常纓，李艷，安玉婷，張志美，王鶴萌，張微

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，哈爾濱 150030）

五大連池地區(qū)香鱗毛蕨自然越冬特性研究

常纓，李艷，安玉婷，張志美，王鶴萌，張微

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，哈爾濱 150030）

探討黑龍江省五大連池地區(qū)香鱗毛蕨越冬機(jī)制，對(duì)其自然越冬過(guò)程中的生理生化特性及超微結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究。結(jié)果表明，香鱗毛蕨相對(duì)電導(dǎo)率和MDA含量先增加后減少；POD、CAT兩種保護(hù)酶活性呈“N”型，SOD活性先降低后升高；脯氨酸和可溶性糖含量均呈“N”型變化，可溶性蛋白含量變化不明顯；ABA含量隨溫度下降而上升，GA3、IAA含量與ABA趨勢(shì)相反；葉片中的葉綠體，體積膨脹變形，基粒片層逐漸不清晰，但未全部解體；線粒體內(nèi)脊數(shù)量明顯減少，雙層膜結(jié)構(gòu)破壞嚴(yán)重，膜邊界模糊，直至膜遭到嚴(yán)重破壞，解體消失。

香鱗毛蕨；自然越冬；生理機(jī)理；保護(hù)酶；抗寒性

香鱗毛蕨（Dryopteris fragrans（L.）Schott）是多年生蕨類植物，以黑龍江省為分布中心，在塔河縣白卡魯山、呼中的大白山高地、牡丹江鏡泊湖及小興安嶺北部高寒地區(qū)均有分布，特別是在五大連池地區(qū)分布廣泛[1]。香鱗毛蕨生境特殊，生長(zhǎng)于火山噴發(fā)后形成的滑石坡、火山周圍巖漿縫中，在低溫環(huán)境可生存[2]。近年來(lái)，研究發(fā)現(xiàn)香鱗毛蕨對(duì)皮膚病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、抑菌等具有很好療效[3-5]，是極具開(kāi)發(fā)潛力和應(yīng)用前景的珍稀天然藥用植物資源，但其藥材來(lái)源靠野生采挖，由于人類盲目采收以及對(duì)熔巖環(huán)境的破壞致使香鱗毛蕨資源不斷減少，野生資源正遭到嚴(yán)重破壞。

植物在自然越冬過(guò)程中對(duì)低溫逆境有一個(gè)適應(yīng)和自我調(diào)節(jié)過(guò)程，低溫促使植物細(xì)胞發(fā)生一系列生理生化變化[6-8]。低溫嚴(yán)重影響香鱗毛蕨的正常生長(zhǎng)發(fā)育，野生香鱗毛蕨主要依靠根狀莖進(jìn)行繁殖并且能自然越冬，獨(dú)特的生理特性增加了香磷毛蕨對(duì)低溫的適應(yīng)能力。

本試驗(yàn)探究五大連池地區(qū)野生香鱗毛蕨自然越冬期間的低溫生理學(xué)適應(yīng)機(jī)制，探討低溫對(duì)香鱗毛蕨生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程生理生化反應(yīng)的影響，對(duì)香鱗毛蕨低溫脅迫下的葉片進(jìn)行超微結(jié)構(gòu)體觀察，為進(jìn)一步了解香鱗毛蕨生長(zhǎng)機(jī)制、指導(dǎo)生產(chǎn)實(shí)踐提供可靠的理論依據(jù)，對(duì)香鱗毛蕨野生資源低溫保護(hù)和可持續(xù)利用具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)樣地越冬期間的氣溫變化

五大連池市位于黑龍江省北部，黑河市南部，地處小興安嶺與松嫩平原的過(guò)渡地帶。東起東經(jīng)127°37′，西至125°42′；南起北緯48°16′，北至49°12′。五大連池氣候特征是冬長(zhǎng)夏短，低溫冷濕，年平均氣溫0℃左右，年平均降水量500 mm左右。平均海拔高度為250～300 m，屬寒溫帶大陸性季風(fēng)氣候，夏季較炎熱，最高日溫可達(dá)34℃，多見(jiàn)于6～8月；冬季較冷，氣溫一般在-20℃左右，最低日溫可達(dá)-36℃，無(wú)霜期121 d。

