李一經(jīng)，張 博，唐麗杰，姜艷平，陳佩佩

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，哈爾濱 150030）

卷終

PEDV地方流行毒株S1基因的遺傳變異分析及HLJ-2012株免疫原性檢測

李一經(jīng)，張 博，唐麗杰，姜艷平，陳佩佩

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，哈爾濱 150030）

為探討豬流行性腹瀉（Porcine epidemic diarrhea，PED）再次爆發(fā)原因，對現(xiàn)階段黑龍江省和內(nèi)蒙古自治區(qū)的10株豬流行性腹瀉病毒（Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）流行毒株S1基因進(jìn)行擴增、克隆和序列測定，通過序列比對分析其遺傳演化特點。選擇其中一株毒株進(jìn)行中和試驗，對其免疫原性做初步分析。結(jié)果表明，10株P(guān)EDV的S1基因與參考毒株相比，核苷酸同源性為86.8%～99.7%；且S1基因均存在點突變、堿基插入及缺失的情況；構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹表明PEDV毒株在S1基因水平上共分為兩個群，本試驗中的10株均處在G1群，與2011～2012年3株其他地區(qū)毒株CH/SDQD/2011、CH/HBQHD/2011和HuN親緣關(guān)系較近，而與G2群中的經(jīng)典毒株CV777及我國以往報道過的LJB/03等親緣關(guān)系較遠(yuǎn)；通過中和試驗，判斷出新發(fā)毒株HLJ-2012對傳統(tǒng)毒株LJB/03具有一定的中和效應(yīng)，中和效價為1∶53.83。

豬流行性腹瀉病毒；遺傳變異；S1基因；中和試驗

豬流行性腹瀉（Porcine epidemic diarrhea，PED）是由冠狀病毒科豬流行性腹瀉病毒（Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）引起的各種年齡豬以嘔吐、水樣腹瀉、脫水和仔豬高致死率為特征的消化道傳染病，該病在1971年首次報道于荷蘭，隨后許多國家相繼報道[1]，我國于1976年發(fā)現(xiàn)該病[2]。2010年至今，PED在我國許多省份的豬場中流行[3]，大部分豬場都進(jìn)行過疫苗免疫。根據(jù)哈爾濱獸醫(yī)研究所的研究報告顯示，現(xiàn)階段流行毒株大部分為新發(fā)毒株，也有部分毒株與以往爆發(fā)過的毒株相似[4]，說明現(xiàn)地豬場PEDV感染情況較為復(fù)雜。傳統(tǒng)疫苗可能不能對抗流行的新發(fā)毒株。研究表明，PEDV S基因1～2 367 bp（S1）包含病毒主要的中和表位和受體結(jié)合域[5]，這個區(qū)域的變化最能體現(xiàn)病毒的變異情況，因此對PEDV S1基因的研究具有重要意義。

中和試驗具有較高的特異性并且可以分析病毒的抗原性，林志雄等建立PEDV微量中和試驗[6]。采用適應(yīng)于傳代細(xì)胞生長的PEDV-G1株，以PK15（豬腎細(xì)胞）作指示細(xì)胞，48 h判定。研究證實本方法檢驗準(zhǔn)確、可靠、具有較高的敏感性、可用于流行病學(xué)調(diào)查。

2012年3月至2013年12月從黑龍江省和內(nèi)蒙古自治區(qū)10個養(yǎng)殖場共采集10份豬腹瀉病病料，通過RT-PCR擴增出S1基因并對其進(jìn)行克隆和序列測定，分析其與參考毒株的同源性及系統(tǒng)發(fā)育樹分析，研究現(xiàn)階段PEDV的遺傳變異規(guī)律，從基因水平分析豬場PEDV免疫失敗的原因。以Vero細(xì)胞為指示細(xì)胞，通過PEDV HLJ-2012株兔源抗體對傳統(tǒng)毒株LJB/03株的的中和試驗對其免疫原性做初步分析，為PED的綜合防控提供和新疫苗開發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料

