韓俊嶺 孔曉君 李建遠(yuǎn)

熱應(yīng)激反應(yīng)是指生物在高溫環(huán)境下發(fā)生的應(yīng)激反應(yīng)。熱應(yīng)激能引起機(jī)體產(chǎn)生活性氧，導(dǎo)致氧化損傷，改變胞內(nèi)的信號傳遞，該過程中生物體能夠選擇性合成一組多肽:熱休克蛋白(HSPs)［1］。根據(jù)分子質(zhì)量和等電點分為HSP90、HSP70、HSP60、HSP40 等家族［2］。其中HSP90 是HSPs 中高度保守的胞質(zhì)蛋白，也是重要的成員，其中又以亞型HSP90α 研究最為廣泛，且HSP90α 主要存在于大腦和睪丸中［3］。因此，了解陰囊熱應(yīng)激后機(jī)體生殖系統(tǒng)中HSP90α 的表達(dá)及機(jī)體抗氧化能力的改變具有重要意義。本實驗通過建立陰囊熱應(yīng)激模型，探討熱應(yīng)激后小鼠生殖系統(tǒng)HSP90 的表達(dá)規(guī)律及小鼠抗氧化能力的改變。

材料與方法

1.實驗動物及試劑:實驗所用雄性小鼠40 只，8 周齡，體重40 ～45g，SPF 級，由濱州醫(yī)學(xué)院動物實驗中心提供。SOD、MDA 檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所。TUNEL 細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自碧云天公司。實驗中所用其他化學(xué)試劑均為分析純。分光光度計為英國柏楉Biowave Ⅱ紫外可見分光光度計(Biochrom WPA Biowave Ⅱ)，圖像分析采用德國共聚焦激光掃描顯微鏡(LSM-510 META)分析儀，全自動精子分析儀采用美國漢密爾頓(IVOS-CASA)系統(tǒng)。

2.實驗方法:(1)實驗設(shè)計:將56 只小鼠隨機(jī)分為正常對照組和熱應(yīng)激組。各組熱應(yīng)激后再按0、1、4、12、24、48h 隨機(jī)分成7 個亞組，每組10 只小鼠。試驗組小鼠在飼養(yǎng)7 天后進(jìn)行熱應(yīng)激處理。熱應(yīng)激模型參照Cai 等［4］的研究方法:熱應(yīng)激組小鼠予5%水合氯醛(0.7ml/100g)麻醉后，將小鼠身體的下1/3 部分(包括陰囊、后腿、尾巴)浸于43℃恒溫水中30min，擦干后回籠。對照組浸于22℃恒溫水中30min。各亞組小鼠分別于熱應(yīng)激后0、1、4、12、24、48h 采用摘除眼球法取血，并分離血清檢測血清中的SOD。待血液流盡后予頸椎脫臼處死，取左側(cè)睪丸、附睪及肝臟稱重，用于計算臟器系數(shù)，之后置于4%多聚甲醛溶液中固定24h，常規(guī)石蠟包埋、切片(5μm)，用于組織學(xué)研究。右側(cè)睪丸取一部分組織提取RNA，用作PCR 檢測。右側(cè)附睪用于制備精子懸液，計算精子活力、存活率及畸形率。(2)檢測項目:①睪丸結(jié)構(gòu)變化檢測，通過熒光TUNEL 實驗檢測熱應(yīng)激后睪丸的細(xì)胞凋亡情況;②睪丸、附睪質(zhì)量指數(shù)，睪丸、附睪質(zhì)量系數(shù)公式為:質(zhì)量指數(shù)=器官質(zhì)量(mg)/小鼠質(zhì)量(g);③精子活力、活率、畸形率檢測，取出右側(cè)附睪，置于適量37℃的PBS 中，用眼科剪剪碎，制成精子懸液。滴1 滴懸液于干凈的玻片上，用全自動精子分析儀檢測相關(guān)指標(biāo)。評估精子的活力等級，將其分為3 級(快速前向運(yùn)動;非前向運(yùn)動精子;不運(yùn)動精子)。累計檢測400 個精子，計算精子活力。精子活力(%)=(前向運(yùn)動+非前向運(yùn)動)/精子總數(shù)×100%。取上述懸液滴加于玻片上，加等量的1%的伊紅染液混勻，加蓋玻片靜置30s，用相差顯微鏡計數(shù)400個精子，計算精子存活率。將懸液涂片，干燥后用甲醇固定5min，用HE 染色。計數(shù)400 個精子并檢查精子形態(tài)，計數(shù)結(jié)構(gòu)完整精子;④睪丸、附睪中HSP90α 基因的RT-PCR 檢測，提取睪丸和附睪中RNA，反轉(zhuǎn)錄后對HSP90α 基因和β-actin 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。取PCR 產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，采用凝膠成像系統(tǒng)拍照并進(jìn)行光密度分析;⑤清SOD、MDA 檢測，按照試劑盒操作說明測定對照組和應(yīng)激后0、4、24、48h 組小鼠血液中SOD、MDA 含量，分析小鼠抗氧化能力的改變。

圖1 熱應(yīng)激后睪丸細(xì)胞凋亡的情況(×400)

