秦祎婷，李雪，翟志席，董學會

（中國農業(yè)大學農學與生物技術學院，北京 100193）

東北紅豆杉種子發(fā)育過程生理特性研究

秦祎婷，李雪，翟志席，董學會*

（中國農業(yè)大學農學與生物技術學院，北京 100193）

文章對紅豆杉種子發(fā)育形態(tài)學、物質積累以及內源激素水平等進行調查。結果表明，種子在12 WAP（Weeks after pollination，發(fā)育周數(shù)）時含水量約為22%。種子可溶性糖含量在發(fā)育過程中變化較大，在2 WAP時為19%，達到整個發(fā)育過程的峰值。而可溶性蛋白質含量則隨著種子發(fā)育逐漸增加，在12 WAP時達到峰值，為17%。10 WAP時，總脂肪酸含量最高，為干重的31.98 mg·g-1。在內源激素方面，種子中ABA水平在12 WAP降至最低，而GA含量呈總體下降趨勢。

東北紅豆杉；種子發(fā)育；種子形態(tài)學；脂肪酸

植物種子在采收時的發(fā)育程度和物質積累，是決定種子萌發(fā)能力的重要因素[1-2]。從種子形成和發(fā)育階段入手研究東北紅豆杉種子發(fā)育特點是了解其休眠成因的重要途徑。Flores等對紅豆杉Taxusxmedia（var.Hicksii,var.Wardi,var.Citation, and var.Sunburst），短葉紅豆杉Taxus brevifolia，歐洲紫杉Taxus baccata進行研究，將采收的種子分成五個成熟等級：LG，種子呈淺綠色且無假果皮；G，種子呈墨綠色；EA，具有正在發(fā)育的粉紅色假果皮種皮；RG，具有發(fā)育完全的假果皮青色種子；RD，具有深紅色發(fā)育完全假果皮深褐色種子。在這五個等級當中，G級種子萌發(fā)率最高，可達70%。而成熟度高于G級的RG和RD發(fā)芽率則低于10%。這是由于種子脫水使得種皮更加堅硬致密，對種胚產(chǎn)生機械約束[3]。

紅豆杉種子的形成過程與種子成熟及休眠有密切聯(lián)系，在種子發(fā)育過程中，若外界環(huán)境條件惡劣，多種因素可導致種子休眠。當種子發(fā)育處于高溫或低濕狀態(tài)下時，種皮脫水程度較高，導致種皮質地較為堅硬，對種胚發(fā)育形成約束，迫使種子進入休眠；另外，種子中的內源ABA對逆境響應，當環(huán)境條件惡劣時，則會調控種子進入休眠狀態(tài)。張艷杰等研究表明，種皮中的萌發(fā)抑制物質也是誘導休眠的重要因素之一。南方紅豆杉種子的種皮浸提液可對其他植物種子的萌發(fā)進行抑制[4-6]。

東北紅豆杉種子休眠主要受到種皮約束、營養(yǎng)物質積累及內源激素水平等因素影響，目前，有關東北紅豆杉種子休眠成因研究未見報道。本研究針對東北紅豆杉種子發(fā)育特點，對發(fā)育過程中的形態(tài)學、物質積累以及內源激素水平等指標進行調查，并進一步研究種皮發(fā)育過程以及可溶性糖、蛋白質、脂肪酸的積累特點，旨在通過了解東北紅豆杉種子發(fā)育過程的生理特性，對種子休眠形成原因進行探討，為東北紅豆杉種子休眠機制以及解除休眠技術研究提供參考和依據(jù)，為東北紅豆杉物種保護工作提供技術保障。

1 材料與方法

1.1 種子樣品

本研究所用種子樣品，均取自中國吉林省集安市東北紅豆杉苗木基地（E 125°34′,N 40°52′）。紅豆杉苗木基地位于集安市針闊葉混交林區(qū)。

為探討種子發(fā)育過程中的生理變化和形態(tài)變化，于種子形成至種子成熟過程中的關鍵時間點進行取樣，發(fā)育階段取樣方法為：4 WAP-形成初期，種皮青色；6 WAP-種皮青色，無假果皮；8 WAP-種皮淺褐色，假果皮青色；10 WAP-種皮褐色，假果皮粉紅色；12 WAP-種皮深褐色，假果皮紅色。

