劉 敏，張 英，張琳琳，蔣 燁，崔 文，姜艷萍，喬薪瑗，唐麗杰，李一經(jīng)

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，哈爾濱 150030；2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，哈爾濱 150030）

虹鱒腸道植物乳桿菌的分離及特性研究

劉 敏1，張 英1，張琳琳1，蔣 燁1，崔 文2，姜艷萍2，喬薪瑗2，唐麗杰2，李一經(jīng)2

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，哈爾濱 150030；2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，哈爾濱 150030）

為篩選一株乳桿菌用于魚類口服疫苗的活載體，研究從健康養(yǎng)殖的虹鱒腸道分離出58株形態(tài)特征不同的菌株，通過革蘭氏染色、氧化酶、觸酶反應(yīng)篩選出18株革蘭氏陽性桿菌，再通過生化反應(yīng)篩選出5株表型不同的菌株。經(jīng)16S rRNA序列同源性分析，5株均為植物乳桿菌。在8%NaCl，0.5%膽鹽，pH 3.0，7 g·L-1胰蛋白酶，10 g·L-1胃蛋白酶，60℃處理10 min時，幾乎不影響菌體存活。5株菌對多種抗生素敏感，對革蘭氏陽性及陰性細(xì)菌均有抑菌活性。通過熒光分子探針cFDA-SE標(biāo)記細(xì)菌，分離株L1212在15 d的檢測期內(nèi)能在虹鱒腸粘膜定植，并有繼續(xù)繁殖傾向。因此，植物乳桿菌L1212可作為益生菌應(yīng)用于虹鱒口服疫苗載體及魚類飼料添加劑開發(fā)。

植物乳桿菌；藥物敏感性；抑菌活性；體內(nèi)定植力；虹鱒

Key words:Lactobacillus plantarum;antibiotic susceptibility;antimicrobial activity;colonization; rainbow trout

乳酸桿菌是一類革蘭氏陽性、不運動、無芽孢、發(fā)酵產(chǎn)生乳酸、過氧化氫酶陰性的細(xì)菌。通常存在于哺乳動物胃腸道[1]，奶制品和海鮮[2]，以及某些植物表面。除極少數(shù)乳酸菌外，大部分乳酸菌都是益生菌。益生菌可通過改善宿主腸道菌群、促進(jìn)生長等影響宿主的健康狀況。來源于哺乳動物乳酸桿菌已被廣泛研究和應(yīng)用，但是魚源腸道乳酸桿菌的研究報道很少。乳酸菌在鳥類及哺乳動物的腸道內(nèi)屬于優(yōu)勢菌群，而魚體內(nèi)的乳酸菌則處于略勢[3]。鏈球菌屬（Streptococcus）、明串珠菌屬（Leuconostoc）、乳酸桿菌屬（Lactobacillus）及肉桿菌屬（Carnobacterium）是健康魚胃腸道內(nèi)正常菌群，特別是肉桿菌在北極紅點鮭（Salvelinus alpinus）、大西洋鮭（Salmo salar）、虹鱒（Oncorhynchus mykiss）及褐鱒（Salmo trutta）腸道內(nèi)容物中均有存在，此外，從河流以及池塘養(yǎng)殖的魚腸道內(nèi)也發(fā)現(xiàn)不同種類乳酸桿菌存在[4]。

近年來，由于抗生素的濫用導(dǎo)致細(xì)菌耐藥性產(chǎn)生，許多學(xué)者提倡用益生菌來替代抗生素[5]，使用益生菌還可激發(fā)機體的非特異性免疫功能[6]。能夠在生產(chǎn)中應(yīng)用的益生菌可耐受各種環(huán)境脅迫，具有較強的抗逆性。選擇來自宿主自身且能夠定植于腸道內(nèi)菌株具有更大優(yōu)勢[7-9]。本研究首次從健康養(yǎng)殖的虹鱒腸道分離乳酸菌，進(jìn)行形態(tài)、生化反應(yīng)及分子鑒定，通過耐受性、藥物敏感性、抑菌活性及體內(nèi)定植試驗，篩選出能夠應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖生產(chǎn)中的魚源乳酸菌。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

植物乳桿菌KLDS1.0344由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)乳品科學(xué)教育部重點實驗室惠贈；大腸桿菌（Colibacillus）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、李斯特菌（Listeria）、巴氏桿菌（Pasteurella）、鼠傷寒沙門氏菌（Salmonella typhimurium）、停乳鏈球菌（Streptococcus dysgalactiae）、海豚鏈球菌（Streptococcus iniae）、遲緩愛德華氏菌（Edwardsiella tarda）、嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila）由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)微生物與免疫實驗室保存。

