俞楠澤 龍 笑 白 明 王曉軍

創(chuàng)面愈合具有非常復(fù)雜調(diào)控機(jī)制，許多內(nèi)源性或外源性的因素均可影響其生物學(xué)過程，其中糖尿病是最為常見的不利因素。約15%的糖尿病患者會(huì)產(chǎn)生糖尿病性潰瘍創(chuàng)面，其中84%的患者會(huì)經(jīng)歷截肢［1］。促進(jìn)血管化，增加創(chuàng)面血供是治療糖尿病創(chuàng)面的關(guān)鍵之一。小分子RNA(miRs)是一類內(nèi)源性的、小的、非編碼RNA，在轉(zhuǎn)錄后水平通過抑制基因表達(dá)調(diào)節(jié)細(xì)胞活動(dòng)［2］。miR-26a 是新發(fā)現(xiàn)的具有血管生成抑制作用的miR，利用抑制劑阻斷其表達(dá)后，心肌梗死模型中血管新生增加兩倍，因此，miR-26a 被認(rèn)為是缺血性疾病的治療新靶點(diǎn)［3］。但miR -26a 在糖尿病模型中的表達(dá)和調(diào)控血管新生的作用，尚未見報(bào)道。在本研究中，筆者檢測了糖尿病小鼠與非糖尿病小鼠創(chuàng)面組織中miR -26a 的表達(dá)差異，并將外源性miR-26a 抑制劑應(yīng)用于糖尿病小鼠全層皮膚缺損創(chuàng)面，探討其對(duì)傷口愈合的影響。

材料與方法

1.實(shí)驗(yàn)材料:清潔級(jí)雄性7 ～8 周齡C57/BL6 小鼠6 只，db/db 糖尿病小鼠18 只，均購于Jackson 實(shí)驗(yàn)室。mmu -miR-26a-5p 抑制劑和陰性對(duì)照劑(廣州銳博生物科技有限公司)，氯胺酮(美國Phoenix 公司)，甲苯噻嗪(美國AnaSed 公司)，CD31 抗體(美國BD Biosciences 公司)，Tegaderm 透明敷料(美國3M 公司)，mirScript 試劑盒(美國Qiagen 公司)，TRIzol 試劑(美國Invitrogen 公司)，DAB 顯色試劑盒(武漢博士德公司)。

2.實(shí)驗(yàn)方法:(1)小鼠全層皮膚缺損創(chuàng)面模型建立和處理:腹腔注射氯胺酮90mg/kg +甲苯噻嗪:9mg/kg 麻醉，電動(dòng)剃刀和脫毛膏脫去背部所有毛發(fā)。在小鼠背部正中偏尾側(cè)制造1cm×1cm 皮膚全層缺損創(chuàng)面，注意徹底去除皮下的肉膜層，直至肌膜淺面，以阻止創(chuàng)面收縮。隨機(jī)抽取糖尿病小鼠6 只與C57 小鼠組成糖尿病組和非糖尿病組，3 天后取創(chuàng)面組織行RT-PCR 檢測。將余下12 只糖尿病小鼠隨機(jī)分為兩組:miR-26a 抑制劑組和對(duì)照組，分別用1ml 注射器25G 針頭均勻注射濃度為50μmol/L 的miR-26a 抑制劑和陰性對(duì)照劑，每邊0.1ml。并在創(chuàng)面基底注射0.1ml 的相應(yīng)試劑。所用動(dòng)物模型作相應(yīng)處理后用Tegaderm 透明敷料覆蓋創(chuàng)面。術(shù)后單籠飼養(yǎng)。(2)RT-PCR:糖尿病組和非糖尿病組在術(shù)后3天處死，取創(chuàng)面皮膚樣本，勻漿，TRIzol 法提取總RNA，通過瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA 質(zhì)量，紫外分光光度計(jì)來測定總RNA 的濃度。用mirScript 試劑盒檢測miR -26a 的表達(dá)。以內(nèi)源性U6 作為內(nèi)參，ΔΔCT 法計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。(3)創(chuàng)面愈合觀察:密切觀察創(chuàng)面愈合情況，miR -26a 抑制劑組和對(duì)照組于術(shù)后0、3、7、10 天更換敷料，創(chuàng)面拍照的同時(shí)用透明薄膜描印創(chuàng)面。Image J 軟件分析創(chuàng)面面積，計(jì)算創(chuàng)面愈合的百分率。其計(jì)算公式為:創(chuàng)面愈合率(%)=(初始創(chuàng)面面積-觀察日創(chuàng)面面積)/初始創(chuàng)面面積×100%。(4)常規(guī)HE 染色和免疫組化染色:①常規(guī)HE 染色:于創(chuàng)面建立后第10 天取材，標(biāo)本甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋切片、脫蠟后行HE 染色觀察創(chuàng)面新生組織中皮膚、肉芽等結(jié)構(gòu)，測量創(chuàng)面肉芽組織的厚度;②CD31 免疫組化染色:石蠟切片經(jīng)抗原修復(fù)和血清封閉后在切片上滴加大鼠抗小鼠抗體，濃度為1∶100，4℃過夜。次日滴加兔抗大鼠二抗，濃度1∶200，DAB 顯色，蘇木素復(fù)染，陽性細(xì)胞呈棕黃色。中性樹脂封片。結(jié)果判定時(shí)各組創(chuàng)面隨機(jī)選取6 張切片，在高借鏡下數(shù)出每張切片中的所有陽性細(xì)胞數(shù)。由3 位有經(jīng)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)人員分別計(jì)數(shù)，取平均值作統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