1.2 顯微掃描電鏡成像

本研究使用的成像儀器為TM3000臺式掃描電鏡（日本，HITACHI）。將紅豆杉種子樣品進行縱切，剖面向上，將種子用碳雙面膠固定于樣品臺上，調整樣品臺高度，置于樣品室中。待樣品室成為真空狀態(tài)，即可開始掃描。

1.3 解剖鏡成像

使用Motic體視顯微鏡，將待檢測的種子樣品進行整體外觀以及縱切面的解剖成像，放大倍數(shù)為6倍，使用白色背景。利用motic 2.0軟件進行拍照，并測量種胚長度和寬度。

1.4 可溶性糖含量測定方法

采用蒽酮法測定可溶性糖含量。每個種子樣品取100 mg干樣粉末，加入4 mL 80%乙醇溶液后，于80℃水浴加熱40 min，3 500 r·min-1離心10 min，收集上清液。向殘渣中再加入4 mL 80%乙醇溶液，進行第2次提取。合并上清液，并定容至25 mL。取1 mL樣品提取液，加入5 mL蒽酮試劑，充分搖勻，沸水浴10 min。加熱后投入自來水中冷卻，20 min后于分光光度計620 nm處測定OD值。然后從標準曲線上查出相應糖含量，計算樣品含糖量。每個樣品3次重復。

1.5 蛋白質含量測定方法

采用考馬斯亮藍法對種子樣品蛋白質含量進行測定。稱取100 mg種子干樣，置于研缽中，加入10 mL磷酸緩沖液（pH 7.0），研磨至勻漿。在10 000×g離心力下，離心10 min，取上清。再向殘渣中加入5 mL磷酸緩沖液，充分搖勻后再次離心，合并上清液，并定容至25 mL。準確吸取0.1 mL樣品提取液，加入5 mL考馬斯亮藍溶液，充分混勻后，于分光光度計595 nm處測定OD值。并根據(jù)標準曲線，計算蛋白質濃度。每個樣品3次重復。

1.6 脂肪酸含量測定方法

脂肪酸提取采用改進后的Sukhija和Palmquist方法[7]。每個樣品需準確稱取100 mg種子干樣粉末，用移液管加4 mL無水甲醇∶氯乙酰（10∶1）的混合液，5 mL內標，振蕩混勻，80℃水浴2 h。水浴結束后取出，冷卻到室溫，加5 mL 7%K2CO3溶液中和脂肪酸。吸取上清于樣品瓶中，置4℃冰箱待于氣相色譜上機。

樣品檢測儀器為安捷倫氣相色譜儀HP6890和HP7890，分離柱為Inner-Wax極性柱。每個樣品重復兩次，兩次重復的平均值為種子脂肪酸含量。

1.7 內源激素含量測定

利用酶聯(lián)免疫法（ELISA）對紅豆杉種子內源ABA與GA水平測定。每個樣品稱取100 mg鮮樣，加入5 mL樣品提取液，在冰浴上研磨至勻漿，轉入10 mL離心管中，搖勻后置于4℃條件下提取4 h。提取結束后，1 000 g×離心15 min，保留上清液。為避免雜質和色素干擾測定結果，需將上清液過C18固相萃取柱。將過柱后收集的樣品提取液用氮氣吹干，用樣品稀釋液定容至2 mL。

在96孔酶標板中加入標樣和待測樣，每個樣品加3孔，每孔50 μL。在標樣和待測樣孔中分別加入50 μL抗體，37℃溫育30 min。洗板后在每孔中加入100 μL二抗，37℃溫育30 min，洗板。在每孔中加入100 μL底物顯色液，當顯色適當后，加入100 μL終止液終止反應。最高濃度標準液調0，在酶聯(lián)免疫分光光度計490 nm處進行測定。

