黃林靜 黎關龍 鄭夢曉 馬迎春 金可可 王萬鐵

研究表明，肺動脈平滑肌細胞(pulmonary artery smooth muscle cells，PASMCs)上存在多種氯離子通道，但是其中含量最多的為容量激活性氯離子通道(volume activated chloride channels，CLC3)，并且CLC3在肺動脈平滑肌細胞的增殖方面起到了非常重要的作用［1］。低氧可以引起大鼠肺動脈平滑肌細胞上JNK、ERK1/2 和p38MAPK 這3 類酶的激活［2］。而目前關于氯離子通道功能及其表達上下游信號通路研究的文獻報道相對較少。本實驗利用細胞培養(yǎng)方法觀察了容量激活性氯離子通道在大鼠低氧性PASMCs 中mRNA 和蛋白表達的變化，并探討其與p38 絲裂原活化蛋白激酶(p38 mitogen activated protein kinase，p38MAPK)信號通路的關系。

材料與方法

1.材料:SPF 級健康雄性Sprague - Dawley(SD)大鼠10只，體質(zhì)量為200 ±50g，由溫州醫(yī)科大學實驗動物中心提供實驗動物許可證號:SCXK(浙)2010 -0101 號。

2.試劑及儀器:SB203580 (美國Sigma 公司);茴香霉素(Anisomycin，美國Sigma 公司);二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO 上海申工生物技術有限公司);胎牛血清、DMEM高糖培養(yǎng)基、胰酶/EDTA(美國Gibco 公司);SM -α -actin 鼠單克隆抗體、辣根過氧化物酶(HRP)標記的羊抗兔二抗(英國abcam 公司);HRP 標記β-actin(上?？党枪?;CLC3 兔抗鼠多克隆抗體(美國Sigma 公司);RT - PCR 試劑盒、50bp DNA Marker(Fermentas life sciences 公司);BCA 蛋白定量試劑盒、增強化學發(fā)光試劑盒(美國Pierce 公司);RT -PCR 引物(上海生工生物工程技術服務有限公司);PVDF 膜(美國，Milipore 公司);彩色預染蛋白maker(MBI，F(xiàn)ermentas 公司)。低氧培養(yǎng)箱(Herareus，美國);顯微外科用顯微鏡(Olympus，日本);生物倒置相差顯微鏡XDS-1B(重慶光學儀器設備廠);蛋白電泳轉(zhuǎn)移系統(tǒng)(Bio -Rad 公司);穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀(DYY-3 型，北京六一儀器廠);EXL -808 酶標儀(USA);恒溫二氧化碳培養(yǎng)箱(Thermo Forma，美國);凝膠定量軟件Quantity One(Bio-Rad 公司);722N 分光光度計(上海精密科學儀器有限公司);PCR 儀(Thermo Hybaid，美國)。

3.方法:(1)PASMCs 的獲取和處理:①酶消化法提取PASMCs;②PASMCs 的傳代培養(yǎng);③PASMCs 的凍存和復蘇;④PASMCs 存活率的測定;⑤差異貼壁法純化細胞［3］。(2)PASMCs 的鑒定:倒置相差顯微鏡下觀察細胞形態(tài)并攝片;激光共聚焦免疫熒光染色法分別檢測PI 標記的細胞核及FITC標記的平滑肌α-actin 抗體。(3)實驗分組:實驗所用為4 ～6 代肺動脈平滑肌細胞，實驗前要將所有細胞置于無血清培養(yǎng)基饑餓24h，分為5 組:①常氧組(N):DMEM 5%CO2，21%O2，37℃48h;②低氧組(H):DMEM 5% CO2，2% O2，37℃，48h;③DMSO 對照組(D):0.05% DMSO，5% CO2，2% O2，37℃48h;④SB203580 干預組(SB):10μmol/L SB203580，5%CO2，1% O2，37℃48h;⑤Anisomycin 干預組(A):10μmol/L Anisomycin，5% CO2，2% O2，37℃48h。以上每組6 皿細胞。(4)PASMCs CLC3 的蛋白和mRNA 表達的檢測:①蛋白免疫印跡法檢測PASMCs CLC3 的蛋白含量;②RT-PCR 法檢測PASMCs CLC3 的mRNA 表達［3］。

4.統(tǒng)計學方法:應用SPSS 17.0 統(tǒng)計軟件分析，數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差(±s)形式表示，組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，方差齊性者兩兩比較采用LSD 法，方差不齊者進行Dunnet't 檢驗，以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

