秦 燁 劉秀均 李 良 劉旭杰 甄永蘇

結(jié)腸癌是危害人類健康的常見惡性腫瘤之一，盡管在診斷和治療方面有一定的進(jìn)展，其仍是主要的致死性疾?。?］。目前對(duì)于靶向腫瘤相關(guān)蛋白和阻止腫瘤發(fā)展進(jìn)程的單克隆抗體及其他生物制品正在進(jìn)行廣泛研究［2］。聯(lián)合抗體藥物、化療藥以及其他藥物的治療組合可能對(duì)結(jié)腸癌有更好的療效。

表皮生長因子受體家族屬于跨膜受體酪氨酸激酶家族，其兩大成員，即人表皮生長因子1(human epidermal factor receptor 1，EGFR)和人表皮生長因子2(human epidermal factor receptor 2，HER -2)在結(jié)腸癌中有異常高表達(dá)［3］。EGFR 和HER -2 在腫瘤中的表達(dá)異常增高，可促進(jìn)腫瘤的生長、增殖、分化和轉(zhuǎn)移［4］。目前，各種靶向EGFR 的抗腫瘤藥物已經(jīng)用于對(duì)轉(zhuǎn)移性腫瘤的治療［5］。因此，同時(shí)靶向EGFR 和HER-2 可能成為治療結(jié)腸癌更有效的策略。

筆者曾經(jīng)報(bào)道過一種可同時(shí)靶向EGFR 和HER-2 的雙特異性強(qiáng)化融合蛋白Ec -LDP -Hr -AE，這種融合蛋白是通過基因工程方法在強(qiáng)效抗腫瘤抗生素力達(dá)霉素(lidamycin)輔基蛋白的N 端連接一段靶向EGFR 的寡肽(來自配體EGF 的C 環(huán))，以及在C 端連接一段靶向HER - 2 的寡肽片段(來自抗HER-2 抗體C6.5 的VH中CDR3 區(qū)域)［6］。融合蛋白Ec -LDP -Hr -AE 的兩端以靶向肽段作為導(dǎo)向分子，以力達(dá)霉素作為“彈頭”藥物，這種利用基因工程融合蛋白靶向腫瘤，不僅可以提高抗腫瘤藥物的特異性，提高療效，還能降低藥物的使用劑量，降低藥物毒性。以往的研究中，筆者主要研究了強(qiáng)化融合蛋白Ec-LDP-Hr-AE 對(duì)腫瘤的靶向殺傷作用，在本研究中，筆者更進(jìn)一步研究未強(qiáng)化的融合蛋白Ec-LDP-Hr 對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞的生長影響，以及聯(lián)合強(qiáng)化融合蛋白對(duì)結(jié)腸癌移植瘤的抑瘤活性。聯(lián)合靶向融合蛋白及其強(qiáng)化形式融合蛋白的組合有可能成為提高抗腫瘤作用的新策略。

材料與方法

1.菌株、細(xì)胞系和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:BL21(DE3)/pET -Ec -LDP-Hr 表達(dá)菌株均由筆者實(shí)驗(yàn)室保存。人結(jié)腸癌細(xì)胞系HCT-15、HCT -116、HT -29 為本實(shí)驗(yàn)室傳代保存，HCT -15 培養(yǎng)在含有10%胎牛血清的RPMI 1640 的培養(yǎng)液中，HCT-116和HT-29 培養(yǎng)在含有10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)液中。本實(shí)驗(yàn)中所用的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為6 ～8 周齡(18 ～20g)的雌性BALB/c 裸鼠購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所。

2.試劑:卡那霉素、IPTG、牛血清白蛋白為Merck 公司產(chǎn)品。MTT、RNASE A、Propidium Iodide (PI)購自Sigma 公司。親和層析柱HisTrap HP (5ml)購自GE 公司?？贵wEGFR (D38B1)Rabbit mAb 和HER-2/ErbB2 (29D8)Rabbit mAb 購于CST(Cell Signal Technology)公司。His-Tag(2A8)mouse mAb 購自Abmart公司。二抗均購自北京中杉金橋生物技術(shù)公司。Annexin V -FITC 凋亡檢測試劑盒購自北京寶賽生物技術(shù)有限公司。