1.1.2 實驗動物

36周齡健康虹鱒幼魚（平均體重30.58± 4.516 g）購自中國水產(chǎn)科學(xué)院黑龍江省水產(chǎn)研究所渤海試驗站。

1.1.3 引物

根據(jù)已發(fā)表的乳酸桿菌基因組16S rRNA基因序列合成引物，27F（5′AGAGTTTGATCCTGGCTCA G 3′）及1495R（5′CTACGGCTACCTTGTTACGA 3′）引物由哈爾濱博仕生物有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 虹鱒魚腸道乳酸菌的分離

健康的虹鱒幼魚，于（16±1）℃水族箱中飼養(yǎng)。麻醉處死后，用70%乙醇擦洗體表，刮去體表粘液。無菌條件下分離腸道，將腸道用滅菌PBS沖洗3次，去除腸內(nèi)容物，縱向切開腸道，用1 mL滅菌PBS洗去殘余糞便，將腸道剪碎后加入1 mL PBS勻漿，12 000 r·min-1離心5 min。吸取上層液體加入乳酸桿菌選擇性培養(yǎng)基MRS中（9 mL MRS肉湯加入1 mL上清液），37℃靜置培養(yǎng)。觀察菌液渾濁后，10倍倍比稀釋，每一個稀釋度的菌液涂布MRS瓊脂平板，37℃厭氧培養(yǎng)。

挑取單菌落做革蘭氏染色，選擇革蘭氏陽性、不運動、無芽孢、桿狀細(xì)菌，進(jìn)一步進(jìn)行過氧化氫酶、氧化酶和硝酸鹽還原活性實驗，均為陰性者初步判定視為乳酸桿菌。將得到的菌株純化，直到鏡下觀察菌體形態(tài)大小單一、無雜菌，用60%（V/V）甘油保存于-80℃。

1.2.2 乳酸桿菌的鑒定

分離菌株進(jìn)行生化反應(yīng)的表型鑒定，鑒定結(jié)果與《伯杰細(xì)菌分類手冊》[10]作比照后歸類。用細(xì)菌基因組提取試劑盒提取菌株DNA，以乳酸桿菌屬16S rRNA通用引物27F、1495R擴增目的片段。用DNA回收試劑盒純化回收。測定序列后用DNAMAN對序列進(jìn)行分析，并通過Blastn對種屬進(jìn)行鑒定（http://www.ncbi.nlm.nih.gov）。

1.2.3 壓力耐受性試驗

取接種過夜的菌液，用生理鹽水調(diào)至107～108cfu·mL-1；將菌液分別接種于各壓力條件，37℃培養(yǎng)5 h；5 h后，各菌液以PBS進(jìn)行10倍系列倍比稀釋，分別取100 μL涂布MRS營養(yǎng)瓊脂平板，37℃24～36 h后菌落計數(shù)。壓力條件包括：pH 2.0、3.0、4.0及對照5.6；NaCl濃度2、4、6 to 8%（W/V）；牛膽鹽從0、0.1、0.2、0.3、0.4到0.5%（W/V），胰蛋白酶0、1、3、5、7 g·L-1，胃蛋白酶0、4、6、8 到10 g·L-1。此外，溫度耐受性是將菌液接種至MRS肉湯后，分別置于37、60、80、100℃培養(yǎng)10 min，被比稀釋后做菌落計數(shù)。

1.2.4 抑菌活性試驗

采用打孔法對篩選的5株乳桿菌進(jìn)行9種病原菌（致病性大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、李氏桿菌、巴氏桿菌、鼠傷寒沙門氏菌及4株魚源致病菌停乳鏈球菌、海豚鏈球菌、鮰愛德華氏菌、嗜水氣單胞菌）的抑菌活性測試試驗。分離菌株于MRS肉湯中37℃培養(yǎng)24 h，指示菌株于LB肉湯中培養(yǎng)12～16 h。指示菌菌液用LB液體調(diào)整OD600至1.0；將調(diào)好OD600的指示菌菌液涂布LB營養(yǎng)瓊脂平板，100 μL·板-1；待干后，打孔器打孔，4孔·板-1；每孔分別加入分離株菌懸液，37℃靜置向上培養(yǎng)，16～24 h后用游標(biāo)卡尺（0.02 mm精度）測量抑菌圈直徑，以肉眼看不到菌落生長為邊界，記錄結(jié)果。