3.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法:采用SPSS 11.0 統(tǒng)計(jì)軟件，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示。采用t 檢驗(yàn)分析組間差異，以P ＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1.miR-26a 的表達(dá):創(chuàng)面模型建立后3 天，db/db 組miR-26a 表達(dá)水平是C57 組的2.02 ±0.02 倍(P ＜0.05)，表明糖尿病小鼠體內(nèi)的miR -26a 含量明顯高于非糖尿病小鼠(圖1)。對(duì)照組miR-26a 表達(dá)水平是miR - 26a 抑制劑組的22. 08 ± 0. 10 倍(P ＜0. 01)，表明局部注射miR - 26a 抑制劑后，miR-26a 的表達(dá)被明顯抑制(圖2)。

2.創(chuàng)面愈合速度:創(chuàng)面模型建立后第3 天起miR-26a 抑制劑組創(chuàng)面愈合百分率高于對(duì)照組，但差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＞0.05)。術(shù)后10 天，兩組動(dòng)物創(chuàng)面均有50%以上開放性創(chuàng)面，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＞0.05，圖3、圖4)。

圖1 糖尿病小鼠和非糖尿病小鼠創(chuàng)面組織中miR-26a 的表達(dá)水平

圖2 miR-26a 抑制劑組和對(duì)照組小鼠創(chuàng)面組織中miR-26a 的表達(dá)水平

圖3 不同時(shí)間點(diǎn)創(chuàng)面愈合情況

圖4 不同時(shí)間點(diǎn)創(chuàng)面愈合百分率比較

3.HE 染色:術(shù)后第10 天，miR-26a 抑制劑組創(chuàng)面內(nèi)肉芽組織較對(duì)照組明顯增厚，細(xì)胞層次增多。經(jīng)測量，miR-26a 抑制劑組創(chuàng)面肉芽組織厚度為對(duì)照組的2.3 倍(P ＜0.05，圖5)。

4.免疫組化染色:CD31 主要表達(dá)于血管內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)，呈棕黃色顆粒狀。miR-26a 抑制劑組和對(duì)照組每張切片內(nèi)的新生血管數(shù)分別為47.8 ±13.2 和30.5±6.6，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＞0.05，圖6)。

討 論

圖5 術(shù)后10 天常規(guī)HE 染色(×100)

圖6 術(shù)后10 天CD31 免疫組化染色(×100)