3.方法

(1)靶向融合蛋白Ec-LDP -Hr 的制備:融合蛋白Ec -LDP-Hr 的制備方法按參考文獻(xiàn)［6］進(jìn)行，得到的融合蛋白經(jīng)SDS-PAGE 和Western blot 法鑒定。

(2)Western blot 法:本實(shí)驗(yàn)中Western blot 法用于細(xì)胞蛋白表達(dá)水平的檢測。細(xì)胞樣品為細(xì)胞裂解后的離心得到的上清，用BCA 試劑盒進(jìn)行蛋白定量，每種細(xì)胞裂解樣品按相同上樣量制備。SDS-PAGE 電泳后轉(zhuǎn)膜，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。經(jīng)牛奶封閉后，用一抗(用PBS 按照1∶1000 稀釋使用)在4℃孵育過夜，TBST 洗膜后用二抗在室溫下孵育1h，二抗均為HRP 標(biāo)記的羊抗鼠/兔IgG(用PBS 按1∶5000 的比例稀釋)。Millipore 公司的顯影液顯影并拍照分析。

(3)ELISA 法分析融合蛋白對(duì)腫瘤細(xì)胞的免疫結(jié)合活性:將結(jié)腸癌細(xì)胞株HCT-15 接種于96 孔板(約為1 ×104個(gè)細(xì)胞/孔)，培養(yǎng)24h 后，預(yù)冷的甲醇(50 微升/孔)冰上固定20min。PBS 洗后，用1%BSA 溶液室溫封閉2h。PBST 緩沖液洗3 次，200 微升/孔，每次5min，共洗3 次。將待測蛋白(Ec-LDP-Hr 及對(duì)照LDP)按摩爾數(shù)單位對(duì)比稀釋后加入到96孔板中，50 微升/孔，每個(gè)濃度設(shè)3 個(gè)平行孔。于4℃靜置孵育過夜后，加入抗His-Tag 單克隆抗體(用PBS 按1∶2000 稀釋使用)，37℃孵育2h。PBST 洗3 次后，加入HRP 標(biāo)記的羊抗鼠IgG 抗體(用PBS 按1 ∶2500 稀釋)，37℃孵育2h。用PBST 洗板5 次后，加入TMB 底物溶液，100 微升/孔，室溫避光反應(yīng)10 ～20min。直接加入2mol/L 的硫酸溶液100 微升/孔終止反應(yīng)。在酶標(biāo)儀上測定450nm 處的吸光值OD450。

(4)細(xì)胞免疫熒光檢測融合蛋白與腫瘤細(xì)胞的結(jié)合:將HCT-15 細(xì)胞鋪于24 孔板中，培養(yǎng)至70%左右的融合度時(shí)PBS 洗1 次，預(yù)冷的甲醇置冰上固定30min。用1%BSA 室溫封閉2h。加入1mg/ml 融合蛋白于4℃靜置孵育過夜。加入抗His-Tag 抗體(用PBS 按1∶200 稀釋)37℃孵育2h。PBS洗后加入TRITC 標(biāo)記的羊抗鼠IgG 抗體(用PBS 按1∶200 稀釋使用)37℃避光孵育2h。PBS 洗后再用抗HER-2 的兔單克隆抗體(用PBS 按1 ∶200 稀釋使用)4℃避光孵育過夜。PBS 洗后加入FITC 標(biāo)記的羊抗兔IgG 抗體(用PBS 按1∶200稀釋)37℃避光孵育2h。PBS 洗后再加入DAPI(終濃度為2μg/ml)置室溫避光反應(yīng)15min 染細(xì)胞核。用PBS 洗3 次后，用共聚焦激光掃描顯微鏡觀察。