3.統(tǒng)計學(xué)方法:使用SPSS 13.0 進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，采用單向方差分析，計量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，P ＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1.熱應(yīng)激對睪丸細(xì)胞的影響:由結(jié)果可知，熱應(yīng)激后會造成小鼠睪丸細(xì)胞的凋亡，且主要集中在精原細(xì)胞和初級精母細(xì)胞，同時睪丸中其他細(xì)胞的凋亡也增加，并且細(xì)胞的凋亡程度在12h 時最為嚴(yán)重，48h時基本恢復(fù)正常(圖1)。

2.陰囊熱應(yīng)激對小鼠臟器指數(shù)的影響:各組小鼠的睪丸、附睪的重量及質(zhì)量指數(shù)結(jié)果見表1。隨著應(yīng)激時間的延長，其中各個時間點睪丸指數(shù)、肝臟指數(shù)與對照組相比無統(tǒng)計學(xué)差異(P ＞0.05)。0、1h 組的附睪指數(shù)與對照組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P ＜0.05)。

表1 陰囊熱應(yīng)激后小鼠臟器指數(shù)的變化(±s)

表1 陰囊熱應(yīng)激后小鼠臟器指數(shù)的變化(±s)

與對照組比較，* P ＜0.05

組別 n 睪丸指數(shù) 附睪指數(shù) 肝臟指數(shù)對照組10 0.802 ±0.021 0.216 ±0.011 51.43 ±7.11 0h 組 10 0.699 ±0.055 0.114 ±0.008* 45.32 ±5.03 1h 組 10 0.687 ±0.048 0.140 ±0.004* 45.73 ±6.16 4h 組 10 0.746 ±0.065 0.147 ±0.003 46.12 ±7.25 24h 組10 0.768 ±0.130 0.176 ±0.015 47.33 ±4.12

3.陰囊熱應(yīng)激對精子活力、存活率及形態(tài)的影響:陰囊熱應(yīng)激后，小鼠精子活力、存活率及正常精子率都有不同程度的下降，其中0h 組精子活力明顯低于對照組(P ＜0.05)，而存活率48h 內(nèi)下降趨勢不顯著，與對照組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P ＞0.05)。隨著時間的延長，精子畸形率在12h 和24h 時最高，明顯高于對照組(P ＜0.05)，到48h 時基本恢復(fù)正常，結(jié)果見表2。

表2 陰囊熱應(yīng)激對精子活力、存活率及形態(tài)的影響(±s，%)

表2 陰囊熱應(yīng)激對精子活力、存活率及形態(tài)的影響(±s，%)

與對照組比較，* P ＜0.05，＊＊P ＜0.01

組別 n 精子活力 存活率 畸形率對照組6 84.13 ±3.12 86.82 ±5.86 8.04 ±0.53 0h 組 6 70.41 ±4.09* 80.11 ±5.56 9.21 ±0.75 12h 組 6 74.07 ±4.01 82.76 ±3.29 14.33 ±1.03＊＊24h 組 6 75.71 ±3.68 84.17 ±3.75 12.26 ±0.14*48h 組6 77.43 ±2.47 83.98 ±4.72 9.41 ±0.21

4.急性熱應(yīng)激對小鼠睪丸、附睪中HSP90α 表達(dá)的影響:在正常情況下，睪丸、附睪組織中HSP90α 的表達(dá)量較低。急性熱應(yīng)激處理后，睪丸中HSP90α 的表達(dá)水平開始升高，在4h 達(dá)到高峰(圖2A)。0、1、4、12h 組均顯著高于對照組(P ＜0.05)，隨著時間的延長HSP90α 表達(dá)量逐漸恢復(fù)，24、48h 組與對照組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P ＞0.05，圖2B)。HSP90α 在附睪中的表達(dá)在0、1、4、12、24h 組均顯著高于對照組(P＜0.05)，48h 組表達(dá)水平仍高于正常水平，但與對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P ＞0.05，圖3)。

圖2 熱應(yīng)激后HSP90α 在睪丸中的表達(dá)

圖3 熱應(yīng)激后HSP90α 在附睪中的表達(dá)

5.陰囊熱應(yīng)激對小鼠血清抗氧化能力的影響:熱應(yīng)激處理后，小鼠血清中SOD 水平明顯升高，其中0、4h 組顯著高于對照組(P ＜0.05)，而24、48h 組基本恢復(fù)正常。血清中MDA 含量在熱應(yīng)激處理后4h 顯著增加，明顯高于對照組(P ＜0.05)，24h 組有所下降，與對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P ＞0.05，表3)。