1.2.5 藥物敏感性試驗

用微生物藥敏紙片（6 mm）測試篩選的5株乳桿菌對8大類24種抗生素的藥物敏感性。當(dāng)抑菌圈直徑大于相應(yīng)抗生素的臨界點時，認(rèn)為對該種抗生素敏感。取培養(yǎng)過夜的菌液，測其OD600，菌液12 000 r·min-1離心5 min；用滅菌生理鹽水重懸菌體，12 000 r·min-1離心3 min；重復(fù)上述步驟；用滅菌生理鹽水調(diào)節(jié)菌體OD600值在0.08至0.1之間；取350 uL調(diào)節(jié)好濃度的菌液涂布MRS瓊脂平板；待干后（約需15 min），貼放標(biāo)準(zhǔn)藥敏紙片，4片·板-1；37℃倒置培養(yǎng)，18～24 h后測量抑菌圈直徑。

1.2.6 定植試驗

5′，6′-羧基二乙酸琥珀酰亞胺酯（cFDA-SE）工作液的配制：按cFDA-SE試劑說明書，將1管A物質(zhì)（cFDA-SE）中加入90 μL B物質(zhì)（DMSO），制備成10 mmol·L-1的儲存液；用滅菌PBS稀釋成50 umol·L-1的工作液（1 μL 10 mmol·L-1儲存液加199 μL無菌PBS）。

虹鱒腸道乳桿菌的標(biāo)記[11]：篩選的乳桿菌菌株L1026、L1212及植物乳桿菌KLDS1.0344（作對照）分別接種MRS肉湯，37℃靜置，厭氧培養(yǎng)至OD600=1.0；菌體培養(yǎng)物4 000 r·min-1離心10 min，無菌PBS洗兩次；菌體沉淀按1∶1的比例加入50 umol·L-1的cFDA-SE和無菌PBS緩沖液，調(diào)整菌體濃度為1010cfu·mL-1，37℃水浴作用25 min；4 000 r·min-1離心10 min，無菌PBS緩沖液洗2次，去除未標(biāo)記上的cFDA-SE熒光標(biāo)記物，用無菌PBS懸浮菌體，加入0.75%甲醛溶液固定，通過流式細(xì)胞儀檢測帶有cFDA-SE標(biāo)記的陽性菌的比例。

動物試驗：平均體重30 g的虹鱒分成3組，15 尾·組-1，飼養(yǎng)于循環(huán)水族箱，水溫（16±1）℃；每尾虹鱒口服灌喂?jié)舛葹?010cfu·mL-1的cFDA-SE標(biāo)記的乳桿菌L1026、L1212及KLDS1.0344（對照）。

在灌喂后1、2、4、6、10及15 d后，每組取3尾處死。在無菌條件下，分別取前、中、后腸，縱向切開，除去腸道食物和糞便殘渣，以1 cm腸段加150 uL無菌PBS的比例反復(fù)沖洗腸道，收集洗液；加0.75%甲醛溶液固定；通過流式細(xì)胞儀檢測洗液中帶有cFDA-SE標(biāo)記的陽性菌比例。

2 結(jié)果與分析

2.1 虹鱒腸道乳酸菌鑒定結(jié)果

從健康養(yǎng)殖的虹鱒腸道共分離出58株形態(tài)特征不同的菌株，通過革蘭氏染色、氧化酶、觸酶反應(yīng)篩選出18株革蘭氏陽性桿菌。對18株菌測定生化反應(yīng)（見表1），篩選出5株表型不同的菌株，進(jìn)行16S rRNA序列同源性分析。經(jīng)DNAMAN分析，5株菌序列同源性＞99%；Blastn比對，5株菌均與已公布的植物乳桿菌序列同源性100%。將序列上傳GenBank，菌株L1026、L1129-1、L1129-2、L1212及G-2的序列登錄號分別為：KF583521，KF583522，KF583523，KF583524及KF583525。

2.2 壓力耐受性試驗結(jié)果

在8%NaCl、0.5%牛膽鹽、pH 3.0，7 g·L-1胰蛋白酶，10 g·L-1胃蛋白酶，以及60℃處理10 min時，仍有106～107菌落存活（見圖1）。但是所有菌株在80或100℃處理10 min后均不能存活。