(5)平板克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測融合蛋白對(duì)腫瘤細(xì)胞的克隆形成影響:取對(duì)數(shù)生長期的HCT -15 細(xì)胞，消化并吹打成單個(gè)細(xì)胞，將細(xì)胞懸液用培養(yǎng)基稀釋，每組細(xì)胞分別以每毫升50個(gè)細(xì)胞的密度接種24 孔板中，每孔1ml，每組設(shè)3 個(gè)復(fù)孔，使細(xì)胞分散均勻。培養(yǎng)24h 后待細(xì)胞貼壁，在不同組中加入融合蛋白Ec-LDP-Hr 及對(duì)照LDP，繼續(xù)靜置培養(yǎng)。當(dāng)培養(yǎng)板中出現(xiàn)肉眼可見的克隆時(shí)(約為10 天)，終止培養(yǎng)，用4%多聚甲醛固定。鏡下計(jì)數(shù)＞50 個(gè)細(xì)胞的克隆數(shù)。

(6)MTT 法檢測融合蛋白對(duì)腫瘤細(xì)胞的增殖影響:將對(duì)數(shù)生長期的HCT-15 細(xì)胞胰酶消化后，對(duì)其進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，稀釋至5 ×104/ml，接種于96 孔板，每孔100μl，每組設(shè)3 個(gè)復(fù)孔。24h 待細(xì)胞貼壁后，分別加入50μg/ml 的蛋白Ec -LDP-Hr 和LDP，分別于0、24、48 和72h 時(shí)，加入MTT(終濃度為200mg/L)，于37℃靜置4h。棄去上清，每孔加DMSO 溶液150μl，溶解結(jié)晶10min，檢測波長為570nm 的吸光值，每組取3 個(gè)復(fù)孔的平均值。細(xì)胞生存率的計(jì)算如下:細(xì)胞生存率(%)=(實(shí)驗(yàn)孔OD 值-對(duì)照孔OD 值-空白孔OD 值)/(對(duì)照孔OD 值-空白孔OD 值)×100%

(7)雙染法強(qiáng)化融合蛋白Ec-LDP-Hr -AE 對(duì)腫瘤細(xì)胞凋亡的影響:此檢測方法主要使用寶賽生物技術(shù)公司的Annexin Ⅴ-FITC 凋亡檢測試劑盒。具體步驟參照試劑盒說明書。

(8)動(dòng)物實(shí)驗(yàn):選用BALB/c 裸鼠，雌性，體重18 ～20g。在小鼠右側(cè)腋下接種瘤塊，待瘤塊長至50 ～100mm3大小時(shí)，將裸鼠按照瘤塊大小和體重進(jìn)行分組，使每組瘤塊大小平均值接近，且各組體重平均值接近，每組6 只，共4 組。對(duì)小鼠進(jìn)行不同的給藥處理方式，密切觀察腫瘤的生長和小鼠的體重，并隔天測量。實(shí)驗(yàn)期間隔天測量一次腫瘤直徑和體重，根據(jù)公式V=ab2/2 計(jì)算腫瘤體積(a. 腫瘤長徑，b. 腫瘤短徑)，繪制腫瘤生長曲線，并觀察實(shí)驗(yàn)小鼠體重變化。

(9)統(tǒng)計(jì)學(xué)方法:數(shù)據(jù)使用Excel 處理并作圖，用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS 17.0 進(jìn)行單因素ANOVA 分析，以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1.融合蛋白Ec -LDP-Hr 與腫瘤細(xì)胞的結(jié)合活性:根據(jù)文獻(xiàn)［6］制備融合蛋白Ec -LDP -Hr。筆者檢測了3 種結(jié)腸癌細(xì)胞中靶點(diǎn)EGFR 和HER -2 的表達(dá)情況，如圖1 所示，在HCT-15、HCT-116 和HT-293 細(xì)胞中，兩個(gè)靶點(diǎn)均有較高表達(dá)。選取HCT -15細(xì)胞檢測融合蛋白對(duì)其的結(jié)合活性(圖2)，與對(duì)照LDP 相比，融合蛋白Ec-LDP -Hr 與HCT -15 細(xì)胞結(jié)合明顯，且隨蛋白濃度增加而增加。為更直觀的觀察蛋白與細(xì)胞的結(jié)合，再用細(xì)胞免疫熒光技術(shù)檢測(圖3)，可見融合蛋白(紅色熒光代表)與在細(xì)胞核(藍(lán)色熒光代表)周圍定位，這說明融合蛋白與細(xì)胞能發(fā)生免疫結(jié)合。