根據(jù)采集樣品實(shí)際測(cè)量結(jié)果表示，2011～2012年越冬期，五大連池二池地區(qū)最高氣溫出現(xiàn)在2011年10月中旬，為5.8℃，隨后氣溫大幅度下降，到翌年1月左右氣溫達(dá)到最低值，為-28℃，2012年2月、2012年3月氣溫基本與2011年11月、2011年12月氣溫保持一致，2012年3月氣溫回升到0℃，越冬期的6個(gè)月平均氣溫為-7.6℃。各采樣日氣溫變化如圖1所示。

圖1 各采樣日期的氣溫變化Fig.1 Temperature records at each sampling date

1.1.2 材料來(lái)源

野生香鱗毛蕨孢子體植株于2011年10月至2012年3月每個(gè)月中旬赴黑龍江省五大連池二池火山巖地區(qū)采集，采集時(shí)間及外部形態(tài)如表1所示；每次選取長(zhǎng)勢(shì)相同的整株香鱗毛蕨植株10株，混合后分裝并標(biāo)記，迅速放入液氮中冷凍，-80℃保存?zhèn)溆?。每個(gè)樣品3次重復(fù)。

表1 香鱗毛蕨越冬期間外部形態(tài)變化Table 1 Changes of Dryopteris fragrans external morphology during the winter

1.2 方法

1.2.1 測(cè)定指標(biāo)及方法

相對(duì)電導(dǎo)率（Electrical conductivity）采用電導(dǎo)儀法測(cè)定[9]；丙二醛（Malondialdehyde，MDA）含量采用硫代巴比妥酸比色法測(cè)定[10]；超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）采用氮藍(lán)四唑比色法測(cè)定[10]；過(guò)氧化物酶（Peroxidase，POD）活性采用愈創(chuàng)木酚比色法測(cè)定[10]；過(guò)氧化氫酶（Catalase，CAT）采用碘量法測(cè)定[11]；可溶性蛋白含量采用考馬斯亮藍(lán)G-250比色法測(cè)定[11]；可溶性糖含量采用蒽酮比色法測(cè)定[12]；脯氨酸含量采用磺基水揚(yáng)酸提取茚三酮比色法測(cè)定[12]；參照植物生理學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)高效液相色譜法[13]測(cè)定脫落酸（Abscisic Acid，ABA）、吲哚乙酸（Indole-3-acetic acid，IAA）、赤霉素（Gibberellin，GA3）含量，用美國(guó)Waters 600型高效液相色譜儀測(cè)定，測(cè)定條件流動(dòng)相為100%甲醇-水-冰乙酸(體積比為45：54.2：0.8)混合液，流速為1.0 mL·min-1，柱溫為室溫，進(jìn)樣量為20 μL，檢測(cè)波長(zhǎng)為254 nm，定量方法為外標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)曲線法。每個(gè)樣品3次取樣，3次測(cè)量重復(fù)。

1.2.2 葉片超微結(jié)構(gòu)觀察方法

采用透射電鏡方法[14]對(duì)香鱗毛蕨葉片超微結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察，對(duì)越冬期間香鱗毛蕨葉片葉肉部位進(jìn)行取樣，并用戊二醛進(jìn)行前固定，經(jīng)過(guò)清洗、后固定、清洗、脫水、浸透、包埋、修塊、切片、染色等過(guò)程，最后在透射電鏡下對(duì)香鱗毛蕨葉片葉綠體和線粒體進(jìn)行觀察并拍照。

1.2.3 數(shù)據(jù)分析及圖像處理軟件

數(shù)據(jù)均用Microsoft Excel 2003進(jìn)行計(jì)算并制圖，SPSS11.5對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用單因素方差分析進(jìn)行差異顯著性分析，并對(duì)各指標(biāo)進(jìn)行相關(guān)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 越冬期間香鱗毛蕨質(zhì)膜相對(duì)透性和膜脂過(guò)氧化的動(dòng)態(tài)變化

2.1.1 質(zhì)膜相對(duì)透性的動(dòng)態(tài)變化

在低溫下植物的膜結(jié)構(gòu)受到破壞，破壞程度隨溫度的降低而增加，膜的破壞程度可以通過(guò)細(xì)胞內(nèi)電解質(zhì)外滲率，即相對(duì)電導(dǎo)率大小判斷。香鱗毛蕨在自然越冬期間相對(duì)電導(dǎo)率的總體動(dòng)態(tài)變化趨勢(shì)表現(xiàn)為先升后降。如表2所示，從2011年10月五大連池地區(qū)氣溫開(kāi)始持續(xù)下降，冬長(zhǎng)夏短的氣候特征導(dǎo)致深冬季節(jié)環(huán)境溫度變化不大，隨著自然降溫過(guò)程中溫度的降低和低溫持續(xù)時(shí)間的延長(zhǎng)表現(xiàn)為電導(dǎo)率不斷升高，在2011年12月到2012年2月，香鱗毛蕨電導(dǎo)率處于較平穩(wěn)趨勢(shì)，分別為0.33、0.35、0.34，在2012年1月測(cè)量值達(dá)到最大，2月到3月期間，隨溫度的回升，電導(dǎo)率降至0.23。

