高永亮 盧覓佳 楊紅忠 黃敏聰 宣堯仙

1 型糖尿病被認(rèn)為是一種由調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞(regulatory T cells，Tregs)介導(dǎo)并對胰島β 細(xì)胞造成不可逆轉(zhuǎn)破壞的代謝性疾?。?］。對于自發(fā)性1 型糖尿病動(dòng)物模型和人的研究表明Tregs 在疾病的發(fā)生、發(fā)展過程中很重要的作用［2］。1995 年Sakaguchi 等［3］報(bào)道CD4+CD25+細(xì)胞減少會(huì)導(dǎo)致多種自身免疫性疾病，引起了人們對于該類型細(xì)胞功能的重視。Tregs主要包括兩類:natural regulatory T cells (nTregs)和inducible regulatory T cells (iTregs)，這兩類細(xì)胞分別產(chǎn)生于胸腺和脾臟，它們共同發(fā)揮作用保證了機(jī)體的免疫穩(wěn)態(tài)，免疫穩(wěn)態(tài)被打破即Tregs 數(shù)量或者功能失衡時(shí)會(huì)導(dǎo)致自身免疫性疾病的出現(xiàn)，如自發(fā)性1 型糖尿病發(fā)生和Tregs 具有相關(guān)性［4］。使用鏈脲佐菌素(streptozocin，STZ)造模的實(shí)驗(yàn)性1 型糖尿病動(dòng)物模型能夠出現(xiàn)1 型糖尿病患者的大部分典型癥狀，廣泛應(yīng)用于糖尿病研究之中［5］。但使用STZ 造模1 型糖尿病大鼠致病機(jī)制Tregs 數(shù)量和功能的關(guān)系并未被完全揭示。本實(shí)驗(yàn)在自發(fā)性1 型糖尿病模型與Tregs關(guān)系研究的基礎(chǔ)上，對實(shí)驗(yàn)性1 型糖尿病模型大鼠Tregs 數(shù)量和功能的變化進(jìn)行了研究，以探討實(shí)驗(yàn)性1 型糖尿病模型致病機(jī)制與Tregs 數(shù)量和功能的關(guān)系。

材料與方法

1.試劑和儀器:鏈脲佐菌素(streptozocin，STZ)購自Sigma公司;氯化氨溶液、檸檬酸和檸檬酸三鈉購自華東醫(yī)藥公司;FACS 溶血素、1640 培養(yǎng)液、HANKS 緩沖液購自聯(lián)科生物有限公司;CCK-8 試劑盒購自日本同仁化學(xué)研究所;pH 計(jì)購自梅特勒-托利多公司;羅氏卓越型血糖儀和血糖試紙購自Roche Diagnostics GmbH 公司;流式細(xì)胞儀、破膜試劑盒(transcription factor suit)、Anti-rat Foxp3+(PE)、Anti-ratCD4+(APC)、Anti-rat CD25+(PE)購自BD 公司;酶標(biāo)儀購自BioTek 公司;大鼠CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞提取試劑盒、MagCellect 磁性分離儀購自R＆D 公司。

2.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:試驗(yàn)用無特定病原體(specific pathogen free)，SPF 級SD 大鼠30 只，雌雄各半，6 ～8 周齡，體重200 ～250g，購自上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。1 型糖尿病模型大鼠采用一次性大劑量注射60mg/ml STZ 緩沖液的方法造模。分別選取造模成功大鼠12 只和健康大鼠12 只。分組為模型組12 只、健康對照組12 只(各組均雌雄各半)。

3.流式細(xì)胞儀檢測胸腺、脾臟和外周血Tregs 數(shù)量:(1)大鼠胸腺、脾臟和外周血細(xì)胞懸液制備:將大鼠麻醉后腹主動(dòng)脈采血，采血后處死分別取部分胸腺和脾臟，分別放入無菌培養(yǎng)皿中，加入10ml 平衡鹽溶液(HANKS)緩沖液;將取出的胸腺和脾臟研磨，過70 目濾網(wǎng)過濾轉(zhuǎn)至15ml 的離心管中;1500r/min 離心5min，去上清后加入5ml 氯化氨溶液，混勻后靜置10min;加入10ml 的PBS 緩沖液，1500r/min 離心8min;去上清，加15ml HANKS 緩沖液離心洗滌1 次，棄上清，PBS 緩沖液懸浮。(2)流式細(xì)胞儀檢測:待測懸液加入胞外抗體Anti-rat CD25+(PE)，2 ～8℃孵育30min。加入2ml Stain buffer，1500r/min 離心5min，棄上清;加入1ml Fix/Perm Buffer，吹散細(xì)胞，2 ～8℃孵育40 ～50min。加1ml Perm/Wash Buffer，2 ～8℃下350 ×g 離心6min，棄上清。加2ml Perm/Wash Buffer，吹散細(xì)胞，2 ～8℃下350 ×g 離心6min，棄上清。加80 ～100μl Perm/Wash Buffer，吹散細(xì)胞，加胞內(nèi)抗體Anti - rat Foxp3+(PE)，渦旋或振搖10s，2 ～8℃避光孵育40 ～50min。簡短振搖，加2ml Perm/Wash Buffer，350 ×g 離心6min，棄上清。加2ml Perm/Wash Buffer，350 × g 離心6min，棄上清。加350μl PBS 緩沖液懸浮細(xì)胞，使用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測。

