王海燕 李志松 李志杰

某蛋用型父母代雞群種蛋中禽白血病病毒的檢測

王海燕 李志松 李志杰

（山東省壽光市紀(jì)臺鎮(zhèn)畜牧獸醫(yī)管理站，262722） （山東省壽光市畜牧獸醫(yī)管理局） （山東畜牧獸醫(yī)職業(yè)學(xué)院 山東 濰坊）

為了檢測某蛋用型父母代雞群是否存在外源性禽白血病病毒(ALV)的感染，收集該雞群的92枚雞胚，每枚雞胚無菌取蛋清2份，一份用禽白血病病毒p27抗原檢測試劑盒直接檢測群特異性p27抗原，同時分別將92枚雞胚蛋清接種DF1細(xì)胞，培養(yǎng)維持8d后取細(xì)胞上清檢測p27抗原。將p27抗原陽性樣品，分別用針對ALV-J和ALV-AB的單因子血清做間接免疫熒光檢測(IFA)。比較p27陽性檢出率。結(jié)果表明，直接檢測蛋清的檢出率高于蛋清接種DF1后的細(xì)胞上清，接種DF1細(xì)胞后p27抗原陽性樣品的IFA檢測結(jié)果顯示ALV-J的陽性率為100%，ALV-AB全部為陰性。說明該蛋用型父母代雞群存在的外源性ALV感染主要是ALV-J，該研究為針對ALV的凈化提供了可行性檢測方法。

父母代 種蛋 禽白血病病毒 p27抗原 間接免疫熒光

禽白血病(Avian Leukosis，AL)是由禽白血病病毒(Avian Leukosis Virus，ALV)和禽肉瘤病病毒(Avian Sarcoma Virus，RSV)引起的禽類多種腫瘤性疾病的統(tǒng)稱。本病除了腫瘤等一些特殊病變外，常繼發(fā)細(xì)菌感染或嚴(yán)重干擾對雞新城疫、禽流感等疫苗的免疫效果，而且還常常通過種蛋引發(fā)垂直感染，引起諸多糾紛。

從20世紀(jì)60年代起，國際大型種雞公司已開始對ALV實行嚴(yán)格的凈化措施，主要是通過剔除感染種雞，切斷垂直傳播途徑并將后代隔離飼養(yǎng)。經(jīng)過多年的努力，到80年代中期，在商業(yè)化雞群中外源性ALV感染已基本被清除，很少被檢測到。1989年，在白羽肉用型雞群中又出現(xiàn)了具有更強(qiáng)致病性和傳播能力的ALV-J，并流行到世界各地，給世界肉雞產(chǎn)業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[1-3]。近幾年來，我國各地蛋雞場在雞群開產(chǎn)后發(fā)生禽白血病/血管瘤的病例顯著增多，該病已成為影響我國蛋雞業(yè)的重要疫病之一。病毒分離鑒定表明，近年來在我國產(chǎn)蛋雞開產(chǎn)后發(fā)生的白血病/血管瘤主要是由ALV-J引起，但也同時也大量存在由A、B亞群ALV感染引起。實際上，ALV-J的流行狀況，最初主要表現(xiàn)在從國外引進(jìn)的白羽肉用型種雞[4,5,6]，隨后發(fā)現(xiàn)ALV-J在我國蛋用型雞[7,8,9,10]、南方的三黃雞[11]和我國的純地方品系[12,13]中也開始引發(fā)骨髓樣細(xì)胞瘤的廣泛流行。本研究從某疑似感染ALV的父母代種雞場種蛋中完成了對ALV的分離鑒定。

1 材料與方法

1.1 樣品來源與背景 某海蘭褐父母代蛋雞種雞場剖檢多次觀察到腫瘤，懷疑感染有ALV。為了確認(rèn)并評估本雞群ALV感染的風(fēng)險，從該種雞場隨機(jī)采集種蛋92枚。以無菌操作的方式，每枚雞胚取2份蛋清，置于-80℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 主要試劑與試劑盒 ALV-J和A/B單因子血清由本實驗室制備和保存，異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記的羊抗雞二抗購自SIGMA公司。DF-1細(xì)胞購自ATCC并由本實驗室保存，小牛血清購自大理鄧川錦洋生物工程公司。禽白血病病毒p27抗原ELISA檢測試劑盒購自美國IDEXX公司。

1.3 蛋清ALV-p27抗原的直接檢測 將凍存的蛋清反復(fù)凍融3次后用禽白血病病毒p27抗原檢測試劑盒檢測ALV的群特異性抗原p27，具體操作嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.4 蛋清接種細(xì)胞后ALV-p27抗原的檢測 將92份蛋清，用在4℃預(yù)冷的細(xì)胞維持液進(jìn)行5倍稀釋(用2ml細(xì)胞維持液稀釋500ul的蛋清)接至含DF1單層細(xì)胞的24孔板上,每孔1ml,每份樣品接1孔,同時設(shè)陰性對照。接種的細(xì)胞在37℃培養(yǎng)箱中孵育2h后棄掉培養(yǎng)上清液，更換成含1%新生小牛血清的DMEM維持液；繼續(xù)在37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7d后，收集培養(yǎng)上清液，反復(fù)凍融3次，取200uL用IDEXX公司ALV-p27抗原檢測試劑盒檢測p27抗原。