隨著生活水平提高和飲食結(jié)構(gòu)的改變，糖尿病發(fā)病率逐漸上升，臨床中的糖尿病潰瘍創(chuàng)面患者也隨之增多［4］。在正常的創(chuàng)面愈合過程中，新生的和遷移的成纖維細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞和巨噬細(xì)胞等形成的肉芽組織構(gòu)成了創(chuàng)面床。細(xì)胞外基質(zhì)的沉積和成纖維細(xì)胞分泌的生長因子促進(jìn)了血管內(nèi)皮細(xì)胞新生血管并滋養(yǎng)肉芽組織。由血管內(nèi)皮細(xì)胞參與的血管新生過程在整個(gè)創(chuàng)面愈合的過程中發(fā)揮著重要的作用［5］。然而糖尿病引發(fā)微血管基膜增厚，導(dǎo)致炎性細(xì)胞黏附在微血管內(nèi)膜上，創(chuàng)面局部抗感染能力下降。局部血液供應(yīng)的減少并伴隨著靜脈血管回流功能的下降，使創(chuàng)面局部缺血缺氧，創(chuàng)面愈合進(jìn)程不能按照有序的生物學(xué)步驟進(jìn)行，繼發(fā)不愈［6，7］。所以，糖尿病創(chuàng)面常常具有創(chuàng)面較深、繼發(fā)感染、肉芽脆弱、反復(fù)發(fā)作、長期不愈等特征。因此，探索糖尿病難治性創(chuàng)面的機(jī)制并尋找積極而合理的治療方法一直是研究的熱點(diǎn)和難點(diǎn)。

Jackson 實(shí)驗(yàn)室在C57/BL6 小鼠上發(fā)現(xiàn)糖尿病是位于4 號(hào)染色體的瘦素受體基因突變所致，并在此基礎(chǔ)上建造的db/db 糖尿病小鼠是現(xiàn)今最成熟的糖尿病小鼠模型。db/db 小鼠主要表現(xiàn)為下丘腦缺陷，對(duì)瘦素缺乏反應(yīng)，不能產(chǎn)生飽感，導(dǎo)致合成代謝大于分解代謝，脂肪堆積，最終發(fā)展為嚴(yán)重的糖尿病伴有明顯的高糖血癥。此模型具有和人類2 型糖尿病患者類似的臨床癥狀:多飲、多食、多尿、肥胖、高血糖、高胰島素血癥、胰島素抵抗、脂質(zhì)代謝異常等［8］。

miR 在轉(zhuǎn)錄后水平通過結(jié)合30 非翻譯區(qū)(UTR)互補(bǔ)的區(qū)域調(diào)節(jié)基因的表達(dá)，稱為mRNA 翻譯抑制或mRNA 降解［9］。miR-26a 是新發(fā)現(xiàn)的具有血管生成抑制作用的miR，常作為腫瘤抑制基因存在。PTEN 是miR -26a 的直接目標(biāo)，其通過抑制PTEN的表達(dá)進(jìn)而負(fù)調(diào)節(jié)PI3K/Akt 信號(hào)通路，抑制HIF -1α 穩(wěn)定，而HIF-1α 可調(diào)節(jié)多種靶向因子，如血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)，紅細(xì)胞生長因子等表達(dá)，促進(jìn)血管新生［10，11］。此外，PTEN 還控制Jun N -末端激酶(JNK)的活性，有效地促進(jìn)VEGF 的表達(dá)，促進(jìn)血管生成相關(guān)的細(xì)胞生長以及生存因子表達(dá)增加，刺激血管的形成［12，13］。最近研究發(fā)現(xiàn)，在人類及動(dòng)物心肌梗死模型中，利用miR -26a 抑制劑阻斷其表達(dá)后，在兩天內(nèi)即可迅速誘導(dǎo)強(qiáng)有力的血管生成，新生血管數(shù)量增加兩倍，梗死面積顯著減少［3］。在肝癌細(xì)胞中，miR-26a 通過PI3K/Akt/HIF-1α/VEGFA 通路調(diào)節(jié)其血管生成［14］。但miR-26a 在創(chuàng)面愈合中的作用及其在糖尿病模型中的表達(dá)，尚未見相關(guān)報(bào)道。

本研究通過構(gòu)建2 型糖尿病小鼠全層皮膚缺損創(chuàng)面模型，局部應(yīng)用miR -26a 抑制劑后，發(fā)現(xiàn)創(chuàng)面內(nèi)毛細(xì)血管的生成增多，創(chuàng)面灌注提高，肉芽組織增生明顯。創(chuàng)面在前3 天后愈合速度相對(duì)減慢可能與抑制劑的穩(wěn)定性和作用時(shí)效有關(guān)。miR-26a 抑制劑可能通過PTEN 相關(guān)的信號(hào)通路作用于創(chuàng)面組織，但其具體機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。本研究首次發(fā)現(xiàn)miR-26a 在糖尿病小鼠模型中表達(dá)升高，抑制miR-26a對(duì)創(chuàng)面愈合有一定的促進(jìn)作用，推測其可作為糖尿病創(chuàng)面治療新的研究靶點(diǎn)。

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