使用標準液濃度的自然對數(shù)為橫坐標，OD值的logit值為縱坐標，繪制標準曲線。利用標準曲線計算樣品濃度和含量。

2 結果與分析

2.1 種子形態(tài)發(fā)育

種子在發(fā)育進程中，形態(tài)變化與生理變化有密切聯(lián)系。在發(fā)育過程中，紅豆杉種子種皮由單層發(fā)育成多層。紅豆杉種子發(fā)育過程的形態(tài)學變化如圖1所示。

由圖1可知，在種子發(fā)育初期，種皮組織幼嫩，且為疏松多層結構（4 WAP）。隨著發(fā)育進行，種皮組織逐漸形成內外兩層，且結構致密，質地堅硬。而種子在4 WAP時，種子表皮呈嫩綠色；隨著種子發(fā)育，以及種子逐漸脫水，種皮顏色由青色逐步轉變?yōu)樽睾稚?。由此可見，種子發(fā)育過程中，種皮機械約束逐漸形成。至種子成熟時，種皮分為內外兩層，含水量低，導致種皮機械約束大，種胚生長受到抑制，進入休眠。

圖1 東北紅豆杉種子形態(tài)發(fā)育過程Fig.1 Seed morphological developing in Japanese yew

2.2 種子發(fā)育與含水量

由圖2可知，種子水分含量變化，6～8 WAP有明顯下降。從8 WAP開始，含水量趨于穩(wěn)定。因此推斷，在東北紅豆杉種子成熟過程中，有脫水干燥和代謝物積累發(fā)生。種子脫落時含水量約為22%。在種子發(fā)育至4 WAP時，種子體積小，含水量較低，而在6 WAP時，種子含水量達到峰值，此時種子體積膨大，種胚開始形成。6 WAP后，種子開始脫水，含水量逐漸降低，但干重緩慢增加，此時種子中的主要成分由水分變?yōu)闋I養(yǎng)貯藏物質。8～12 WAP，種子因脫水而體積減小，顏色加深。

2.3 種子發(fā)育與物質積累

2.3.1 可溶性糖含量

種子成熟過程中，糖含量的變化較為明顯（見圖3）。在2 WAP時，糖含量為19%，達到整個發(fā)育過程的峰值；在4～8 WAP時，種子可溶性糖含量持續(xù)下降，而在10 WAP出現(xiàn)小幅上升后，繼而下降；直至種子成熟（12 WAP）時，種子中可溶性糖水平最低。種子形成初期，種胚并未分化形成，種皮內為多層分生組織。此時，種子中正進行組織分化等生理活動，對糖需求較大。隨著發(fā)育進行，種子消耗糖類同時也進行物質積累，將糖類物質由可溶性游離態(tài)轉化為不可溶的貯藏物質。在8～10 WAP期間，種子開始脫水，使種子中糖的比重變大，因而出現(xiàn)短暫的上升過程。

圖2 東北紅豆杉種子發(fā)育過程中干重與鮮重變化Fig.2 Changes of DMW and FMW in Japanese yew during seed development

圖3 東北紅豆杉種子發(fā)育過程中可溶性糖含量變化Fig.3 Changes of soluble sugar content in Japanese yew during seed development

2.3.2 可溶性蛋白含量

蛋白質含量如圖4所示，在整個發(fā)育過程中呈上升趨勢。從4～6 WAP，種子蛋白質含量上升速度最快，而在6～10 WAP幾乎維持在同一水平，在10～12 WAP，又出現(xiàn)較為明顯的增加，在12 WAP時達到峰值，為17%。

圖4 東北紅豆杉種子發(fā)育過程中可溶性蛋白質含量變化Fig.4 Changes of soluble protein content in Japanese yew during seed development

2.3.3 脂肪酸組分及含量

種子完全成熟（12 WAP）時，總脂肪酸（TFA）含量為干重（DM）的27.86 mg·g-1（見表1）。色譜分析結果表明，種子中主要脂肪酸類型可分為：飽和脂肪酸，代表是軟脂酸（C16:0）和硬脂酸（C18:0），分別占總脂肪酸的11.8%和2.5%；單不飽和脂肪酸，代表是棕櫚油酸（C16:1）和油酸（C18:1），分別占總脂肪酸的1.6%和73.0%；以及多不飽和脂肪酸（PUFAs），代表是亞油酸（C18:2）和亞麻酸（C18:3），分別占總脂肪酸的10.3%和0.9%。

