時(shí)小艷

（江蘇食品藥品職業(yè)技術(shù)學(xué)院，江蘇 淮安 223003）

進(jìn)入生殖嵴前PGCs中H2A變體的分布

時(shí)小艷

（江蘇食品藥品職業(yè)技術(shù)學(xué)院，江蘇 淮安 223003）

小鼠原始生殖細(xì)胞進(jìn)入生殖嵴之前經(jīng)歷細(xì)胞遷移、大量繁殖。為進(jìn)一步解分子調(diào)控機(jī)制，文章通過(guò)組織石蠟切片免疫熒光染色和單細(xì)胞免疫熒光染色技術(shù)，對(duì)8.5、10.5 dpcPGCs中組蛋白H2A變體MacroH2A、H2A.Z、H2A.X的分布情況進(jìn)行研究。結(jié)果表明，8.5～10.5 dpc，H2A.Z在PGCs中的表達(dá)明顯遞增，10.5 dpc PGCs中H2A.Z的表達(dá)主要集中于細(xì)胞核；而MacroH2A和H2A.X在此過(guò)程中無(wú)明顯變化，在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中弱表達(dá)。綜合分析發(fā)現(xiàn)，8.5～10.5 dpc PGCs中H2A.Z可能是裝配核小體的主要變體，PGCs大量繁殖可能有H2A.Z的參與。

H2A變體；PGCs；生殖嵴；分布

小鼠PGCs從產(chǎn)生到性別分化產(chǎn)生配子，整個(gè)過(guò)程中細(xì)胞發(fā)生著一系列的生物學(xué)變化。配種天數(shù)（Days post coitum，dpc）為小鼠胚胎8.5～10.5 d，PGCs是尿囊蒂和原條尾端的卵黃囊臟層，即后腸開(kāi)口邊緣并與之結(jié)合處，沿后腸在腸壁內(nèi)胚層細(xì)胞之間向前遷移，進(jìn)入背腸系膜后向生殖嵴遷移，在遷移過(guò)程中細(xì)胞數(shù)量快速增加。

近年來(lái)對(duì)組蛋白H2A變體研究增多，MacroH2A主要分布在失活X染色體上，在胚胎發(fā)育過(guò)程中，去除MacroH2A，導(dǎo)致表觀(guān)遺傳重組[1]。MacroH2A有助于改變?nèi)旧w可塑性和結(jié)構(gòu)[2]；H2A.X與基因組穩(wěn)定相關(guān)[3]，在DNA出現(xiàn)斷裂時(shí)，替代H2A變體，對(duì)DNA修復(fù)有重要作用。組蛋白變異體H2A.Z對(duì)基因表達(dá)調(diào)控、基因組穩(wěn)定和染色質(zhì)重構(gòu)起重要作用[4]，但是否與小鼠原始生殖細(xì)胞生理活動(dòng)相關(guān)，未見(jiàn)相關(guān)研究報(bào)道。本文通過(guò)組織石蠟切片免疫熒光和單細(xì)胞的免疫熒光法對(duì)MacroH2A、H2A.Z、H2A.X三種變體在PGCs中表達(dá)情況進(jìn)行研究，分析小鼠生殖細(xì)胞進(jìn)入生殖嵴之前活動(dòng)狀態(tài)及分子調(diào)控機(jī)制，為相關(guān)試驗(yàn)研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物及試劑

1.1.1 動(dòng)物

昆明白孕鼠（8.5和10.5 dpc），購(gòu)自南京青農(nóng)山實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.1.2 試劑及抗體

1.1.2.1 儀器設(shè)備

連續(xù)變倍體視顯微鏡（52-51），購(gòu)自O(shè)LYMPUS公司；正置熒光顯微鏡，購(gòu)自L(fǎng)eica公司；倒置熒光顯微鏡，購(gòu)自L(fǎng)eica公司；超凈工作臺(tái)，購(gòu)自上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠(chǎng)；超低溫冰箱，購(gòu)自Thercto公司；離心機(jī)，購(gòu)自Eppendorf公司；可調(diào)式微量移液器，購(gòu)自Eppendorf公司。