表2 自然越冬過(guò)程中香鱗毛蕨各項(xiàng)生理指標(biāo)的動(dòng)態(tài)變化Table 2 Dynamic change of various physiological indices of Dryopteris fragrans during the winter

2.1.2 膜脂過(guò)氧化的動(dòng)態(tài)變化

植物在逆境脅迫過(guò)程中，膜脂過(guò)氧化的中間產(chǎn)物自由基和最終產(chǎn)物MDA都會(huì)嚴(yán)重?fù)p傷生物膜。所以，MDA是膜系統(tǒng)受害的標(biāo)志之一，也用于評(píng)價(jià)植物對(duì)低溫條件反應(yīng)的強(qiáng)弱。如表2所示，在自然越冬過(guò)程中隨著自然溫度的下降，2011年10月到2012年1月MDA活性升高，低溫脅迫加劇膜脂過(guò)氧化強(qiáng)度，導(dǎo)致MDA含量由7.63 μg·g-1緩慢增加至11.9 μg·g-1，增加幅度為55.9%；2012年2月至2012年3月，隨著溫度的持續(xù)回升和低溫脅迫逐漸解除，MDA含量也因此從11.25 μg·g-1緩慢下降至10.00 μg·g-1，下降幅度為12.5%。

2.2 越冬期間香鱗毛蕨保護(hù)酶活性的動(dòng)態(tài)變化

2.2.1 超氧化物歧化酶（SOD）活性的變化

SOD是活性氧清除劑中的核心成員，在低溫逆境條件下，SOD能被活性氧誘導(dǎo)產(chǎn)生，從而減輕細(xì)胞膜的受害程度。在自然越冬過(guò)程中，香鱗毛蕨中SOD活性隨著環(huán)境溫度的變化，總體上呈現(xiàn)小幅度的先降后升變化趨勢(shì)，結(jié)果如表2所示。在低溫脅迫下，調(diào)節(jié)適應(yīng)機(jī)制的局限性，超過(guò)一定限度，從2011年10月開(kāi)始，SOD酶活性開(kāi)始隨溫度的降低逐漸變?nèi)酰?012年1月達(dá)到最低值90 U·g-1。2012年2月溫度回升后，香鱗毛蕨植株進(jìn)入生長(zhǎng)階段，SOD活性逐漸升高，促進(jìn)香鱗毛蕨生長(zhǎng)，3月達(dá)到最高值210 U·g-1。

2.2.2 過(guò)氧化物酶（POD）活性的變化

在自然越冬中，如表2所示，香鱗毛蕨中POD酶活性隨時(shí)間的變化總體呈類似“N”型變化趨勢(shì)。2011年11月POD酶活性升高到31.19 U·g-1·min-1，表明隨著溫度的降低，香鱗毛蕨細(xì)胞中H2O2大量積累，從而香鱗毛蕨細(xì)胞中POD酶活性逐漸增強(qiáng)，清除過(guò)剩的H2O2，保護(hù)香鱗毛蕨組織細(xì)胞免受傷害。在2011年12月至2012年2月，POD酶活性一直處于較低水平，最低值出現(xiàn)在2月，為18.67 U·g-1·min-1。隨著溫度回升，POD活性開(kāi)始變強(qiáng)，2012年3月值為25 U·g-1·min-1。

2.2.3 過(guò)氧化氫酶（CAT）活性的變化

在整個(gè)自然越冬采樣期，如表2所示，CAT酶活性同樣呈先升后降再上升的變化趨勢(shì)。2011年11月CAT酶活性從84.15 U·g-1·min-1增加至97 U· g-1·min-1，表明隨著溫度的降低，香鱗毛蕨細(xì)胞中H2O2大量積累，植物為減輕和防止H2O2對(duì)細(xì)胞的傷害，CAT活性逐漸增強(qiáng)，清除過(guò)剩的H2O2，保護(hù)香鱗毛蕨組織細(xì)胞免受傷害。隨后CAT活性開(kāi)始下降，到2012年2月，一直維持較低活性，2012年2月以后，隨氣溫回升，CAT活性開(kāi)始變強(qiáng)，2012年3月達(dá)到最高值125.66 U·g-1·min-1。