2012年3月至2013年12月從黑龍江省和內(nèi)蒙古自治區(qū)10個養(yǎng)殖場共采集10份豬腹瀉病致死的小腸病料，臨床表現(xiàn)為水樣腹瀉，發(fā)抖，死亡豬小腸段充滿黃色液體并膨脹，腸壁變薄。

1.1.2 試劑

胎牛血清，購自呼和浩特市草原綠野生物工程材料有限公司；DMEM營養(yǎng)液、胰蛋白酶（2.5×103μg·mL-1），購自GIBCO公司；TRIzol購自Invitrogen公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、dNTP、LATaqDNA聚合酶、DL2000 DNA Marker、克隆載體pMD18-T vector均購自寶生物工程（大連）有限公司；膠回收試劑盒購自Axygen公司。

1.1.3 Vero細(xì)胞和PEDV分離毒

非洲綠猴傳代腎細(xì)胞（Vero），東北農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)微生物與免疫實驗室保存；PEDV LJB/03株為東北農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)微生物與免疫實驗室經(jīng)蝕斑純化分離并保存[7]，其親緣關(guān)系與經(jīng)典毒株CV777相近，故可定義為傳統(tǒng)毒株。

1.1.4 PEDV檢測抗原

PEDV N基因重組菌由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)微生物與免疫實驗室制備保存[8]。

1.1.5 引物

根據(jù)GenBank中公布的PEDV參考毒株CV777全基因序列（AF353511），設(shè)計擴增S1基因的上游引物S1-f∶5′TAAGTTGCTAGTGCGTAAT 3′和下游引物S1-r∶5′TTTACAACGAGAGTTACCATTA3′，擴增片段大小2 516 bp。

1.2 方法

1.2.1 病毒RNA的提取和cDNA的合成

將小腸內(nèi)容物按1∶5以1×PBS稀釋，充分震蕩后反復(fù)凍融3次，5 000 r·min-1離心10 min，提取上清液中總RNA，按試劑盒說明書合成cDNA，將反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 S1基因的擴增及克隆

PCR在50 μL體系中進(jìn)行。依次加入滅菌29 μL，10×LATaq Buffer 5 μL，2.5 mmol·L-1dNTP 4 μL，LA Taq酶1 μL，引物（含上、下游引物）2 μL，取第一鏈cDNA合成產(chǎn)物7 μL，混勻。采用常規(guī)PCR方法，反應(yīng)程序為95℃預(yù)變性變性5 min，94℃變性1 min，50℃退火1 min，72℃延伸2 min 30 s，30個循環(huán)，循環(huán)結(jié)束后72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)純化回收與pMD18-T載體連接，轉(zhuǎn)化到E.coli、JM109感受態(tài)細(xì)胞中，培養(yǎng)后挑取單個克隆進(jìn)行酶切鑒定和PCR鑒定，重組質(zhì)粒由上海生工生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測序。

1.2.3 序列分析

采用DNAStar和DNAMAN軟件對PEDV HLJ-2012株與株參考毒株的S基因進(jìn)行核苷酸序列分析，采用MAGE5構(gòu)建基因系統(tǒng)發(fā)生樹。

1.2.4 多抗的制備

用1.6中處理的小腸得到的上清液，用0.22 μm濾器過濾除菌后，取上清液1 mL與等量弗氏完全佐劑混合后，充分乳化后對家兔進(jìn)行多點皮下注射；15 d后加弗氏不完全佐劑免疫，劑量同前；15 d后注射病毒液，不加佐劑，劑量同前。三免后心臟采血，4℃靜置過夜，5 000 r·min-1離心10 min，吸出血清，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5 PEDV N蛋白的表達(dá)

按照文獻(xiàn)[7]的方法，表達(dá)并純化N蛋白作為檢測抗原。

1.2.6 間接ELISA試驗檢測血清抗體水平

用pH 9.6包被稀釋液稀釋純化后的N蛋白抗原至2 μg·mL-1，100 μL·孔-1包被酶標(biāo)板，37℃孵育3 h；PBST洗滌3次，5%脫脂乳作為封閉液，200 μL每孔，37℃孵育2.5 h；PBST洗滌3次后，從1∶100開始，2倍倍比稀釋免疫血清，100 μL每孔，置37℃孵育1 h；PBST洗滌3次后，用脫脂乳將羊抗兔酶標(biāo)抗體5 000倍稀釋，100 μL每孔，置37℃孵育1 h；PBST洗滌3次后，加新配制的OPD-H2O2底物顯色液，100 μL每孔，避光置于37℃孵育10 min；2 mol·L-1的H2SO4，50 μL每孔終止反應(yīng)；測定490 nm波長的吸光值，每組設(shè)置2孔，計算平均值。