1.1.2.2 普通試劑

孕馬血清促性腺激素（PMSG）、人絨毛膜促性腺激素（hCG）、Tween-20、無(wú)水乙醇、二甲苯、構(gòu)椽酸鈉、石蠟、多聚甲醛均為國(guó)產(chǎn)，購(gòu)自南京農(nóng)業(yè)大學(xué)。

1.1.2.3 抗體

一抗：stella（兔抗小鼠，Abcam公司，貨號(hào)ab19878）、二抗FITC標(biāo)記（山羊抗兔，Sigma公司，貨號(hào)F0382）；一抗：H2A.X（兔抗小鼠，Abcam公司，貨號(hào)ab20669）、二抗Cy3標(biāo)記（山羊抗兔，Sigma公司，貨號(hào)C2306）；一抗：macroH2A（兔抗小鼠，Abcam公司，貨號(hào)ab20669）、二抗Cy3標(biāo)記（山羊抗兔，Sigma公司，貨號(hào)C2306）；一抗：H2A.Z（兔抗小鼠，Abcam公司，貨號(hào)ab20669）、二抗Cy3標(biāo)記（山羊抗兔，Sigma公司，貨號(hào)C2306）；DAPI，（Sigma公司，貨號(hào)D9542）。

1.2 方法

1.2.1 PGCs組織樣石蠟切片制作

將健康成熟母鼠腹腔注射PMSG、hCG后，與健康成熟公鼠合籠，第2天上午8∶00前見(jiàn)栓母鼠選出分籠飼養(yǎng)，記為孕0.5 dpc。將培養(yǎng)至8.5和10.5 dpc的孕鼠用頸椎脫臼法致死，打開(kāi)子宮并分離胚胎，置于無(wú)Ca2+、Mg2+的PBS液培養(yǎng)皿中，在PBS液中采集胚胎組織樣。8.5 dpc胚胎采集后1/3部分；10.5 dpc胚胎采集背腸系膜部，然后將組織樣用固定液固定。將固定好的組織樣脫水、透明、浸蠟、包埋、修整、切片[5]。

1.2.2 PGCs的分離及切片制備

1.2.2.1 PGCs的分離

將8.5和10.5 dpc含PGCs的組織樣用PBS溶液液清洗3次后剪碎，用0.125%胰蛋白酶加0.02% EDTA消化15 min，消化終止時(shí)加入等量血清培養(yǎng)液，等其沉淀完全后，取上清液過(guò)濾，剩余組織重復(fù)消化2次，合并濾液，離心機(jī)離心后棄上清，加入3.7%多聚甲醛固定液固定30 min，離心機(jī)離心后用吸水紙吸去上清，得到原始生殖細(xì)胞溶液。

1.2.2.2 PGCs切片制備

將細(xì)胞液滴在經(jīng)洗衣粉浸泡過(guò)夜、自來(lái)水沖洗、烘干、硫酸洗劑浸泡過(guò)夜、自來(lái)水沖洗、95%乙醇浸泡、擦干、高壓滅菌、滴50 mL 0.25%明膠溶液鋪平，風(fēng)干處理的載玻片上，室溫干燥，用蓋玻片加凡士林封片[5]。

1.2.3 免疫熒光染色

將8.5和10.5 dpc含PGCs的組織樣切片用含0.1%BSA的PBS溶液清洗2次，滴加0.5%的TritonX-100在切片上，靜置10 min，再用PBS清洗1次，滴加含0.05%Tween-20的PBS/BSA在切片上，保持30 min?？贵w孵育：加組蛋白變體（H2A.X、macroH2A、H2A.Z）一抗孵育1 h，PBS清洗2次，加二抗Cy3標(biāo)記孵育1 h。PBS清洗2次，加stella抗體（PGCs抗體）孵育1 h；PBS再清洗2次，加標(biāo)記stella二抗FITC孵育1 h；PBS清洗2次，加DAPI處理20 min。最后將切片置于熒光顯微鏡下觀(guān)察、拍照[6]。