2.3 越冬期間香鱗毛蕨滲透調(diào)節(jié)物含量的動(dòng)態(tài)變化

2.3.1 可溶性蛋白含量的變化

隨著溫度降低，如表2所示，香鱗毛蕨中可溶性蛋白含量呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，2011年11月含量達(dá)到1.89 μg·g-1。但隨著越冬時(shí)間的持續(xù)，可溶性蛋白含量小幅度降低，說(shuō)明香鱗毛蕨在抵御外界環(huán)境的變化時(shí)，導(dǎo)致部分蛋白質(zhì)發(fā)生降解，2011年12月以后，可溶性蛋白雖然仍在減少，但變化幅度相對(duì)較小，整體趨勢(shì)趨于平緩。

2.3.2 可溶性糖含量的變化

在自然越冬過(guò)程中，如表2所示，香鱗毛蕨內(nèi)可溶性糖含量隨自然溫度的變化總體表現(xiàn)出“N”型變化趨勢(shì)。2011年10～11月，香鱗毛蕨能夠在低溫誘導(dǎo)下通過(guò)增加組織中可溶性糖的含量增強(qiáng)細(xì)胞保水能力以獲得低溫適應(yīng)性，可溶性糖含量為72.03～74.91 μg·g-1，含量升高7%。隨著寒冬的到來(lái)，可溶性糖含量維持在較低水平，隨后3個(gè)月里，可溶性糖含量緩慢降低，最低值出現(xiàn)在2012年2月，為24.5 μg·g-1。之后隨著溫度回升，可溶性糖含量提高到49.56 μg·g-1，為提高香鱗毛蕨細(xì)胞的吸水能力，適應(yīng)初春溫度變化提供生理?xiàng)l件。

2.3.3 脯氨酸含量的變化

在自然越冬過(guò)程中，如表2所示，香鱗毛蕨中脯氨酸含量呈現(xiàn)先降后升再下降的“N”型變化趨勢(shì)。2011年12月到2012年2月脯氨酸含量一直保持在較低水平，最低值達(dá)到25 μg·g-1，之后隨著溫度的升高升高到46.66 μg·g-1，有助于香鱗毛蕨在較低溫度下生長(zhǎng)，說(shuō)明香鱗毛蕨在受到低溫脅迫后，迅速調(diào)節(jié)體內(nèi)滲透能力以適應(yīng)環(huán)境變化，從而減少低溫對(duì)細(xì)胞的傷害。但隨著脅迫時(shí)間的持續(xù)，脯氨酸含量達(dá)到峰值后又有所下降，這可能是由于低溫脅迫條件下碳水化合物供應(yīng)受阻，影響谷氨酸形成，進(jìn)而影響脯氨酸合成。

2.4 越冬期間香鱗毛蕨葉片內(nèi)源激素含量的動(dòng)態(tài)變化

2.4.1 越冬過(guò)程中香鱗毛蕨ABA含量的變化

如表2所示，在越冬過(guò)程中，香鱗毛蕨中ABA含量經(jīng)歷先升后降的變化趨勢(shì)。隨著越冬過(guò)程中氣溫的降低，香鱗毛蕨中ABA含量在2011年11月達(dá)到最大值23.693 μg·g-1。隨后ABA含量逐漸下降，到2012年3月，ABA含量為6.78 μg·g-1，同2011年11月相比，下降71.38%。

2.4.2 越冬過(guò)程中香鱗毛蕨IAA含量的變化

如表2所示，香鱗毛蕨中IAA含量呈現(xiàn)先降后升的趨勢(shì)。隨著溫度的降低，IAA含量從2011年10月的16.62 μg·g-1下降到2012年1月的1 μg·g-1。然后隨著溫度回升，IAA含量開(kāi)始上升，最大值為13.18 μg·g-1。

2.4.3 越冬過(guò)程中香鱗毛蕨中赤霉素（GA3）含量的變化

如表2所示，香鱗毛蕨中GA3含量整體上呈現(xiàn)先降后升變化趨勢(shì)。隨著溫度的降低，GA3含量從2011年10月的157.21 μg·g-1下降到2012年1月的24.43 μg·g-1。然后隨著溫度的回升，GA3含量的最大值達(dá)到455.12 μg·g-1。