1.2.7 PEDV LJB/03株TCID50的測定

應(yīng)用參考文獻(xiàn)[9]的方法，采用96孔板細(xì)胞培養(yǎng)板進(jìn)行測定。

1.2.8 病毒中和試驗操作步驟

采用固定病毒稀釋血清法測定，將HLJ-2012兔源陽性血清于56℃30 min以滅活補體，以2倍系列稀釋（1∶2、1∶4、1∶8、1∶16、1∶32、1∶64、 1∶128、1∶256），每個稀釋度125 μL，分別加入到EP管中；然后將病毒稀釋到200 TCID50，加入到血清稀釋管中，每管125 μL混勻，37℃作用1 h；取出已經(jīng)長滿單層的Vero細(xì)胞的96孔細(xì)胞板，向血清和病毒液中加入終濃度為6 μg·mL-1的胰蛋白酶混勻后加入到96孔細(xì)胞板中，50 μL每孔，每個血清稀釋度加入4個平行孔，37℃作用1 h；然后每孔補加維持液，50 μL每孔，37℃培養(yǎng)；逐日觀察并記錄CPE。

設(shè)立對照：為保證試驗結(jié)果的準(zhǔn)確性，每次試驗都必須設(shè)置下列對照。

陽性和陰性血清對照：陽性和陰性血清與待檢血清進(jìn)行平行試驗，陽性血清對照應(yīng)不出現(xiàn)細(xì)胞病變，而陰性血清對照應(yīng)出現(xiàn)細(xì)胞病變。

病毒回歸試驗：每次試驗培養(yǎng)板上都應(yīng)設(shè)立病毒對照，先將病毒作 0.1、1、10、100、1 000 TCID50稀釋，每個稀釋度作4孔。0.1 TCID50應(yīng)不引起細(xì)胞病變，而且100 TCID50必須引起細(xì)胞病變，否則該試驗不能成立。

血清毒性對照：為檢查被檢血清本身對細(xì)胞有無任何毒性作用，設(shè)立被檢血清毒性對照是必要的，即在細(xì)胞中加入低倍稀釋的待檢血清（相當(dāng)于中和試驗中被檢血清的最低稀釋度）。

正常細(xì)胞對照：即不接種病毒和待檢血清的細(xì)胞懸液孔。正常細(xì)胞對照應(yīng)在整個中和試驗中一直保持良好的形態(tài)和生活特征。

結(jié)果判定和計算：當(dāng)病毒回歸試驗，陽性、陰性、正常細(xì)胞對照相，血清毒性對照全部成立時，才能進(jìn)行判定。被檢血清孔出現(xiàn)100%CPE判為陰性，50%以上細(xì)胞出現(xiàn)保護者為陽性，固定病毒稀釋血清中和試驗的結(jié)果是計算出能保護50%細(xì)胞孔不產(chǎn)生細(xì)胞病變的血清稀釋度，該稀釋度即為該份血清的50%中和抗體效價。

2 結(jié)果與分析

2.1 PEDV流行毒株S1基因的擴增

以病料樣品制備的總RNA合成的cDNA為模板，用所設(shè)計的引物S1-f/S1-r對11株P(guān)EDV S1基因進(jìn)行PCR擴增，PCR產(chǎn)物經(jīng)0.8%瓊脂糖凝膠電泳分析，可見到一條大小約為2.5 kb（見圖1）的特異性條帶，其大小與預(yù)期設(shè)計一致，陰性對照沒有此條帶。圖1為部分PCR產(chǎn)物電泳圖。