4.免疫磁珠兩步法分選CD4+CD25+細(xì)胞及免疫抑制功能檢測:(1)大鼠脾臟細(xì)胞懸液制備:將大鼠麻醉處死，無菌環(huán)境下使用高溫消毒器具取部分脾臟，放入無菌培養(yǎng)皿中，加入10ml HANKS 緩沖液;將取出的脾臟研磨，過70 目濾網(wǎng)過濾轉(zhuǎn)至15ml 的離心管中;1500r/min 離心5min，去上清后加入5ml氯化氨溶液，混勻后靜置10min;加入10ml 的PBS 緩沖液，1500r/min 離心8min;去上清，加15ml HANKS 緩沖液離心洗滌1 次，棄上清，用1 ×MagCellect Buffer 懸浮，調(diào)整細(xì)胞濃度至1 ×108/ml。(2)免疫磁珠兩步法分選CD4+CD25+細(xì)胞:待分選懸液依次進(jìn)行磁性分選。首先陰性選擇CD4+T 細(xì)胞，將2 ×108個(gè)細(xì)胞(2ml )轉(zhuǎn)移到5ml 試管中，分別加入200μl MagCellect CD4+T 細(xì)胞抗體和250μl MagCellect 抗鼠IgG 磁珠，依次輕輕混勻，分別在2 ～8℃孵育15min;加入550μl Buffer 輕輕混勻，調(diào)整懸液體積至3ml，將試管放于磁體中靜置10min;當(dāng)試管在磁體中時(shí)用無菌移液管將上清液吸出至于一新的5ml 試管中，放于磁體中靜置10min;取出上清至15m1離心管中，并計(jì)數(shù)。然后陽性選擇CD4+CD25+T 細(xì)胞，加入Buffer 至15ml，1100r/min 離心8min;去上清，加100μl Buffer混懸細(xì)胞，轉(zhuǎn)移到5ml 試管中;每1 ×107個(gè)細(xì)胞分別加10μl生物素標(biāo)記的抗鼠CD25 抗體和10μl MagCellect 抗生物素磁珠，依次在2 ～8℃冰箱中孵育15min;加Buffer 定容至1ml，輕輕混勻，使溶液處于懸浮狀態(tài)，將試管放于磁體中靜置6min，當(dāng)試管在磁體中時(shí)，用消毒的移液管吸出上清液并去除;從磁體中取出試管，加1ml Buffer 混懸細(xì)胞，重復(fù)后從磁體中取出試管，加1ml Buffer 混懸細(xì)胞，此為富含CD4+CD25+T 細(xì)胞的細(xì)胞懸液，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。(3)CD4+CD25+細(xì)胞免疫抑制功能檢測(CCK -8):CD4+CD25+T 細(xì)胞和CD4-T 細(xì)胞使用30μg/ml 絲裂霉素C 處理，每個(gè)待測樣品分為兩組，每組依照如表1 分別依次加入所示溶液。

表1 CCK-8 試驗(yàn)各組加樣流程表

5.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法:使用SPSS 20.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，采用t 檢驗(yàn)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1.流式細(xì)胞儀檢測胸腺、脾臟和外周血Tregs 數(shù)量變化:模型組和健康對照組大鼠胸腺、脾臟、外周血中CD25+Foxp3+在CD4+中的比例情況(CD25+Foxp3+/CD4+)，未見統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P ＞0.05，表2 ～表4，圖1)。

表2 大鼠胸腺CD25 +Foxp3 + /CD4 +比例(%，±s)