由表1可知，在剛形成的種子中，亞油酸（C18:2）是主要脂肪酸（為TFA的40%）。數(shù)據(jù)取平均值后，軟脂酸和亞麻酸也占一定比重，分別為TFA的28%和15%。在種子發(fā)育過程中，亞油酸、軟脂酸和亞麻酸含量均明顯下降。而與此相反，從受精后第9周開始油酸含量增加并成為最重要的脂肪酸組分，達到73%。結果與Chahed等對阿月混子樹研究相似[8]。在種子發(fā)育過程中，PUFA主要組分亞油酸和亞麻酸，隨著油酸的增加而減少。因此在種子形成初期，脫氫酶活性很高，但是在完全成熟的種子中處于抑制狀態(tài)，使油酸不被氧化。此現(xiàn)象同樣出現(xiàn)在鱷梨中[9]。

東北紅豆杉種子形成和發(fā)育過程中，總脂肪酸含量變化見表1。TFA含量在6 WAP（15.94 mg·g-1DM）開始增加，在10 WAP達到31.98 mg·g-1DM，隨后因為油酸減少而輕微下降（見表1）。當種子成熟時，脂肪酶被激活，胚可利用自身營養(yǎng)物質。從4 WAP至6 WAP，軟脂酸（C16:0）、油酸（C18: 1）和亞油酸（C18:2）含量增加，在種子完全成熟時，分別達到43.52、268.71和37.74 mg·g-1DM（見表1）。

從第10WAP開始，最為豐富的油酸含量開始下降，標志種子已經(jīng)成熟，此時其他脂肪酸組分含量很低并保持恒定。因此，脂肪酸總量的增加尤其是油酸含量，證明脂肪酸合酶（FAS）系統(tǒng)在第10 WAP被激活[10]。同時觀察到，油酸和亞油酸在演變中朝相反方向變化。

表1 東北紅豆杉種子發(fā)育過程中種子內脂肪酸含量Table 1 FAs contents in Japanese yew seeds during seed development (mg·g-1DM)

2.4 種子發(fā)育與內源激素

由于ABA和GA在種子休眠形成過程中起主要調控作用，本研究對發(fā)育過程中的種子樣品進行內源ABA和GA水平調查，結果如圖5所示。種子在正常發(fā)育過程中，胚的ABA含量于6 WAP迅速下降，在8 WAP達到峰值，之后隨著種子發(fā)育的進行不斷下降。直至種子成熟時（12 WAP），種子中ABA水平降至最低。種子在正常發(fā)育過程中GA含量呈總體下降趨勢。在種子形成初期（4 WAP），種子中GA水平為最高。在6～8 WAP，其含量迅速下降，此時ABA迅速增加。而8～12 WAP，種子中GA含量維持在較低水平。

在種子形成初期（4 WAP），GA對種子生長和分化起主要作用。此時ABA參與種子中物質積累調控。在6 WAP時，種子體積膨大，此時種子含水量較高，較低ABA水平有利于水分增加。當種子發(fā)育至8 WAP，處于成熟脫水階段，此時內源ABA含量最高，有利于成熟脫水過程的進行。此時ABA含量達到峰值，由于ABA與GA之間存在一定拮抗作用，在8 WAP時種子內源GA含量最低。

圖5 東北紅豆杉種子發(fā)育過程中內源激素的動態(tài)變化Fig.5 Dynamic changes of endogenous hormone in Japanese yew during seed development

3 討論與結論

通過調查東北紅豆杉種子形態(tài)學與生理發(fā)育過程，以顯微鏡與掃描電鏡采集種子外觀及內部形態(tài)、結構數(shù)據(jù)，本文采用分光光度法對各發(fā)育階段種子可溶性糖與蛋白含量進行測定，研究種子發(fā)育過程中種子脂肪酸組分及內源激素水平動態(tài)變化，為東北紅豆杉種子休眠機理研究提供依據(jù)。