2 結(jié)果與分析

2.1 H2A.Z在原始生殖細(xì)胞進(jìn)入生殖嵴前的分布

通過(guò)對(duì)8.5和10.5 dpc的含PGCs組織樣的免疫熒光染色發(fā)現(xiàn)，在8.5 dpc PGCs中沒(méi)有檢測(cè)到H2A. Z的熒光（見(jiàn)圖1，8.5 dpc第三列圖片中箭頭所指），而在PGCs進(jìn)入生殖嵴前后（10.5 dpc）H2A.Z的熒光明顯增強(qiáng)（見(jiàn)圖1，10.5 dpc第三列圖片中箭頭所指）。

為研究H2A.Z在細(xì)胞中具體表達(dá)位置，本文進(jìn)行8.5和10.5 dpc PGCs單細(xì)胞的免疫熒光試驗(yàn)。結(jié)果表明，10.5 dpc單細(xì)胞中H2A.Z熒光強(qiáng)度比8.5 dpc強(qiáng)，10.5 dpc PGCs中H2A.Z的熒光主要集中于細(xì)胞核，如圖2所示。

圖2 8.5和10.5 dpc PGCs中H2A.Z的表達(dá)Fig.2 Distribution of H2A.Z in PGCs

2.2 macroH2A在原始生殖細(xì)胞進(jìn)入生殖嵴前的分布

通過(guò)對(duì)8.5和10.5 dpc含PGCs組織樣的免疫熒光染色，結(jié)果表明，8.5 dpc PGCs中macroH2A免疫熒光強(qiáng)度很弱（見(jiàn)圖3，8.5 dpc第三張圖片中箭頭所指），PGCs進(jìn)入生殖嵴前后（10.5 dpc）macroH2A的免疫熒光強(qiáng)度與8.5 dpc PGCs中的表達(dá)差異不大（見(jiàn)圖3，10.5 dpc第三張圖片中箭頭所指）。

本文進(jìn)行8.5和10.5 dpc PGCs單細(xì)胞免疫熒光試驗(yàn)。結(jié)果表明，10.5與8.5 dpc單細(xì)胞中macro-H2A的熒光強(qiáng)度相當(dāng)，且8.5和10.5 dpc PGCs的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中macroH2A熒光強(qiáng)度很弱（見(jiàn)圖4）。

圖3 8.5和10.5 dpc含PGCs組織樣中maroH2A的表達(dá)Fig.3 macroH2A in a distribution of paraffin PGCs organization

圖4 8.5和10.5 dpc PGCs中maroH2A的表達(dá)Fig.4 Distribution of macroH2A in PGCs

2.3 H2A.X在原始生殖細(xì)胞進(jìn)入生殖嵴前的分布

通過(guò)對(duì)8.5和10.5 dpc的含PGCs組織樣的免疫熒光染色，結(jié)果表明，8.5 dpc PGCs中沒(méi)有檢測(cè)到H2A.X的熒光（見(jiàn)圖5，8.5 dpc第三張圖片中箭頭所指），PGCs進(jìn)入生殖嵴前后（10.5 dpc）H2A.X的熒光強(qiáng)度與8.5 dpc PGCs中的熒光強(qiáng)度增強(qiáng)（見(jiàn)圖5，10.5 dpc第三張圖片中箭頭所指）。

進(jìn)行8.5和10.5 dpc PGCs單細(xì)胞的免疫熒光試驗(yàn)，結(jié)果表明，10.5與8.5 dpc單細(xì)胞中H2A.X的熒光表達(dá)相當(dāng)，同時(shí)8.5和10.5 dpc PGCs中H2A.X都弱表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中見(jiàn)圖6。