2.5 香鱗毛蕨越冬期間各生理指標(biāo)相關(guān)性分析

如表3所示，在自然越冬過(guò)程中，香鱗毛蕨電導(dǎo)率與MDA含量、可溶性糖含量、SOD活性呈現(xiàn)顯著正相關(guān)，與可溶性蛋白、脯氨酸、POD、CAT、IAA、GA3呈負(fù)相關(guān)；MDA含量與可溶性蛋白含量呈極顯著正相關(guān)，與SOD活性顯著相關(guān)，與脯氨酸含量、POD及CAT活性呈負(fù)相關(guān)，與IAA活性呈極顯著負(fù)相關(guān)，與GA3呈顯著負(fù)相關(guān)；可溶性蛋白含量與可溶性糖含量、POD活性及IAA、GA3呈負(fù)相關(guān)，與SOD活性呈顯著正相關(guān)，與ABA顯著相關(guān)；可溶性糖與脯氨酸含量、POD及CAT活性、IAA及GA3含量呈負(fù)相關(guān)；脯氨酸含量與SOD活性、ABA含量呈正相關(guān)，與CAT活性呈顯著正相關(guān)；SOD活性與POD活性呈顯著正相關(guān)，與ABA含量正相關(guān)；POD與CAT活性與ABA含量正相關(guān)；ABA與IAA及GA3呈負(fù)相關(guān)，而IAA和GA3呈顯著正相關(guān)。

表3 各項(xiàng)生理指標(biāo)相關(guān)性分析Table 3 Correlation analysis of various physiological indices

2.6 越冬期間香鱗毛蕨葉片超微結(jié)構(gòu)變化

2.6.1 葉綠體超微結(jié)構(gòu)的變化

葉片最重要的功能是進(jìn)行光合作用，而葉綠體正是光合作用發(fā)生的場(chǎng)所。由于香鱗毛蕨葉片從12月至翌年3月初均處于萎蔫狀態(tài)，所以本試驗(yàn)對(duì)2011年10～12月的香鱗毛蕨葉片進(jìn)行超微結(jié)構(gòu)觀察。通過(guò)對(duì)香鱗毛蕨葉片葉肉細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)觀察，葉肉細(xì)胞內(nèi)的葉綠體皆緊貼細(xì)胞壁分布，一般呈紡錘形，環(huán)繞在葉肉細(xì)胞四周，葉綠體中含有數(shù)量和大小不等的淀粉粒和嗜鋨顆粒。

2011年10月的香鱗毛蕨葉片中葉綠體為橢圓形或近圓形，被膜清晰，類囊體多，類囊體基粒和片層排列整齊，片層間隙有大小不一的淀粉粒和嗜鋨顆粒，整個(gè)葉綠體結(jié)構(gòu)清晰，見(jiàn)圖版I-a、b。隨著溫度的降低，葉綠體位置并未發(fā)生變化，仍整齊地單行排列在細(xì)胞壁周圍，但葉綠體內(nèi)淀粉粒聚集變少并且變小，基粒片層排列基本整齊，只有少部分有斷裂。到11月時(shí)，葉綠體超微結(jié)構(gòu)遭到嚴(yán)重破壞，基粒片層不清晰，體積膨脹變形，排列位置發(fā)生變化，出現(xiàn)在細(xì)胞中央，見(jiàn)圖版I-d,e，但是并未解體，見(jiàn)圖版I-g，此即香鱗毛蕨葉片在隨后的12月到翌年3月仍有部分呈綠色的原因。

嗜鋨顆粒隨著溫度的降低先聚集增多后逐漸減少，見(jiàn)圖版I-a、d。嗜鋨顆粒是鋨酸與酚類作用形成的物質(zhì)，故嗜鋨顆粒的積累說(shuō)明細(xì)胞中有大量酚類物質(zhì)存在，植物多酚是一類廣泛存在于植物體內(nèi)的次生代謝物質(zhì)，具有較強(qiáng)的氧化活性，可清除植物在逆境條件下細(xì)胞中產(chǎn)生的自由基。

2.6.2 線粒體超微結(jié)構(gòu)的變化

植物可通過(guò)激活細(xì)胞內(nèi)ATP酶的水解活性，增強(qiáng)能量釋放抵御寒冷。線粒體在能量轉(zhuǎn)換中起著其他細(xì)胞結(jié)構(gòu)無(wú)法取代的作用，它與植物低溫適應(yīng)性有密切關(guān)系。