3.1 紅豆杉種子發(fā)育特點

紅豆杉種子在形成初期，內部并無胚與胚乳，而是由多層分生組織構成。在初期，種皮柔軟幼嫩，并在發(fā)育成熟過程中逐漸變厚，至種子脫水變色期，種皮已成為兩層堅硬致密的“殼”，對種胚的發(fā)育進行限制。

本研究結果發(fā)現(xiàn)，紅豆杉種子發(fā)育過程中，種子含水量先快速增加，然后逐漸脫水。在種子膨大期含水量最高，此時種子體積最大，種皮呈青色。在種子發(fā)育中后期，種子開始脫水，并且種皮顏色變深，種子體積變小。

3.2 種子發(fā)育與物質積累的關系

種子形成和發(fā)育過程中，用于各種生理反應的可溶性糖含量呈下降趨勢，而用于貯藏脂肪酸和可溶性蛋白質含量呈整體上升趨勢。表明，紅豆杉種子在發(fā)育后期的生理活動強度減弱，并將營養(yǎng)物質轉化為貯藏物質，進入休眠狀態(tài)。

種子發(fā)育與ABA的代謝合成有緊密關系[11-14]，在種子開始脫水的發(fā)育中期，ABA含量達到峰值。而在種子發(fā)育后期，種子基本處于休眠狀態(tài)，ABA含量與GA含量均最低。

3.3 種子發(fā)育與休眠的關系

紅豆杉種子在發(fā)育過程中，種皮逐漸脫水，而種胚發(fā)育較慢。直至種子從母株上脫落后，種皮堅硬致密，而種胚發(fā)育程度并未達到成熟標準。此時，種皮的機械約束限制種胚生長，被迫進入休眠狀態(tài)。

而在種子發(fā)育過程中，營養(yǎng)物質由活動態(tài)向貯藏態(tài)的轉化也使種子進入靜默狀態(tài)。ABA和GA對種子的調控高峰在種子發(fā)育初期和中期，而在種子進入休眠態(tài)后，內源激素含量降至最低。表明種子在發(fā)育后期，內源激素對其生理活動的調控作用較弱。

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Study on physiological property inTaxus cuspidataduring seed development

QIN Yiting,LI Xue,ZHAI Zhixi,DONG Xuehui
(School of Agronomy and Biotechnology,ChinaAgricultural University,Beijing 100193,China)

This research focuses on the changes of morphology,nutrition accumulation and endogenous hormone levels.The results showed that the water content of Japanese yew seed peaked at 12 WAP(WAP,Weeks after pollination),was 22%.The sugar content peaked at 2 WAP,was 19%.The protein content increased during seed development,and it peaked at 12 WAP,was 17%.The content of total fatty acids peaked at 10 WAP,was 31.98 mg·g-1DM.The lowest level of ABA was appeared at 12 WAP,and GA level decreased during seed development.

Taxus cuspidata;seed development;seed morphology;fat acids

S330.3

A

1005-9369（2014）11-0008-06

2014-06-05

國家自然科學基金項目（30570180）

秦祎婷（1987-），女，博士研究生，研究方向為種子分子生物學。E-mail:qyt_729@126.com *通訊作者：董學會，教授，博士生導師，研究方向為種子分子生物學。E-mail:xuehuidong@cau.edu.cn

時間2014-11-21 16:40:42[URL]http://www.cnki.net/kcms/detail/23.1391.S.20141121.1640.010.html

秦祎婷,李雪,翟志席,等.東北紅豆杉種子發(fā)育過程生理特性研究[J].東北農業(yè)大學學報,2014,45(11):8-13.

Qin Yiting,Li Xue,Zhai Zhixi,et al.Study on physiological property inTaxus cuspidataduring seed de-velopment[J].Journal of Northeast Agricultural University,2014,45(11):8-13.(in Chinese with English abstract)