討 論

哺乳動物的睪丸和附睪的溫度比身體核心溫度低，精子發(fā)生過程在睪丸內(nèi)進(jìn)行，只有睪丸保持較低的溫度才能保證生精小管內(nèi)精子的正常產(chǎn)生［5］。哺乳類動物睪丸位于體外的陰囊內(nèi)，對溫度的變化非常敏感，并且陰囊對溫度有特殊的調(diào)節(jié)能力，可以使睪丸內(nèi)保持適宜溫度，有利于精子的發(fā)生。如果陰囊溫度升高至一定程度，睪丸溫度會隨之升高而超出最適溫度范圍，致使睪丸組織正常的結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，引起生精細(xì)胞凋亡，最終導(dǎo)致睪丸的生精功能受到損害，精子畸形率升高、活力下降，而且性腺激素分泌量及成分發(fā)生改變，嚴(yán)重時可能導(dǎo)致雄性不育［6］。當(dāng)陰囊溫度升高，超過其調(diào)節(jié)能力時，也會對附睪內(nèi)精子的成熟產(chǎn)生影響，導(dǎo)致精子相關(guān)指標(biāo)下降。熱休克蛋白普遍存在于原核和真核生物體內(nèi)，高溫、寒冷、低氧、創(chuàng)傷等均可引起熱休克蛋白的高表達(dá)，其中HSP90 可通過維持信號分子蛋白的穩(wěn)定性，參與細(xì)胞內(nèi)多條信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的生理過程，從而協(xié)助機(jī)體對抗不良環(huán)境［7］。

表3 陰囊熱應(yīng)激對小鼠血清抗氧化能力的影響(±s)

表3 陰囊熱應(yīng)激對小鼠血清抗氧化能力的影響(±s)

與對照組比較，* P ＜0.05，＊＊P ＜0.01

組別 n SOD(U/ml) MDA(nmol/ml)對照組10 199.13 ±23.62 8.02 ±0.87 0h 組 10 253.41 ±34.09＊＊ 8.41 ±0.53 4h 組 10 219.47 ±27.01* 9.72 ±0.49*24h 組 10 205.73 ±23.18 7.98 ±0.45 48h 組10 197.43 ±21.47 8.08 ±0.62

本實驗結(jié)果顯示，在陰囊熱應(yīng)激后，睪丸細(xì)胞出現(xiàn)了明顯的凋亡現(xiàn)象，該結(jié)果和相關(guān)的研究結(jié)果相似［8］。一般認(rèn)為認(rèn)為凋亡途徑包括:內(nèi)源性途徑(也稱線粒體途徑)和外源性途徑(也稱死亡受體途徑)。Absalan 等［6］研究發(fā)現(xiàn)，睪丸溫度升高能夠引起多種細(xì)胞凋亡相關(guān)因子的改變，如Bax、Bcl -2、P53、survivin-140 等，故推斷陰囊熱應(yīng)激時通過兩種凋亡途徑引起睪丸細(xì)胞損傷。

熱應(yīng)激后不同時間點的試驗組小鼠睪丸指數(shù)均有所下降，但與對照組相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義，但相對于睪丸指數(shù)的變化不顯著，附睪指數(shù)則顯著增加，該結(jié)果和曹文等［9］的研究結(jié)果一致。睪丸、附睪質(zhì)量指數(shù)變化的趨勢不同，該結(jié)果可能與他們的組織結(jié)構(gòu)、生理功能不同相關(guān)，具體原因和機(jī)制需要進(jìn)一步研究。此外陰囊熱應(yīng)激導(dǎo)致小鼠精子的活力明顯下降、畸形率顯著升高，引人注意的是12h 組精子的畸形率最高，其原因和機(jī)制有待進(jìn)一步分析和研究。李德軍等［10］的研究進(jìn)一步表明，熱應(yīng)激能夠降低小鼠的精子數(shù)，并損傷小鼠的精子。以上結(jié)果說明43℃的陰囊應(yīng)激條件已經(jīng)超出了其對溫度的調(diào)節(jié)能力，并對生殖系統(tǒng)造成損傷。

HSP90α 是胞內(nèi)蛋白，與熱應(yīng)急和氧化損傷密切相關(guān)，由于其作用底物與多種細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路密切相關(guān)，且可以作為分子伴侶發(fā)揮作用，其生理作用越發(fā)引起人們的關(guān)注，但在生殖系統(tǒng)中的研究較少［11］。本實驗研究了熱應(yīng)激前、后HSP90α 在睪丸、附睪中的表達(dá)情況，PCR 結(jié)果顯示熱應(yīng)激前HSP90α 在睪丸中有表達(dá)，但相對較弱。熱應(yīng)激后表達(dá)量明顯增強(qiáng)，且有時間性。提示在陰囊熱應(yīng)激過程中，在不同的時間點HSP90α 發(fā)揮著對生殖系統(tǒng)的保護(hù)作用。本實驗發(fā)現(xiàn)陰囊熱應(yīng)激時，在睪丸和附睪中HSP90α 高表達(dá)的同時血清中SOD 明顯升高，MDA 也有所升高，提示機(jī)體整體的抗氧化能提高，具體機(jī)制需要做進(jìn)一步研究。

綜上所述，陰囊熱應(yīng)激對雄性小鼠的生殖系統(tǒng)造成了損傷。PCR 結(jié)果表明HSP90α 可能參與睪丸中精子的發(fā)生與附睪內(nèi)精子的成熟，然而目前為止，對于HSP90α 在雄性生殖系統(tǒng)中的作用的認(rèn)識非常有限。這些方面需要人們做進(jìn)一步的研究，以便更深入地了解雄性生殖和雄性不育。

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