線粒體發(fā)育正常時(shí)呈圓球形，位于葉綠體之間或葉綠體與質(zhì)膜的連接處，數(shù)量不多，具有完整的膜結(jié)構(gòu)，嵴的數(shù)量較多，見(jiàn)圖版I-c。在越冬期間，隨溫度的降低，香鱗毛蕨葉片中的線粒體部分形狀發(fā)生變化，呈橢圓形，內(nèi)脊數(shù)量明顯減少，但膜結(jié)構(gòu)完整。2011年11月時(shí)線粒體已經(jīng)沒(méi)有明顯的內(nèi)脊，雙層膜破壞嚴(yán)重，膜邊界模糊，見(jiàn)圖版I-f。在2011年11～12月份，線粒體嚴(yán)重膨脹，其線粒體膜遭到破壞，最后解體消失見(jiàn)圖版Ⅰ-g）。

圖版Ⅰ 自然越冬期間香鱗毛蕨葉片超微結(jié)構(gòu)變化PlateⅠ Change of leaf ultrastructure of Dryopteris fragrans during the winter

3 討論

3.1 自然越冬對(duì)香鱗毛蕨質(zhì)膜相對(duì)透性和膜脂過(guò)氧化的影響

生物膜系統(tǒng)與植物耐低溫性關(guān)系密切，電解質(zhì)滲透率可以作為一種反映植物細(xì)胞膜受低溫傷害程度的指標(biāo)；膜脂過(guò)氧化產(chǎn)物MDA是另一種反映細(xì)胞膜受傷害程度的指標(biāo)，嚴(yán)重?fù)p傷細(xì)胞膜，這種損傷主要是因?yàn)镸DA與膜中蛋白質(zhì)結(jié)合而引起蛋白質(zhì)分子內(nèi)和分子間的交聯(lián)，引發(fā)膜脂過(guò)氧化程度加劇，細(xì)胞膜透性增大，膜傷害程度增大[15]。香鱗毛蕨在越冬期間相對(duì)電導(dǎo)率與MDA含量均呈現(xiàn)先上升后下降的變化趨勢(shì)，與溫度呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。本試驗(yàn)結(jié)果與沈靜研究結(jié)果[16]一致。

3.2 自然越冬對(duì)香鱗毛蕨保護(hù)酶活性的影響

低溫下植物活性氧代謝的強(qiáng)弱與植物低溫適應(yīng)性關(guān)系密切。低溫脅迫時(shí)，植物體內(nèi)會(huì)產(chǎn)生大量的活性氧自由基，導(dǎo)致膜質(zhì)過(guò)氧化程度增加，造成膜系統(tǒng)的傷害，及時(shí)清除體內(nèi)的活性氧有利于植物抗低溫脅迫，相關(guān)作用的酶類主要有SOD、POD和CAT。本試驗(yàn)結(jié)果表明，酶活性的提高和降低與植物耐低溫性的強(qiáng)弱呈一定相關(guān)性。自然越冬期間香鱗毛蕨SOD活性隨著溫度的變化而變化，呈正相關(guān)，與戴金平等對(duì)黃瓜、已經(jīng)改良過(guò)的番茄幼苗、耐寒性強(qiáng)的葡萄、白三葉的SOD活性的報(bào)道相符合，SOD活性與低溫呈正相關(guān)關(guān)系[17-20]。但是香鱗毛蕨中的POD和CAT活性變化曲線均呈“N”型，可能是因?yàn)橄泖[毛蕨植物組織耐低溫力的大小與自身維持活性氧代謝平衡的能力有關(guān)。但隨著溫度的繼續(xù)降低，各種酶活性開(kāi)始逐漸下降，植物體內(nèi)的氧代謝失調(diào)，細(xì)胞內(nèi)自由基產(chǎn)生和消除的平衡受到破壞而出現(xiàn)自由基積累，并引發(fā)或加劇細(xì)胞膜過(guò)氧化，MDA含量增多，導(dǎo)致香鱗毛蕨酶活性表現(xiàn)出表達(dá)量低的現(xiàn)象，從2011年12月到2012年2月一直維持在較低水平。