圖5 8.5和10.5 dpc含PGCs組織樣中H2A.X的表達(dá)Fig.5 H2A.X in a distribution of paraffin PGCs organization

圖6 8.5和10.5 dpc PGCs中H2A.X的表達(dá)Fig.6 Distribution of H2A.X in PGCs

3 討論

本文8.5和10.5dpc的PGCs中macro-H2A、H2A.X 和H2A.Z三種組蛋白變體的表達(dá)情況為：①H2A.Z表達(dá)明顯遞增，在10.5 dpc PGCs中H2A.Z主要集中于細(xì)胞核；②macroH2A和H2A.X在此過(guò)程中表達(dá)無(wú)明顯變化，細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中均弱表達(dá)。Suto等研究表明，MacroH2A和H2A.Z不能共定位，組蛋白變異體不能夠在同一個(gè)核小體中裝配[7]。本文研究與Suto結(jié)果一致。分析小鼠PGCs 8.5～10.5 dpc發(fā)育過(guò)程中，H2A.Z是裝配核小體主要變體。

8.5 dpc PGCs中H2A.Z不表達(dá)，Valdes-Mora等研究表明，DNA甲基化和基因組中的H2A.Z之間存在高度負(fù)相關(guān)[8]。在8.5 dpc后，PGCs中DNA胞嘧啶的甲基化和H3K9me2在基因組上廣泛擦除，抑制作用降低。H2A.Z在細(xì)胞質(zhì)中合成，合成H2A.Z很快轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核發(fā)揮作用，與本文觀(guān)察到10.5 dpc PGCs細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核都存在H2A.Z一致。在細(xì)胞核中H2A.Z首先定位于臂間異染色質(zhì)區(qū)域，而H2A在臂間異染色質(zhì)區(qū)域缺失，H2A.Z是臂間異染色質(zhì)重要標(biāo)志[9]。臂間異染色質(zhì)對(duì)染色體分離和胞質(zhì)分裂起重要作用。因此，在8.5～10.5 dpc PGCs中細(xì)胞大量繁殖可能有H2A.Z的參與。

本研究只采用免疫熒光法，對(duì)組織及單細(xì)胞中H2A變體分布情況進(jìn)行研究，雖然在熒光強(qiáng)弱和位置能夠初步判斷H2A變體的表達(dá)，但并不精準(zhǔn)，可在此基礎(chǔ)上做RT-PCR。本文研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，組蛋白及其變體的分布并不只分布在細(xì)胞核裝備核小體，在原始生殖細(xì)胞發(fā)育不同時(shí)間段（8.5和10.5 dpc）三種組蛋白H2A變體macroH2A、H2A.X 和H2A.Z分布位置發(fā)生明顯快速變化。該研究結(jié)果與吳寶江對(duì)中組蛋白H2A變異體在小鼠卵母細(xì)胞和早期胚胎發(fā)育過(guò)程中的變化研究相吻合[10]，證明該研究中三種組蛋白H2A變體分布靈活性和特異性。對(duì)于作為組蛋白裝備核小體組成成分，H2A變體出現(xiàn)在細(xì)胞質(zhì)中有待深入研究。

4 結(jié)論

本文對(duì)小鼠原始生殖細(xì)胞免疫熒光進(jìn)行研究分析，小鼠PGCs從8.5 dpc發(fā)育至10.5 dpc過(guò)程中macroH2A、H2A.X和H2A.Z三種組蛋白變體在細(xì)胞中表達(dá)量及方位變化靈活。在生殖細(xì)胞發(fā)育過(guò)程中，macroH2A、H2A.X和H2A.Z三種組蛋白變體表達(dá)部位不限于細(xì)胞核內(nèi)，有時(shí)在細(xì)胞質(zhì)中也有分布。本文研究結(jié)果與細(xì)胞核裝備核小體結(jié)合，分析推斷H2A.Z可能是裝配核小體主要變體，PGCs大量繁殖可能有H2A.Z參與，尚需深入研究。

[1]Vincent Pasque,Richard P,Halley-Stott,et al.Epigenetic stability of repressed states involving the histone variant macro-H2A revealed by nuclear transfer to Xenopus oocytes[J].Nucleus, 2011,2∶6,533-539.