圖1 S1基因鑒定結(jié)果Fig.1 Identification of S1 gene

2.2 病毒S1基因的克隆和序列分析

將PCR擴增獲得的10個PEDV S1基因經(jīng)純化、回收、與pMD18-T載體連接轉(zhuǎn)化后到JM109感受態(tài)細(xì)胞中，進(jìn)行PCR、酶切鑒定，篩選陽性重組菌落擴大培養(yǎng)，送至上海生工生物工程有限公司進(jìn)行測序。

并根據(jù)樣品采集地點與年份分別命名為HLJ-2012（黑龍江省鶴崗市）、LJ-12-1（黑龍江省哈爾濱市）、LJ-12-2（黑龍江省雙鴨山市）、LJ-12-3（黑龍江省七臺河市）、LJ-12-4（黑龍江寶泉嶺農(nóng)場）、LJ-12-5（黑龍江省雞西市）、LJ-13-1（黑龍江省哈爾濱市）、LJ-13-2（黑龍江省牡丹江市）、LJ-13-3（黑龍江省安達(dá)市）及NMG-2012（內(nèi)蒙古鄂爾多斯市），10株P(guān)EDV S1序列均為2 376個核苷酸，編碼792個氨基酸。10株病毒與13株參考毒株S1基因同源性為86.8%～99.7%（見圖2）。圖2中1：HLJ-2012；2：LJ-12-1；3：LJ-12-2；4：LJ-12-3；5：LJ-12-4；6：LJ-12-5；7：LJ-13-1；8：LJ-13-2；9：LJ-13-3；10：NMG-2012；11：CV777；12：CV777疫苗株；13：Br1/87；14：LJB/03；15：DX；16：CH/ S；17：JS-2004-2；18：83P-5；19：Chinju99；20：NJ；21：CH/HBQHD/2011；22：CH/SDQD/2011；23：HuN。

圖2 PEDV S1基因序列同源性分析Fig.2 Sequence distance of S1 gene of PEDV

與參考病毒株相比，除點突變還存在插入、缺失和重組現(xiàn)象。采用DNAMAN軟件進(jìn)行比較，并截取部分變異比較大的區(qū)域進(jìn)行圖解（見圖3）。與傳統(tǒng)毒株CV777相比HLJ-2012、LJ-12-1、LJ-12-2、LJ-12-3、LJ-12-4、LJ-12-5、LJ-13-1、LJ-13-2、LJ-13-3、NMG-2012同2011～2012年中國流行毒株HuN、CH/SDQD/2011和CH/HBQHD/ 2011一樣在164～165 bp、175～176 bp、184～185 bp、206～207 bp、419～420 bp之間分別有3個、7個、2個、1個、3個核苷酸的插入，第218和481～486 bp之間存在1個和6個核苷酸的缺失。推導(dǎo)的氨基酸，出點突變外，還存在插入、缺失和重組現(xiàn)象，截取部分變異較大區(qū)域進(jìn)行圖解（見圖4）。韓國學(xué)者證明位于S蛋白N端25～88 aa是PEDV受體結(jié)合位點[10]，與CV777株及中國以往爆發(fā)的毒株LJB/03、CH/S、DX等相比較，在這個區(qū)域10株流行毒株在59～62 aa處均插入4個氨基酸，并且導(dǎo)致第55～58 aa氨基酸發(fā)生變化；在140～141 aa存在一個氨基酸的插入；在161～162 aa存在2個氨基酸的缺失，并且導(dǎo)致157～164 aa區(qū)域氨基酸發(fā)生變化。

圖3 利用DNAStar軟件對流行毒株S1基因與參考毒株S1基因序列部分片段的比較分析Fig.3 Comparison of part of S1 gene of PEDV pandemic strains and Reference strains by DNAStar software

圖4 利用DNAStar軟件對流行毒株S1蛋白氨基酸與參考毒株S1蛋白氨基酸部分序列的比較分析Fig.4 Comparison of amino acid sequences of the part of S1 protein of PEDV pandemic strains and reference strains by DNAStar software