3.3 自然越冬對(duì)香鱗毛蕨滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量的影響

在植物抗低溫脅迫過(guò)程中，體內(nèi)會(huì)大量積累各種滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，賦予植物多種滲透調(diào)節(jié)的能力。崔紅等研究表明，香鱗毛蕨在低溫條件下，通過(guò)抗氧化酶和內(nèi)源激素的調(diào)節(jié)，細(xì)胞內(nèi)主動(dòng)積累可溶性糖、可溶性蛋白質(zhì)和游離脯氨酸，使細(xì)胞滲透勢(shì)下降，提高細(xì)胞液濃度，增加束縛水含量，降低冰點(diǎn)，可緩和細(xì)胞質(zhì)過(guò)度脫水，保持細(xì)胞不致遇冷凝固，提高香鱗毛蕨低溫適應(yīng)性。本試驗(yàn)結(jié)果與崔紅等研究結(jié)果[21]一致，但同種植物不同生長(zhǎng)階段對(duì)低溫的適應(yīng)性有很大差異。香鱗毛蕨野生植株中蛋白質(zhì)含量變化不明顯，其他兩種物質(zhì)含量在越冬期間呈“N”型變化，并不隨環(huán)境溫度降低而持續(xù)升高，隨著溫度的繼續(xù)降低，酶活性逐漸下降，由此引起香鱗毛蕨滲透調(diào)節(jié)物的代謝失衡，出現(xiàn)下降趨勢(shì)，從2011年12月到2012年2月一直維持在較低水平。

3.4 自然越冬對(duì)香鱗毛蕨葉片內(nèi)源激素含量的影響

植物內(nèi)源激素被大多數(shù)研究者認(rèn)為是植物對(duì)抗寒基因表達(dá)的啟動(dòng)因子，特別是脫落酸ABA對(duì)植物抗寒力的調(diào)控以及對(duì)維持細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)功能起重要作用[22]。IAA和GA3為促生長(zhǎng)類激素，對(duì)植物生長(zhǎng)發(fā)育主要起促進(jìn)作用，逆境條件下植物一般需要降低生長(zhǎng)速度以度過(guò)不良環(huán)境。楊廣東等研究結(jié)果表明，低溫適應(yīng)性強(qiáng)的植物品種比低溫適應(yīng)性弱的植物品種GA3含量低；溫度越低，抗性較強(qiáng)的辣椒品種ABA含量越高[23]。本研究中，香鱗毛蕨在自然越冬低溫脅迫時(shí)ABA含量升高，而GA3和IAA含量隨著溫度的降低而降低。研究結(jié)果說(shuō)明低溫環(huán)境下香鱗毛蕨能夠通過(guò)調(diào)節(jié)自身的內(nèi)源激素減輕低溫傷害，維持植物體正常生長(zhǎng)及生理代謝功能，表現(xiàn)出一定的耐低溫性。植物生理過(guò)程很大程度上受激素的促進(jìn)作用和抑制作用的平衡調(diào)節(jié)，如ABA與GA3有共同的合成前體，二者的許多生理作用相互拮抗，已知植物的生長(zhǎng)與休眠主要由ABA和GA3調(diào)節(jié)。沈漫利用露地栽培的常春藤為材料進(jìn)行研究，結(jié)果表明露地栽培的常春藤具有較強(qiáng)的低溫適應(yīng)性，其ABA含量顯著高于溫室栽培的常春藤，GA3含量低于溫室栽培的常春藤，ABA/GA3比值與溫度呈負(fù)相關(guān)[24]；黃濤等研究發(fā)現(xiàn)在低溫適應(yīng)性中ABA/GA3的作用比ABA或GA3的絕對(duì)含量更重要，抗性強(qiáng)的水稻品種ABA/GA3比抗性弱的品種變化幅度大[25]。本文結(jié)果同時(shí)表明，隨溫度的降低，野生香鱗毛蕨葉片中ABA/GA3比總體變化為先升高后降低，并且溫度越低，變化幅度越大，與曲凌慧等研究結(jié)果[26]相似。以上結(jié)果表明，內(nèi)源激素ABA、IAA、GA3及ABA/GA3比與香鱗毛蕨低溫適應(yīng)性呈正相關(guān)，初步認(rèn)為其可作為香鱗毛蕨低溫適應(yīng)性的鑒定指標(biāo)。