1.原代培養(yǎng)大鼠PASMCs 的培養(yǎng)和鑒定:(1)細胞形態(tài)學生長特點:原代的肺動脈平滑肌細胞為貼壁細胞，呈典型的“峰-谷”狀生長(圖1)。(2)免疫細胞熒光法鑒定PASMCs:發(fā)綠色熒光呈細絲狀的為肺動脈平滑肌細胞的α-肌動蛋白，紅色卵圓形的為肺動脈平滑肌細胞的細胞核(圖2)。(3)臺盼藍染色結(jié)果:消化傳代的肺動脈平滑肌細胞存活率為96.7%，凍存后復蘇的肺動脈平滑肌細胞存活率為83.3%。

圖1 大鼠原代培養(yǎng)肺動脈平滑肌細胞(×100)

圖2 大鼠肺動脈平滑肌細胞免疫熒光鑒定(×400)

2. 各組PASMCs 上CLC3 mRNA 表達的變化:(1)低氧對PASMCs 上CLC3 mRNA 表達的影響:H組CLC3 mRNA 表達量顯著增加，與N 組相比，有統(tǒng)計學差異(0.784 ±0.011 vs 1.114 ±0.009，P ＜0.01)(圖3、圖4)，即低氧能增加CLC3 mRNA 的表達。(2)低氧條件下SB203580 對PASMCs 上CLC3 mRNA表達的影響:與N 組相比，D 組、SB 組和A 組CLC3 mRNA 表達均顯著上調(diào)(P ＜0.01 和P ＜0.05)。與H 組相比，D 組CLC3 mRNA 的表達無統(tǒng)計學差異(1.114 ±0.009 vs 1.119 ±0.003，P ＞0.05)。與D組相比，SB 組CLC3 mRNA 的表達顯著上調(diào)(1.119±0.003 vs 1.322 ±0.027，P ＜0.01)，A 組CLC3 mRNA 的 表 達 顯 著 下 調(diào)(1. 119 ± 0. 003 vs 0. 846 ±0.047，P ＜0.01)(圖3、圖4)，即 低 氧 條 件 下SB203580 能增加CLC3 mRNA 的表達。

圖3 各組細胞CLC3 mRNA 的表達

圖4 各組細胞CLC3 mRNA 表達變化的比較(±s，n=6)

3.各組PASMCs 上CLC3 蛋白表達的變化:(1)低氧對PASMCs 上CLC3 蛋白表達的影響:與N 組相比，H 組CLC3 蛋白的表達均明顯上調(diào)，差異有統(tǒng)計學意義(0.392 ±0.004 vs 0.525 ±0.029，P ＜0.01)(圖5、圖6)，即低氧能增加CLC3 蛋白的表達。(2)低氧條件下SB203580 對PASMCs 上CLC3 蛋白表達的影響:與N 組相比，D 組和SB 組和A 組CLC3 蛋白表達均明顯上調(diào)(P ＜0. 01)。與H 組相比，D 組CLC3 蛋白表達略微下調(diào)，差異無統(tǒng)計學意義(0.525±0.029 vs 0.522 ±0.017，P ＞0.05)。與D 組相比，SB 組CLC3 蛋白的表達顯著上調(diào)(0.522 ±0.017 vs 0.593 ±0.030，P ＜0.01)，A 組CLC3 蛋白的表達下調(diào)，但差異無統(tǒng)計學意義(0.522 ±0.017 vs 0.487 ±0. 029，P ＞0. 05)(圖5、圖6)，即低氧條件下SB203580 能增加CLC3 蛋白的表達。

圖5 各組細胞CLC3 蛋白的表達

討 論

圖6 各組細胞CLC3 蛋白表達變化的比較(±s，n=6)