2.3 基于S1基因的遺傳演化關(guān)系

用DNAstar軟件Clustal V法進(jìn)行堿基對齊，用MEGA5軟件，根據(jù)GenBank中已發(fā)布的PEDV參考毒株序列與本試驗中10株流行毒株S1基因核苷酸序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，PEDV S1基因共分為2個群（見圖5）本試驗的10株P(guān)EDV（標(biāo)記▲）與2011～2012年3株其他地區(qū)毒株CH/SDQD/2011、CH/ HBQHD/2011和HuN處于同一分枝，親緣關(guān)系較近，定為G1群；其余參考毒株在另一分枝，定為G2群，本群中CV777中國疫苗毒株單獨成枝。從進(jìn)化樹關(guān)系來看，G1群整體獨立成枝，與疫苗毒株親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，而疫苗株與中國以往爆發(fā)的毒株親緣關(guān)系較近，這可能就是2011年2013年爆發(fā)的PEDV造成免疫失敗的原因。

2.4 LJB/03株TCID50的測定結(jié)果

該病毒株的CPE在10-5（100%）和10-6（12.5%）之間，其確切稀釋倍數(shù)可根據(jù)Reed-Muench氏公式計算∶即50%細(xì)胞病變的稀釋度的對數(shù)+稀釋系數(shù)*距離比例距離比例=（高于50%的百分?jǐn)?shù)-50）/（高于50%的百分?jǐn)?shù)-低于50%的百分?jǐn)?shù)）=50/87.5= 0.67，稀釋系數(shù)=-6+5=-3+2=-1，因此該病毒的TCID50應(yīng)是105.67μg·mL-1。

2.5 N蛋白表達(dá)并純化

對經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)并純化的PEDV N蛋白進(jìn)行SDS-PAGE分析，結(jié)果表明所純化的蛋白質(zhì)分子質(zhì)量為49 ku，為N蛋白表達(dá)產(chǎn)物，超聲破碎的上清液中有大量目的蛋白存在，而在沉淀部分只有少量的目的蛋白，說明目的蛋白是以可溶形式出現(xiàn)的，為可溶表達(dá)（見圖6）。經(jīng)比色法測定所純化的蛋白濃度為0.065 mg·mL-1，用包被稀釋液稀釋至2 μg·mL-1后包被酶標(biāo)板。

2.6 間接ELISA檢測家兔體內(nèi)抗體水平

經(jīng)間接ELISA檢測，酶標(biāo)儀讀取OD490nm值，取平行孔平均值，計算P/N大于2為陽性，結(jié)果如圖7所示。根據(jù)間接ELISA檢測結(jié)果得出，效價能達(dá)到1∶12 800，P/N為2.34，說明多抗血清為陽性。

2.7 中和試驗檢測抗體水平

可根據(jù)Reed-Muench兩氏法計算，能保護50%細(xì)胞的血清稀釋度介于25（10-1.5）與26（10-1.8）之間。距離比例=（100-50）/（100-25）=0.77高于50%保護率血清稀釋度的對數(shù)+距離比例×稀釋系數(shù)的對數(shù)=-1.5+0.77×（-0.3）=-1.731，-1.731的反對數(shù)=1/53.83，即陽性血清的中和效價為1∶53.83。

圖6 誘導(dǎo)表達(dá)并純化的重組PEDV N蛋白的SDS-PAGEFig.6 SDS-PAGE analysis of purified recombinant N protein

圖7 兔抗PEDV抗體效價Fig.7 Rabbit anti PEDV antibody titer

3 討論

本試驗對2012年3月～2013年12月間黑龍江省9個、內(nèi)蒙古自治區(qū)1個疑似感染PEDV的發(fā)病豬場調(diào)查的臨床資料和實驗室診斷結(jié)果表明，豬流行性腹瀉存在于黑龍江及內(nèi)蒙古個別地區(qū)，綜合我國其他研究機構(gòu)報道表明，2011～2012年P(guān)EDV除在黑龍江較為流行外，在中國其他大部分省市均有流行，是造成仔豬腹瀉死亡的最主要原因。