3.5 自然越冬對(duì)香鱗毛蕨葉片超微結(jié)構(gòu)的影響

香鱗毛蕨葉片中橢球形或圓形的葉綠體結(jié)構(gòu)清晰，隨著入冬季節(jié)溫度的持續(xù)降低，細(xì)胞壁周圍的葉綠體超微結(jié)構(gòu)遭到嚴(yán)重破壞，淀粉粒聚集變少并且變小，光合作用產(chǎn)物減少，基粒片層組織逐漸模糊，組織結(jié)構(gòu)遭到破壞，隨著基粒片層位置的移動(dòng)，細(xì)胞內(nèi)其他物質(zhì)的變化，葉綠體并沒(méi)有解體消失。線粒體在植物的生長(zhǎng)過(guò)程中不斷的提供能量，隨著溫度的降低，線粒體的位置和形狀發(fā)生變化，重要的結(jié)構(gòu)嵴由數(shù)量變少，最后被嚴(yán)重破壞，解體消失。本試驗(yàn)結(jié)果與趙明明對(duì)幾種冬青屬植物抗寒性進(jìn)行比較研究的結(jié)果[27]一致，認(rèn)為隨著脅迫溫度的降低，細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞器逐漸損傷，嗜鋨顆粒增多，葉綠體也逐漸變形扭曲，且位置發(fā)生變化，細(xì)胞器結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性同植株的抗低溫能力呈正相關(guān)，即冷害引起的各類細(xì)胞器結(jié)構(gòu)的變化及其破壞程度，取決于植物的耐低溫性[27-28]。

4 結(jié)論

香鱗毛蕨在越冬期間相對(duì)電導(dǎo)率與MDA含量均呈現(xiàn)先上升后下降的變化趨勢(shì)，與溫度呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。自然越冬期間香鱗毛蕨保護(hù)酶SOD活性隨著溫度的變化而變化，呈正相關(guān)，POD和CAT活性變化呈“N”型。自然越冬期間香鱗毛蕨滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)中可溶性蛋白質(zhì)含量變化不明顯，可溶性糖和游離脯氨酸含量呈“N”型變化。自然越冬期間香鱗毛蕨內(nèi)源激素ABA含量隨著溫度的下降而上升，GA3、IAA含量與ABA變化趨勢(shì)相反，與溫度呈負(fù)相關(guān)。通過(guò)觀察香鱗毛蕨葉片越冬期間的超微結(jié)構(gòu)，葉綠體基粒片層逐漸不清晰，但未消失，線粒體隨溫度的降低，脊數(shù)量明顯減少，雙層膜結(jié)構(gòu)破壞嚴(yán)重，解體消失。

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Study onDryopteris fragrans（L.）Schott live through natural winter in Wudalianchi of erdos/

CHANG Ying,LI Yan,AN Yuting,ZHANG Zhimei,WANG Hemeng, ZHANG Wei(School of Life Sciences,Northeast Agricultural University,Harbin 150030,China)

The overwintering mechanism ofDryopteris fragrans(L.)Schott in Wudalianchi Heilongjiang Province and its physiological and biochemical characteristics as well as ultrastructure were carried out in this study.The results showed thatD.fragransrelative electrical conductivity and content of MDA increased at first and decreased,activity of POD,CAT both generally rised to form into the"N" curve,activity of SOD declined and then increased,content of proline,soluble sugar and soluble protein all presented as the"N"curve.The ratio of ABA/GA3was related closer with low temperature adaptability.The volume of leaf chloroplast expanded into deformation,the granum lamella gradually fuzzied,but not all became collapsed.The number of mitochondria ridge obvious reduced,and double membrane structure were serious destoried.Membrane border fuzzied until they were severely damaged and collapses into disappear finally.

Dryopteris fragrans(L.)Schott;natural overwintering;physiological mechanism;protective enzyme;cold resistance

S828；Q782

A

1005-9369（2014）08-0041-08

2014-03-03

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31070291)

常纓（1970-），女，教授，博士，博士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)橹参镔Y源學(xué)與植物分子生物學(xué)。E-mail:changying@neau.edu.cn

時(shí)間2014-7-26 14:32:52[URL]http://www.cnki.net/kcms/detail/23.1391.S.20140726.1432.003.html

常纓,李艷,安玉婷,等.五大連池地區(qū)香鱗毛蕨自然越冬特性研究[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2014,45(8):41-48.

Chang Ying,Li Yan,An Yuting,et al.Study onDryopteris fragrans(L.)Schott live throughnatural winter in Wudalianchi of erdos[J].Journal of Northeast Agricultural University,2014,45(8):41-48.(in Chinese with English abstract)