表2 大鼠胸腺CD25 +Foxp3 + /CD4 +比例(%，±s)

組別 雄鼠 雌鼠模型組1.647 ±0.759 1.654 ±0.209健康對照組1.515 ±0.267 1.685 ±0.388

表3 大鼠脾臟CD25 +Foxp3 + /CD4 +比例(%，±s)

表3 大鼠脾臟CD25 +Foxp3 + /CD4 +比例(%，±s)

組別 雄鼠 雌鼠模型組2.367 ±1.390 3.345 ±1.15健康對照組2.533 ±1.514 3.430 ±1.18

表4 大鼠外周血CD25 +Foxp3 + /CD4 +比例(%，±s)

表4 大鼠外周血CD25 +Foxp3 + /CD4 +比例(%，±s)

組別 雄鼠 雌鼠模型組4.548 ±1.946 6.590 ±2.327健康對照組5.563 ±1.175 5.851 ±2.282

圖1 模型組大鼠外周血(A)、脾臟(B)和胸腺(C)及健康對照組大鼠外周血(D)、脾臟(E)和胸腺(F)CD25 +Foxp3 + /CD4 +比例圖示

2.免疫磁珠分選CD4+CD25+細(xì)胞及免疫抑制功能檢測:模型組和健康對照組脾臟CD4+CD25+細(xì)胞分離提取以后通過CCK -8 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)CD4+CD25-細(xì)胞增殖率對比來判斷CD4+CD25+細(xì)胞的免疫抑制功能，模型組CCK-8 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)中選取的自體和異體CD4+CD25-細(xì)胞在增殖后與健康對照組比較未見統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P ＞0.05)。

表5 CCK-8 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)統(tǒng)計(jì)CD4 +CD25 -細(xì)胞增殖率(%，±s)

表5 CCK-8 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)統(tǒng)計(jì)CD4 +CD25 -細(xì)胞增殖率(%，±s)

組別 自體CD4 +CD25 - 異體CD4 +CD25-102.591 ±4.205 99.269 ±6.288健康對照組模型組100.000 ±6.593 100.000 ±3.143

討 論

1 型糖尿病被認(rèn)為是一種由于Tregs 數(shù)量或者功能遭到破壞而引起的自身免疫性疾病。Tregs 被認(rèn)為在維持免疫穩(wěn)態(tài)、預(yù)防自身免疫疾病方面發(fā)揮重要的作用，而轉(zhuǎn)錄因子Foxp3 在功能性的Tregs 發(fā)生、維持以及發(fā)揮功能上起到關(guān)鍵作用［6，7］。早期有報(bào)道稱在糖尿病小鼠(NOD)外周血中占CD4+細(xì)胞5% ～10%的CD4+CD25+會(huì)出現(xiàn)數(shù)量減少的現(xiàn)象，后續(xù)對自發(fā)性糖尿病小鼠的系列試驗(yàn)報(bào)道表明，Tregs 無論功能還是數(shù)量上的破壞都會(huì)導(dǎo)致1 型糖尿病的發(fā)生，而nTregs 和iTregs 都能阻止疾病的發(fā)生［8，9］。但對糖尿病患者外周血中CD4+CD25+Foxp3+的數(shù)量和功能研究表明，CD4+CD25+Foxp3+的數(shù)量并未減少而是功能發(fā)生了改變，且Tregs 數(shù)量與年齡、病程具有相關(guān)性［10，11］。但是，對新患者(10 歲左右)的研究表明他們自身的Tregs 的數(shù)量和功能并未發(fā)生改變［12］。因此，自發(fā)性1 型糖尿病和Tregs 數(shù)量、功能的關(guān)系并未得到完全的證實(shí)，而是提示了兩者具有相關(guān)性［13］。