纖突蛋白（S）基因是PEDV結(jié)構(gòu)蛋白基因中最大基因，在受體細(xì)胞結(jié)合吸附、膜融合等方面起重要作用；它表面囊膜糖蛋白S既含有介導(dǎo)病毒侵入機體細(xì)胞的受體結(jié)合域，又擁有介導(dǎo)機體產(chǎn)生中和抗體的抗原表位，是誘導(dǎo)機體產(chǎn)生保護性中和抗體的主要免疫蛋白，由于其存在于病毒粒子之外，所以也是變異最大的基因。PEDV S基因在分析現(xiàn)地流行毒株的流行趨勢和遺傳變異中具有重要作用。通過對現(xiàn)地流行毒株S基因的序列分析，可及時了解現(xiàn)地流行毒株是否存在變異，為疫苗株的候選提供理論依據(jù)，有助于弄清楚病毒的遺傳變異情況。動物受到病毒感染后，體內(nèi)產(chǎn)生特異性中和抗體，并與相應(yīng)的病毒粒子呈現(xiàn)特異性結(jié)合，因而阻止病毒對敏感細(xì)胞的吸附，或抑制其侵入，使病毒失去感染能力。中和試驗（Neutralization test）是以測定病毒的感染力為基礎(chǔ)，比較病毒受免疫血清中和后的殘存感染力為依據(jù)，判定免疫血清中和病毒的能力，這種方法可評價病毒株是否具有制成疫苗的潛力。

S蛋白被人為劃分成S1區(qū)（第1～789位氨基酸）和S2區(qū)（第790～1 383位氨基酸）[11]。通過冠狀病毒S蛋白序列比對，發(fā)現(xiàn)PEDV的S2較Sl在序列上更為保守，S1負(fù)責(zé)與特異性受體的識別和結(jié)合，由于不同冠狀病毒侵染不同的類型的宿主細(xì)胞，因此S1結(jié)構(gòu)域具有多樣性。PEDV中和表位區(qū)PS420（COE）也處在S1區(qū)，研究表明，通過乳酸乳球菌表達(dá)的該段蛋白具有免疫中和作用[12]。本試驗獲得10株P(guān)EDV S1基因序列，長度均為2 376 bp，與參考病毒株相比，除點突變還存在插入、缺失的現(xiàn)象。與傳統(tǒng)毒株CV777相比HLJ-2012、LJ-12-1、LJ-12-2、LJ-12-3、LJ-12-4、LJ-12-5、LJ-13-1、LJ-13-2、LJ-13-3、NMG-2012同2011～2012年中國流行毒株HuN、CH/SDQD/2011和CH/ HBQHD/2011一樣在 164～165 bp、175～176 bp、184～185 bp、206～207 bp、419～420 bp之間分別有3個、7個、2個、1個、3個核苷酸的插入，第218 和481～486 bp之間存在1個和6個核苷酸的缺失，這些變化導(dǎo)致S蛋白N端氨基酸發(fā)生很大的變化。通過對比基因序列發(fā)現(xiàn)CV777中國疫苗株S基因較其親本毒株CV777少3個減基，在455～457 bp處，相應(yīng)的S蛋白在aa152缺失1個氨基酸（Y），哈爾濱獸醫(yī)研究所研究人員預(yù)測該氨基酸可能與PEDV毒株的致病性有關(guān)[13]。

PEDV各毒株之間同源性為86.8%～99.7%，本試驗中10株毒與經(jīng)典毒株CV777株的同源性為88.3%～88.9%，說明流行毒株與傳統(tǒng)毒株的S1基因上差別很大。根據(jù)S1基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹將PEDV毒株分為2個群，本試驗中的10株毒均處于G1群，本群中還包括哈爾濱獸醫(yī)研究所提交的3株2011年流行毒株HuN、CH/SDQD/2011和CH/ HBQHD/2011。CV777中國疫苗毒株處在G2群中并且單獨成枝，從親緣關(guān)系上看，疫苗毒株與經(jīng)典毒株CV777以及我國以往報道過的LJB/03等傳統(tǒng)毒株較近，而與現(xiàn)階段流行毒株親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，結(jié)合序列分析結(jié)果來看，很有可能是現(xiàn)地豬場免疫失敗的原因之一。