2.3 抑菌試驗結(jié)果

所篩選的5株魚源乳桿菌對9種致病菌的抑菌圈直徑在11～25 mm之間（見表2）。5株菌對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、李斯特菌、巴氏桿菌、停乳鏈球菌表現(xiàn)出較強的抑制活性，抑菌圈直徑＞16 mm。

表1 虹鱒腸道分離菌生化反應(yīng)結(jié)果Table 1 Biochemical characteristics of Lactobacillus species isolated from the intestines of rainbow trout

圖1 植物乳桿菌在各指標(biāo)中處理5 h后活菌數(shù)Table 1 Survival curves of the Lactobacillus plantarumin after treatment 5h

表2 抑菌試驗結(jié)果Table 2 Antibiotic activity of the isolates against pathogenic bacteria

2.4 藥物敏感性試驗結(jié)果

5株菌表現(xiàn)出廣泛的抗生素敏感性（見表3）。L1026，L1129-1，L1129-2，L1212以及G-2對呋喃妥因（Nitrofurantoin）、麥迪霉素（Midecamycin）、頭孢哌酮（Cefoperazone）、紅霉素（Erythrocin），氯霉素（Chloromycetin）、頭孢他定（Ceftazidime）、頭孢克洛（Cefaclor）、阿莫西林（Amoxicillin）敏感，L1212和G-2對強力霉素（Doxycycline）、米諾環(huán)素（Minocycline）、頭孢噻吩（Cefalotin）、和四環(huán)素（Tetracycline）也敏感。5株菌對萬古霉素（Vancomycin），鏈霉素（Streptomycin）、慶大霉素（Gentamicin）、新霉素（Neomycin）、替考拉寧（Teicoplanin）、卡那霉素（Kanamycin）、氨芐青霉素（Ampicillin）、苯唑西林（Oxacillin）不敏感。

表3 藥敏試驗結(jié)果Table 3 Antibiotic sensitivity of the isolates

2.5 定植試驗結(jié)果

虹鱒體內(nèi)定植結(jié)果見圖2。

由圖2可知，統(tǒng)計各組每天前、中、后腸存留熒光標(biāo)記菌的平均數(shù)。1～4 d，所有組殘留的熒光標(biāo)記菌數(shù)量均呈現(xiàn)下降。分離株L1026的前、中、后腸的熒光標(biāo)記菌平均數(shù)于第6天稍微有所上升，第10天再次下跌，隨后的第15天又增加；L1212的各部位平均熒光菌數(shù)從6～15 d逐漸上升；對照組灌喂植物乳桿菌KLDS1.0344的熒光菌數(shù)在15 d內(nèi)持續(xù)下降。

3 討論與結(jié)論

在野生和人工飼養(yǎng)的淡水魚腸道中均有乳酸菌存在[12]。本研究從養(yǎng)殖的虹鱒腸道內(nèi)分離乳酸菌，通過表型特征鑒定，篩選乳酸桿菌，根據(jù)糖發(fā)酵反應(yīng)的不同從所有分離到的菌株中篩選出5株。由于乳酸桿菌屬內(nèi)，部分種之間的糖發(fā)酵反應(yīng)僅存在細(xì)微差異，這種差異有時不明顯，因此需進(jìn)一步進(jìn)行鑒定[13]。基于16S rRNA序列分析表明5株菌均為植物乳桿菌。植物乳桿菌具有優(yōu)良的益生菌特性[14]，分離出植物乳桿菌的報道已有很多，但從虹鱒腸道內(nèi)分離出植物乳桿菌尚屬首次報道。

能否耐受一系列的環(huán)境壓力，是一株菌能否被用作益生菌的重要參考指標(biāo)[15]。本研究中分離篩選的5株植物乳桿菌進(jìn)入體內(nèi)后，能夠順利通過胃腸道環(huán)境。但是5株菌80℃處理10 min全部死亡，表明分離株不能耐受工業(yè)中飼料加工的溫度壓力，因此，分離的菌株不能直接參與飼料成型過程。