1.5 ALV-J和ALV-A/B的IFA檢測 將DF1細(xì)胞培養(yǎng)的經(jīng)ELISA試劑盒檢測p27為陽性的蛋清樣品，分別傳至帶有飛片的六孔板中，繼續(xù)培養(yǎng)3d后，將飛片取出固定后分別用ALV-J和ALV-AB的單因子血清做IFA檢測[23]。

2 結(jié)果與分析

2.1 種蛋中ALV-p27抗原的檢測結(jié)果比較 92枚雞蛋蛋清直接檢測ALV p27抗原的陽性率為36.96%。而92份蛋清接種DF-1后p27抗原檢測結(jié)果顯示，4份樣品為陽性，顯示該雞群存在外源性ALV感染，陽性率為4.35%。比較p27陽性檢出率的結(jié)果表明，直接檢測蛋清的檢出率高于蛋清接種DF1的細(xì)胞上清，這說明存在大量的內(nèi)源性ALV的表達(dá)。結(jié)果見表1。

表1 蛋雞場種蛋中p27抗原的陽性比率

2.2 IFA檢測ALV-J，ALV-A/B與ELISA檢測p27抗原的結(jié)果比較 IFA檢測結(jié)果表明，4份經(jīng)DF1培養(yǎng)的ALV陽性樣品有4份為ALV-J陽性。與未感染ALV-J的樣品相比，陽性樣品的胞質(zhì)內(nèi)均有明顯的特異性綠色熒光，細(xì)胞核未被染色呈現(xiàn)灰暗色；ALV-AB均為陰性。IFA與p27抗原的ELISA檢測結(jié)果比較表明,該雞群中存在的ALV感染主要為ALV-J。結(jié)果見表2。

表2 IFA檢測ALV-J、ALV-AB與ELISA檢測p27抗原的比較結(jié)果

3 討論

ALV引起的腫瘤病是目前危害養(yǎng)雞業(yè)的主要疾病之一，已在世界范圍內(nèi)呈蔓延。近幾年來，不斷有蛋雞感染禽白血病的報道[14,7,8,9,10]，許多種雞場都很關(guān)心蛋雞禽白血病的感染來源，對種雞群進(jìn)行檢測與凈化已經(jīng)勢在必行。國際大型蛋用型祖代雞場公司盡管一直在實施ALV的凈化措施，但卻不能完全排除外源性ALV的感染，并且美國已有報道證明，近年來在美國市場上使用的幾種馬立克疫苗中都檢測出了ALV的污染[15,16],相關(guān)種禽企業(yè)可能使用了這些疫苗，從而造成了ALV的感染。鑒于ALV的垂直傳播特性，這些企業(yè)即使在發(fā)現(xiàn)感染后重新采取凈化措施，也不能保證在幾年內(nèi)就實現(xiàn)100%的凈化。本研究采集某蛋雞場父母代雞群的92枚種蛋對ALV進(jìn)行了檢測，評價了該蛋雞場父母代雞群ALV的感染狀態(tài)。

所有ALV檢測方法中，ELISA最為常用，而DF1對內(nèi)源性ALV有抗性，可區(qū)分有致病性的外源性ALV，對種蛋蛋清接種DF1培養(yǎng)后的細(xì)胞上清的ELISA檢測可用于剔除內(nèi)源性ALV感染的種雞。本研究采用ELISA方法檢測了92枚種蛋蛋清ALV-p27抗原與92枚種蛋蛋清接種DF1細(xì)胞上清中的ALV-p27抗原。比較p27抗原陽性檢出率的結(jié)果表明，直接檢測蛋清的檢出率高于蛋清接種DF1的細(xì)胞上清。由于ALV對外界的抵抗力很弱，在運輸、取樣或接種過程中會由于溫度等外界因素而失去傳染性，而蛋清中的p27屬于衣殼蛋白，不易變性，故直接檢測蛋清p27的陽性率會遠(yuǎn)遠(yuǎn)的高于檢測蛋清接種細(xì)胞的細(xì)胞上清p27，因此采用種蛋蛋清直接檢測ALV-p27的方法檢測ALV更加有利于ALV陽性蛋雞的及時剔除，而且該研究方法較經(jīng)典的采集抗凝血進(jìn)行病毒分離的方法更為簡便。對4份經(jīng)DF1培養(yǎng)的外源性ALV陽性樣品分別用ALV-J和ALV-A/B單因子血清進(jìn)行的IFA檢測結(jié)果顯示，4份ALV-J均呈陽性，ALV-AB均呈陰性。表明，該蛋用型雞場父母代雞種蛋中感染的外源性ALV為ALV-J。

本研究通過對某父母代蛋雞種蛋蛋清中ALV-p27抗原及細(xì)胞培養(yǎng)后p27抗原的檢測，評價了該蛋雞場父母代雞群ALV的感染狀態(tài),為不同種雞群ALV的凈化提供了可行性方法，同時提供了禽白血病防控技術(shù)體系所需的實驗室檢測依據(jù)與可靠的流行病學(xué)資料。

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（2014–03–31）

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