通過比較S基因序列，發(fā)現(xiàn)HLJ-2012株比LJB/03株多9個堿基，堿基的插入和缺失，導(dǎo)致S蛋白差異很大。S基因系統(tǒng)發(fā)育樹表明LJB/03處在G2-2群，同群的還有經(jīng)典毒株CV777以及中國以往報道過的DX、JS-2004-2等株，從進(jìn)化關(guān)系上可被定義為傳統(tǒng)毒株，與處在G1-1的HLJ-2012親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。本試驗中，制備組織原毒免疫家兔后的抗血清，ELISA檢驗發(fā)現(xiàn)，抗體效價能達(dá)到1∶12 800。本實驗室在2010年通過蝕斑純化技術(shù)，分離出LJB/03株純系病毒，效價可達(dá)105.67·mL-1[7]。通過固定病毒稀釋血清法的中和試驗，表明HLJ-2012株的兔源抗體可以對LJB/03株病毒產(chǎn)生中和效應(yīng)。說明現(xiàn)階段流行毒株HLJ-2012可以培養(yǎng)成疫苗，即使是現(xiàn)地豬場感染傳統(tǒng)毒株，也可起到免疫預(yù)防的效果。

4 結(jié) 論

2012～2013年在黑龍江省與內(nèi)蒙古自治區(qū)共收集10份仔豬腹瀉樣品，經(jīng)RT-PCR檢測，均為PEDV感染，表明在仔豬腹瀉病原中，PEDV主導(dǎo)。10株P(guān)EDV的S1基因均出現(xiàn)插入、缺失情況，導(dǎo)致S蛋白發(fā)生很大變異。PEDV HLJ-2012株兔源抗體能夠中和PEDV傳統(tǒng)毒株LJB/03，中和效價為1∶53.83。

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Genetic variation analysis ofS1 genes of PEDV endemic strains and immunogenicity detection of HLJ-2012 strain

LI Yijing,ZHANG Bo,TANG Lijie, JIANG Yanping,CHEN Peipei(School of Veterinary Medicine,Northeast Agricultural University,Harbin 150030,China)

To explore the possible reason of the PEDV re-outbreaks,the genetic variation characteristic of PEDVS1 genes was analyzed,S1 genes of 10 PEDV strains collected from Heilongjiang Province and Inner Mongolia Autonomous Region were amplified,cloned,sequenced and compared.To make a preliminary immunogenicity analysis,one of the PEDV strains was chosen to perform the neutralization test.It shows that theS1 gene nucleotide homologies of 10 PEDV strains is 86.8%-99.7%compared with the reference ones;and point mutations,insertion,deletion are all existed inS1 genes of the 10 PEDV strains.Phylogenetic tree showed that PEDVS1 genes are divided into two groups on the gene level,10 isolates in this study are all at G1,and have a closely relationship with CH/SDQD/2011,CH/HBQHD/2011 and HuN.While they have a far relationship with classic CV777 and Chinese previous isolates LJB/03 etc.By neutralization test,the newborn strain HLJ-2012 has a neutralizing effect on traditional strain LJB/03,and the neutralization titer was 1∶53.83.

PEDV;genetic variation;S1 gene;neutralization test

S852

A

1005-9369（2014）12-0001-09

時間2014-12-29 9∶02∶24 [URL]http://www.cnki.net/kcms/detail/23.1391.S.20141229.0902.007.html

李一經(jīng),張博,唐麗杰,等.PEDV地方流行毒株S1基因的遺傳變異分析及HLJ-2012株免疫原性檢測[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報, 2014,45(12):1-9.

Li Yijing,Zhang Bo,Tang Lijie,et al.Genetic variation analysis ofS1 genes of PEDV endemic strains and immunogenicity detection of HLJ-2012 strain[J].Journal of Northeast Agricultural University,2014,45(12):1-9.(in Chinese with English abstract)

2014-04-01

“十二五”國家863計劃（2012AA101304-3）；黑龍江省教育廳項目（10543006）

李一經(jīng)（1960-），男，教授，博士，博士生導(dǎo)師，研究方向為獸醫(yī)微生物與免疫學(xué)。E-mail∶yijingli@163.com