乳酸菌可以作為一種很好的抗生素替代品防治疾病的發(fā)生。本試驗篩選的5株候選益生菌對萬古霉素不敏感，對紅霉素表現(xiàn)高度敏感，這與之前許多學(xué)者對植物乳桿菌的藥敏性報道一致[11,16]。部分菌株表現(xiàn)出對多種抗生素的耐藥性，耐藥性產(chǎn)生機制有待進(jìn)一步研究。從綠青鱈體內(nèi)分離到的植物乳桿菌生長于蘇云金芽孢桿菌培養(yǎng)濾液中時，能夠產(chǎn)生一種物質(zhì)抑制弧菌的生長[17]。David等將非致病性益生菌飼喂感染嗜冷黃桿菌的虹鱒[18]，結(jié)果試驗組與對照組相比死亡率明顯降低（P＜0.05）。5株選定菌株具有廣泛的抑菌活性，不僅能夠抑制革蘭氏陽性菌（金黃色葡萄球菌、李斯特菌、停乳鏈球菌、鏈球菌病鏈球菌），而且對革蘭氏陰性菌（大腸桿菌、巴氏桿菌、鼠傷寒沙門菌、愛德華氏菌、嗜水氣單胞菌）也有較好抑制作用。如能定植于魚消化道中有利于維持腸道正常菌群平衡，改善宿主健康狀況。

粘附是定植的第一步，乳酸菌在哺乳動物胃腸道內(nèi)的粘附表現(xiàn)出宿主特異性。在嚙齒類動物腸道中分離出的乳酸菌不能夠粘附在雞的消化道上，從雞的消化道中分離出的乳酸菌也不能粘附嚙齒類動物的消化道上皮細(xì)胞。抑制病原菌在腸道粘膜的粘附、定植可能是益生菌引起非特異性免疫調(diào)節(jié)的機制。此外，兩種細(xì)菌物質(zhì)之間對粘膜表面受體的競爭取決于細(xì)菌濃度以及細(xì)菌與受體間的親和力[9]。虹鱒口服分離到植物乳桿菌L1026及L1212后能夠定植腸粘膜，且L1212有繼續(xù)繁殖的傾向；而對照組則呈現(xiàn)直線下降趨勢。

本研究分離到的虹鱒腸道植物乳桿菌L1212有優(yōu)良的益生菌特性，可作為微生物制劑在水產(chǎn)養(yǎng)殖上廣泛應(yīng)用。

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Isolation and characterization of indigenousLactobacillus plantarum from rainbow trout intestine

LIU Min1,ZHANG Ying1,ZHANG Linlin1,JIANG Ye1,CUI Wen2,JIANG Yanping2,QIAO Xinyuan2,TANG Lijie2,LI Yijing2(1.School of Animal Sciences and Technology,Northeast Agricultural University,Harbin 150030,China;2.School of Veterinary Medicine,Northeast Agricultural University,Harbin 150030,China)

In order to select a suitable candidate probiotic for use as a live vaccine carrier,58 strains of bacteria with different characters were isolated from the intestine of rainbow trout.By Gram staining,oxidase,catalase reaction,18 Gram-positive bacilli were screened.Then by biochemical reactions,5 strains with different phenotype were carried 16S rRNA sequence analysis,and the results showed that all of the 5 strains wereLactobacillus plantarum.A series of tolerance test was carried out, neither 7 g·L-1trypsin,10 g·L-1pepsin,8%NaCl,0.5%bile,pH 3.0,nor exposure to 60℃for 10 min significantly reduced their survival rates.Five strains exhibited sensitivity to various antibiotics,and inhibited the growth of both Gram-positive and Gram-negative bacteria.The intestinal epithelium of rainbow trout was colonized by cFDA-SE-labeledL.plantarumL1212 at 15 days post-inoculation,and have a potential to continue reproduction.TheL.plantarumL1212 is a suitable candidate probiotic for use as a live vaccine carrier or feed additive for rainbow trout and other fishes.

S965.199

A

1005-9369（2014）12-0024-07

時間2014-12-29 9∶03∶05 [URL]http://www.cnki.net/kcms/detail/23.1391.S.20141229.0903.009.html

劉敏,張英,張琳琳,等.虹鱒腸道植物乳桿菌的分離及特性研究[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報,2014,45(12):24-30.

Liu Min,Zhang Ying,Zhang Linlin,et al.Isolation and characterization of indigenousLactobacillus plantarumfrom rainbow trout intestine[J].Journal of Northeast Agricultural University,2014,45(12):24-30.(in Chinese with English abstract)

2014-04-08

國家自然科學(xué)基金（31372568）；國家科技支撐計劃（2012BAD25B02）

劉敏（1965-），女，教授，博士，研究方向為水產(chǎn)動物疾病及免疫學(xué)研究。E-mail∶liumin-707@163.com