氯離子是肺動脈平滑肌細胞內(nèi)外分布最廣泛的陰離子，細胞膜氯離子的靜息通透性相對較大，血管平滑肌細胞氯離子平衡電位(約-34mV)比靜息膜電位(約-55mV)高［4］。本實驗室前期研究顯示，加入氯離子通道阻滯劑能明顯減輕肺動脈的持續(xù)收縮，故氯離子通道在肺動脈血管收縮方面起到了非常重要的作用［5］。平滑肌細胞的增殖是構(gòu)成肺動脈高壓及各種血管疾病的關鍵因素，Qian 等［6］研究證明，靜態(tài)壓力促進大鼠主動脈平滑肌細胞增殖，是通過上調(diào)CLC3 來實現(xiàn)的。Hisadome 等［7］研究發(fā)現(xiàn)，CLC3 阻斷劑可顯著抑制各類血管的生成，而且CLC3 還與各種生物體的跨膜氯離子轉(zhuǎn)運及相關物質(zhì)分泌密切相關。本研究發(fā)現(xiàn):在低氧條件下，PASMCs 上CLC3 mRNA 和蛋白的表達量明顯高于常氧條件下的表達量(P ＜0. 01)，表明低氧可上調(diào)大鼠PASMCs 上CLC3 mRNA 和蛋白的表達，低氧性肺動脈高壓的形成可能與CLC3 有關。

p38MAPK 是MAPK 家族的一員，是生物體內(nèi)重要的信號系統(tǒng)之一。它是缺血、低氧、激素、生長因子及細胞因子等各種細胞外刺激誘導基因表達、細胞增殖分化、轉(zhuǎn)化及凋亡等信息傳遞途徑的交匯點和共同通路［8］。對于p38MAPK 現(xiàn)在研究比較多的是其對細胞的凋亡作用［9］。梁瑛琦等［10］研究發(fā)現(xiàn)，在慢性低氧狀態(tài)下肺小血管壁p38MAPK 蛋白和mRNA 的表達量顯著增高，可能參與了大鼠肺動脈高壓形成的病理生理過程。本實驗結(jié)果顯示，使用p38MAPK 通路抑制劑SB203580 后，PASMCs 中CLC3 mRNA 和蛋白表達水平均上調(diào)，明顯高于DMSO 對照組(P ＜0.01)。應用p38MAPK 通路激活劑Anisomycin 后，PASMCs 中CLC3 mRNA 表達水平顯著下調(diào)，明顯低于DMSO 對照組(P ＜0.01)，蛋白表達輕微下調(diào)(P ＞0.05)。以上結(jié)果提示，SB203580 可上調(diào)PASMCs 上CLC3 mRNA 和蛋白的表達，Anisomycin 能下調(diào)PASMCs 中CLC3 mRNA 和蛋白的表達。由此推測p38MAPK 可能是CLC3 的上游分子并且可調(diào)控其表達水平。

1 Liang W，Huang L，Zhao D，et al. Swelling-activated Cl- currents and intracellular CLC-3 are involved in proliferation of human pulmonary artery smooth muscle cells［J］.J Hypertens，2014，32(2):318-330

2 Jin N，Hatton N，Swartz DR，et al. Hypoxia activates jun-N-terminal kinase，extracellular signal - regulated protein kinase，and p38 kinase in pulmonary arteries［J］. Am J Respir Cell Mol Biol，2000，23(5):593 -601

3 黃林靜，黎關龍，何金波，等. 鈣激活性氯離子通道在大鼠低氧高二氧化碳性PASMCs 中的表達及與MAPK 通路的關系［J］.中國細胞生物學學報，2013，35(9):1321 -1327

4 陳曉琳，尹松梅.血小板氯通道［J］. 中國病理生理雜志，2004，20(5):909 -912

5 黃林靜，何金波，王淑君，等. 尼氟滅酸在大鼠低氧高二氧化碳性肺血管收縮中的作用［J］. 中國應用生理學雜志，2014，30(1):74 -78

6 Qian JS，Pang RP，Zhu KS，et al. Static pressure promotes rat aortic smooth muscle cell proliferation via upregulation of volume-regulated chloride channel［J］. Cell Physiol Biochem，2009，24(5 -6):461 -470

7 Hisadome K，Koyama T，Kimura C，et al. Volume - regulated anion channels serve as an auto/paracrine nucleotide felease pathway in aotric endothelial cells［J］. J GenPhysiol，2002，119(6):511 -520

8 劉忠，李閃，朱建華，等.不同年齡高血壓大鼠血管平滑肌中ERK和MKP-1 的表達［J］. 中國病理生理雜志，2006，22(3):468 -471

9 Jiang Q，Li F，Shi K，et al. ATF4 activation by the p38MAPK -eIF4E axis mediates apoptosis and autophagy induced by selenite in Jurkat cells［J］.FEBS Lett，2013，587(15):2420 -2429

10 梁瑛琦，賈旭廣，王萬鐵，等.三七總皂苷對低氧大鼠肺動脈壓和肺組織p38MAPK 表達的影響［J］. 中國病理生理雜志，2010，26(12):2438 -2441