STZ 能夠選擇性破壞嚙齒類動(dòng)物的胰腺胰島β細(xì)胞，從而使實(shí)驗(yàn)動(dòng)物產(chǎn)生糖尿病。本研究首先對使用STZ 造模后的實(shí)驗(yàn)性1 型糖尿病大鼠和健康大鼠胸腺、脾臟、外周血中Tregs 的比例進(jìn)行檢測。兩組剩余大鼠采用免疫磁珠兩步法(陰性選擇和陽性選擇)分選脾臟CD4+CD25+細(xì)胞，并檢測其對CD4+CD25-細(xì)胞增殖能力的抑制作用。文獻(xiàn)報(bào)道用免疫磁珠兩步法提取分離的大鼠脾臟CD4+CD25+細(xì)胞有較好的純度(87%)和存活率(97%)［14］。對實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行Tregs 數(shù)量和功能檢測，結(jié)果表明糖尿病大鼠Tregs 的功能和數(shù)量并未發(fā)生改變。筆者并不能完全排除隨著病程的進(jìn)展，模型組大鼠Tregs 功能和數(shù)量會(huì)出現(xiàn)差異和改變，但根據(jù)目前STZ 導(dǎo)致大鼠出現(xiàn)糖尿病致病機(jī)制的研究并未有明顯的與Tregs的功能和數(shù)量變化相關(guān)的提示，模型動(dòng)物本身的改變也都是自身病程進(jìn)展代償性的結(jié)果，而不是由于注射STZ 后對Tregs 造成嚴(yán)重影響，進(jìn)而激發(fā)了自身免疫過程導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)動(dòng)物出現(xiàn)1 型糖尿?。?5，16］。本研究結(jié)果顯示使用STZ 造模的實(shí)驗(yàn)型1 型糖尿病大鼠致病機(jī)制與Tregs 的數(shù)量和功能無直接相關(guān)性，與自發(fā)性1 型糖尿病模型和人患者有所區(qū)別，有助于闡明1 型糖尿病致病機(jī)制與Tregs 之間的關(guān)系。

1 Castano L，Eisenbarth GS. Type-I diabetes:a chronic autoimmune disease of human，mouse，and rat［J］. Annu Rev Immunol，1990，1(8):647 -679

2 Vignali DA，Collison LW，Workman CJ. How regulatory T cells work?［J］. Nat Rev Immunol，2008，8(7):523 -532

3 Sakaguchi S，Sakaguchi N，Asano M，et al. Pillars article:immunologic self-tolerance maintained by activated T cells expressing IL-2 receptor alpha-chains (CD25). Breakdown of a single mechanism of self-tolerance causes various autoimmune diseases［J］. J Immunol，1995，155:1151 -1164

4 Sakaguchi S，Ono M，Setoguchi R，et al. Foxp3+CD25+CD4+natural regulatory T cells in dominant self - tolerance and autoimmune disease［J］.Immunol Rev，2006，212:8 -27

5 Wei M，Ong L，Smith MT，et al. The streptozotocin-diabetic rat as a model of the chronic complications of human diabetes［J］. Heart，Lung and Circulation，2003，12(1):44 -50

6 Zheng Y，Josefowice S，Chaudhry A，et al. Role of conserved noncoding DNA elements in the Foxp3 gene in regulatory T - cell fate［J］. Nature，2010，463(7282):808 -812

7 Lindley S，Dayan CM，Bishop A，et al.Defective suppressor function in CD4+CD25+T-cells from patients with type 1diabetes［J］. Diabetes，2005，54(1):92 -99

8 Kukreja A，Cost G，Marker J，et al. Multiple immuno - regulatory defects in type-1 diabetes［J］. J Clin Invest，2002，109(1):131 -140

9 Angelina M，Bilate JL. Induced CD4+Foxp3+regulatory T cells in immune tolerance［J］.Annual Review of Immunology，2012，30(1):733 -758

10 Todd B，Clive W，Kieran M，et al. No Alterations in the frequency of FOXP3_regulatory T -cells in type 1 diabetes［J］. Diabetes，2007，56(3):604 -612

11 Thayer TC，Wilson BS，Mathews CE，et al. Use of NOD mice to understand human type 1 diabetes［J］. Endocrinol Metab Clin North Am，2010，39(3):541 -561

12 Marek-Trzonkowska N，Mysliwec M，Siebert J，et al. Clinical application of regulatory T cells in type 1 diabetes［J］.Prediatric Diabetes，2013，14(5):322 -332

13 Yuxia Z，Esther BS，Leonard H. Revisiting regulatory T cells in type 1 diabetes［J］. Curr Opin Endocrinol Diabetes Obes，2012，19(4):271 -278

14 周國慶，唐琴，楊明峰，等. 大鼠CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞的分選和提?。跩］.泰山醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2012，33(5):325 -327

15 夏旋，翁建平.鏈脲佐菌素在糖尿病模型中的應(yīng)用研究［J］. 國際內(nèi)科學(xué)雜志，2009，36(9):540 -543

16 王洪敏，鐘志勇，吳慶洲，等.大鼠糖尿病模型早期病理觀察指標(biāo)的篩選［J］. 廣東藥學(xué)院學(xué)報(bào)，2011，27(1):86 -90