圖1 Western blot 法檢測3 種結(jié)腸癌細(xì)胞中EGFR 和HER-2 的表達(dá)水平

圖2 ELISA 檢測融合蛋白Ec-LDP-Hr 及對(duì)照蛋白LDP 與HCT-15 的結(jié)合情況

圖3 細(xì)胞免疫熒光檢測融合蛋白Ec-LDP-Hr 與HCT-15 細(xì)胞的結(jié)合(×400)

2.融合蛋白Ec -LDP -Hr 對(duì)HCT -15 的增殖影響:融合蛋白能靶向結(jié)合HCT-15 細(xì)胞，為研究其對(duì)細(xì)胞增殖的影響，首先用平板克隆實(shí)驗(yàn)檢測，如圖4 所示，融合蛋白Ec -LDP -Hr 和對(duì)照蛋白LDP 對(duì)HCT-15 細(xì)胞的克隆形成均有一定的抑制，且隨蛋白濃度增加，抑制作用增加。當(dāng)?shù)鞍诐舛葹?5μg/ml和50μg/ml 時(shí)，Ec -LDP -Hr(50μg/ml)的抑制作用明顯強(qiáng)于LDP(P ＜0.01)。同時(shí)，MTT 法也驗(yàn)證了融合蛋白對(duì)HCT -15 細(xì)胞的生長抑制作用(圖5)，在48 和72h 時(shí)，其抑制作用明顯強(qiáng)于對(duì)照蛋白LDP。為探討融合蛋白對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖影響的機(jī)制，筆者用Western blot 法檢測用蛋白處理后的HCT-15 細(xì)胞中EGFR 和HER-2 的表達(dá)情況(圖6)，隨著蛋白濃度增加，EGFR 和HER -2 表達(dá)量明顯降低，這說明融合蛋白Ec - LDP - Hr 與靶點(diǎn)EGFR/HER -2 結(jié)合后，通過抑制此信號(hào)通路來抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。

圖4 融合蛋白Ec-LDP-Hr 和對(duì)照蛋白LDP 對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞HCT-15 的克隆形成抑制作用

圖5 MTT 法檢測50μg/ml 融合蛋白Ec-LDP-Hr 和對(duì)照蛋白LDP 對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞HCT-15 的生長抑制作用

圖6 Western blot 法檢測融合蛋白Ec-LDP-Hr 對(duì)HCT-15 細(xì)胞中EGFR 和HER-2 的表達(dá)影響

3.強(qiáng)化融合蛋白Ec -LDP -Hr -AE 對(duì)HCT -15 細(xì)胞的體外殺傷活性:融合蛋白Ec -LDP -Hr 與力達(dá)霉素發(fā)色團(tuán)分子在體外進(jìn)行組裝，得到強(qiáng)化的融合蛋白Ec-LDP-Hr-AE。MTT 檢測Ec-LDP-Hr-AE 對(duì)體外培養(yǎng)的人結(jié)腸癌細(xì)胞HCT -15 有強(qiáng)烈的殺傷作用，其IC50值為3.05 ×10-10mol/L。此外，筆者采用Annexin Ⅴ-FITC/PI 雙染結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)的方法檢測了強(qiáng)化融合蛋白Ec -LDP -Hr -AE 對(duì)HCT-15 細(xì)胞誘發(fā)凋亡的現(xiàn)象。不同濃度的Ec -LDP-Hr -AE 處理細(xì)胞24h 后，細(xì)胞均已出現(xiàn)凋亡的情況，且凋亡的比率隨Ec -LDP -Hr -AE 濃度的增加而增高(圖7)。0.1、1.0、10.0nmol/L 的Ec -LDP-Hr -AE 作用于HCT -15 細(xì)胞的凋亡率分別為2.550% ±0.002%、3.300% ±0.001%和15.050%±0.003%，顯著高于對(duì)照組的0.310% ±0.000%。此結(jié)果顯示強(qiáng)化的融合蛋白Ec -LDP -Hr -AE 在低濃度下24h 內(nèi)即可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡，這也是其導(dǎo)致細(xì)胞死亡的機(jī)制之一。