[2]Banaszynski L A,Allis C D,Lewis P W.Histone variants in metazoan development[J].Dev Cell,2010,19∶662-674.

[3]Gonzalez-Romero R,Rivera-Casas C,Frehlick L J,et al.Histone H2A(H2A.X and H2A.Z)variants in molluscs∶Molecular characterization and potentialimplications for chromatin dynamics[J]. PLoS One,2012,7(1)∶1-9.

[4]Billon P,C?té J.Precise deposition of histone H2A.Z in chromatin for genome expression and maintenance[J].Biochim Biophys Acta, 2012;1819(3/4)∶290-302.

[5]時(shí)小艷,吳寶江,于建寧,等.小鼠原始生殖細(xì)胞遷移過(guò)程中H2A. Z的表達(dá)[J].安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2013(3)∶422-426.

[6]時(shí)小艷,于建寧,吳寶江,等.小鼠原始生殖細(xì)胞（PGCs）遷移過(guò)程中macroH2A的表達(dá)[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué),2013,41(4)∶193-196.

[7]Suto R K,Clarkson M J,Tremethick D J,et al.Crystal structure of a nucleosome core particle containing the variant histone H2A.Z[J]. Nat Struct Biol,2000,7(12)∶1121-1124.

[8]Valdés-Mora F,Song J Z,Statham A L,et al.Acetylation of H2A. Z is a key epigenetic modification associated with gene deregulation and epigenetic remodeling in cancer[J].Genome Res,2012, 22(2)∶307-321.

[9]Rieder C L,Salmon E D.The vertebrate cell kinetochore and its roles during mitosis[J].Trends Cell Biol,1998,8(8)∶310-318.

[10]吳寶江.組蛋白H2A變異體在小鼠卵母細(xì)胞和早期胚胎發(fā)育過(guò)程中的變化[D].南京∶南京農(nóng)業(yè)大學(xué),2010.

Distribution of H2A variants in PGCs before entering the genital ridge

SHI Xiaoyan(Jiangsu Food and Pharmaceutical Science College,Huaian Jiangsu 223003,China)

Before the mouse primordial germ cells into the genital ridge through cell migration, proliferation,in order to further understand the molecular regulation mechanism.In this paper,through the organization of the paraffin section immunity fluorescence dyeing and single cell immunofluorescence staining technique,the distribution of 8.5,10.5 dpcPGCs of histone H2A variants MacroH2A, H2A.Z,H2A.X were studied.The results showed that,8.5-10.5 dpc,the expression of H2A.Z in PGCs was significantly increased,expression of H2A.Z 10.5 dpc in PGCs mainly in the nucleus;but no obvious changes of MacroH2A and H2A.X in the process,expressed in the cytoplasm and nucleus of weak.Comprehensive analysis showed that,8.5-10.5 dpc H2A.Z in PGCs may be the main variant assembly of nucleosomes,PGCs during blooms may participate in the H2A.Z.

H2A variants;PGCs;genital ridge;distribution

S813

A

1005-9369（2014）12-0036-06

時(shí)間2014-12-29 13∶45∶48 [URL]http://www.cnki.net/kcms/detail/23.1391.S.20141229.1345.019.html

時(shí)小艷.進(jìn)入生殖嵴前PGCs中H2A變體的分布[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2014,45(12):36-41.

Shi Xiaoyan.Distribution of H2A variants in PGCs before entering the genital ridge[J].Journal of Northeast Agricultural University,2014,45(12):36-41.(in Chinese with English abstract)

2014-04-23

國(guó)家973重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目（2007CB947403）

時(shí)小艷（1980-），女，講師，碩士，研究方向?yàn)閯?dòng)物遺傳育種。E-mail∶shxy-05@163.com