水平表見表1，設(shè)置水浴溫度、離心時間、V氯仿∶V異戊醇、NaCl濃度4 個因素，每個因素設(shè)置4個水平。提取步驟如下:①從冰箱中取出保存的云南松針葉樣品，取適量針葉放入研缽中，往研缽中迅速加入液氮研磨(液氮沒過針葉，一邊研磨一邊不斷加入液氮)，充分研磨至細粉末狀后，迅速裝入2 ml離心管中(裝到1/3處);②迅速往離心管中加入50μlβ－巰基乙醇和預(yù)熱(水浴溫度)的DNA提取液至刻度處，充分搖勻，放入水浴鍋中保溫50min，期間每隔10 min搖勻1次;③將離心管放入預(yù)冷(－4℃)的超速離心機中離心;④取上清液，加入等體積的氯仿:異戊醇，充分混勻后，將離心管放入預(yù)冷(－4℃)的超速離心機中離心;⑤重復(fù)步驟“④”2次后，取上清液，加入2.5倍體積預(yù)冷(－20℃)的無水乙醇;⑥在冰箱中靜置過夜后，將離心管放入預(yù)冷預(yù)冷(－4℃)的超速離心機中離心，倒掉上清液(注意不要將白色絮狀物倒掉);⑦將所得沉淀用濃度70%乙醇洗滌2次，風(fēng)干后溶于100μl的TE中;⑧加入適量的NaCl溶液，使溶液中NaCl的終濃度達到所定標(biāo)準(zhǔn)，然后再次用無水乙醇將DNA沉淀出來，經(jīng)洗滌風(fēng)干后，溶于100μl的TE緩沖液中。

表1 DNA提取的因素和水平

1.2.3 DNA質(zhì)量檢測。待用TE緩沖液溶解的DNA解凍后，用濃度1%瓊脂糖凝膠在120 V恒壓下電泳40 min。電泳結(jié)束后在GeneGenins公司的Bio Imaging System上觀測并拍照和分析。結(jié)果統(tǒng)計參照何正文等［5］的方法，依擴增條帶的敏感性和特異性(即條帶強弱及雜帶的多少)計分，分?jǐn)?shù)越高，表示DNA含量越高，所含雜質(zhì)越少。

1.2.4 DNA的純度和濃度檢測。用微量紫外分光光度計對DNA的純度和濃度進行檢測，測定 OD260值、OD280值、OD260/OD280值，以此檢測DNA的質(zhì)量，計算DNA濃度，若OD260/OD280值為1.7 ～1.9，表明 DNA 雜質(zhì)污染較小，純度較好［6］;若比值 ＞1.9，則表明存在 RNA 的污染;若比值 ＜1.6，則表明有蛋白質(zhì)、酚類等雜質(zhì)的影響［7］。

2 結(jié)果與分析

2.1 云南松針葉DNA的質(zhì)量 將圖1中條帶的強弱及雜帶的多少對16個處理組合進行打分，即條帶數(shù)量豐富、清晰度高、背景低的產(chǎn)物記為16分，而最差的記為1分。圖中1 ～16 處理組合計分分別為:13、9、14、11、12、7、9、6、7、16、7、12、5、3、11、15，并對不同因素與水平的電泳評分平均值和極差進行計算分析，結(jié)果如表3所示。極差R大小表明各因素影響程度的高低，R越大，說明該因素對結(jié)果影響越大。因此，在試驗范圍內(nèi)，對試驗指標(biāo)影響最大的因素是水浴溫度(C)，其次是離心時間(D)，再是 V氯仿∶V異戊醇(A)，最后是NaCl濃度(B)。根據(jù)k值確定各因素的最優(yōu)水平組合為:C3D1A3B3和 C3D1A3B4(表2)。

圖1 云南松針葉DNA電泳檢測結(jié)果

表2 正交試驗極差分析表

2.2 云南松針葉DNA的純度和濃度測定 用微量紫外分光光度計對DNA的濃度與純度進行檢測。由表3可知，處理組合10(C3D1A3B2)為最佳處理組合，所得DNA雜質(zhì)污染較小，純度較好;其次是處理組合16(C3D2A4B4)。

表4 云南松針葉DNA的純度和濃度

3 結(jié)論與討論

提取高質(zhì)量的DNA是現(xiàn)代生物技術(shù)研究中分子生物學(xué)試驗的第一步，也是關(guān)鍵的一步［8］，雖然采用試劑盒提取比較快捷，但價格昂貴［9］。正交設(shè)計篩選具有正交的均衡分散、綜合可比及可伸縮、效應(yīng)明確等特性，在減少試驗規(guī)模的同時又不損失信息，能快速找到最優(yōu)組合，同時可分析不同因素對試驗結(jié)果的影響程度［10－11］。正交試驗設(shè)計對于多因素、多水平的試驗具有簡便、節(jié)省試驗單元且統(tǒng)計效率高等特點。

根據(jù)極差分析的結(jié)果，在試驗范圍內(nèi)，對試驗指標(biāo)影響最大的因素是水浴溫度(C)，其次是離心時間(D)，再其次是V氯仿∶V異戊醇(A)，最后是 NaCl濃度(B)，最佳處理組合為:C3D1A3B3和C3D1A3B4。

根據(jù)對濃度1%瓊脂糖凝膠電泳檢測的結(jié)果打分，結(jié)合用微量紫外分光光度計對DNA的濃度與純度進行檢測的結(jié)果，處理組合10(C3D1A3B2)、組合16(C3D2A4B4)所提DNA量大、污染少，其中以處理組合10(C3D1A3B2)最佳，這與極差分析的結(jié)果基本一致。大多數(shù)處理組合所提DNA溶液的OD260/OD280值大于1.9，表明存在RNA的污染。所以，在以后的研究中可以考慮加入RNnase，去除RNA，這樣，所得的DNA不僅量大而且所含雜質(zhì)少，有利于后續(xù)研究。

［1］中國科學(xué)院中國植物志編輯委員會.中國植物志(第7卷)［M］.北京:科學(xué)出版社，1978:255－259.

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［11］續(xù)九如，黃智慧.林業(yè)試驗設(shè)計［M］.北京:中國林業(yè)出版社，1998:65－79.