圖7 Annexin Ⅴ-FITC/PI 雙染法結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)檢測Ec-LDP-Hr-AE 對(duì)HCT-15 細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)作用

4.聯(lián)合融合蛋白Ec -LDP-Hr 及強(qiáng)化蛋白對(duì)裸鼠結(jié)腸癌移植瘤生長抑制作用:融合蛋白Ec-LDPHr 及強(qiáng)化融合蛋白Ec -LDP -Hr -AE 聯(lián)合的體內(nèi)抗腫瘤活性研究采用了人結(jié)腸癌HCT -15 裸鼠移植瘤模型。本次實(shí)驗(yàn)共使用24 只雌性裸鼠，分為6 組，每組6 只。分別為對(duì)照組、融合蛋白Ec -LDP -Hr(20mg/kg)組、強(qiáng)化融合蛋白Ec - LDP - Hr - AE(0.4mg/kg)組及聯(lián)合Ec -LDP -Hr 和Ec -LDP -Hr-AE 組。當(dāng)裸鼠皮下腫瘤體積達(dá)到50 ～100mm3時(shí)，將Ec-LDP-Hr 和Ec-LDP-Hr-AE 通過尾靜脈注射給藥。第1 次給藥后的第7 天，按照相同的劑量再次通過尾靜脈給藥1 次。實(shí)驗(yàn)期間每隔1 天測量1 次腫瘤直徑，并稱量小鼠體重。根據(jù)公式V =ab2/2 計(jì)算腫瘤體積(a. 腫瘤長徑，b. 腫瘤短徑)，繪制腫瘤生長曲線(圖8A)，觀察體重變化，并繪制小鼠體重曲線(圖8B)。在第29 天處死動(dòng)物，計(jì)算抑瘤率。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，雙特異性融合蛋白Ec - LDP -Hr(20mg/kg)對(duì)人結(jié)腸癌移植瘤HCT -15 有一定的抑制作用，其抑瘤率為37.6%，而強(qiáng)化的融合蛋白Ec-LDP-Hr-AE 的抑瘤效果(56.7%)明顯強(qiáng)于未強(qiáng)化的蛋白，將兩者進(jìn)行聯(lián)合，抑制率又有進(jìn)一步提高到71.4%，其CDI 值為1，說明融合蛋白Ec -LDP -Hr 與強(qiáng)化融合蛋白Ec -LDP -Hr -AE 在體內(nèi)有聯(lián)合相加作用。在整個(gè)實(shí)驗(yàn)治療期間，監(jiān)測小鼠體重顯示3 種給藥組使小鼠體重下降不明顯(低于原體重的20%)，小鼠能夠耐受所給的劑量。

圖8 聯(lián)合融合蛋白Ec-LDP-Hr 及其強(qiáng)化形式Ec-LDP-Hr-AE 對(duì)裸鼠結(jié)腸癌HCT-15 移植瘤的治療作用

討 論

結(jié)腸癌是世界范圍內(nèi)常見的惡性腫瘤之一，其癌癥病死率也位居第2 位，大約有1/4 的患者確診時(shí)就伴有轉(zhuǎn)移［7］。雖然結(jié)合手術(shù)治療和放化療能明顯改善結(jié)腸癌患者的預(yù)后，但由于結(jié)腸癌較高的發(fā)生率和病死率，加上傳統(tǒng)藥物的不良反應(yīng)大，還需不斷探尋新的治療手段［8］。近年來，腫瘤的靶向治療受到大家的關(guān)注，許多學(xué)者致力于對(duì)腫瘤標(biāo)志物的鑒定。分子靶向藥物具有特異性強(qiáng)的特點(diǎn)，因而逐漸成為當(dāng)今抗腫瘤藥物的研究熱點(diǎn)。在治療轉(zhuǎn)移性結(jié)腸癌中，EGFR 就是較理想的抗腫瘤治療靶點(diǎn)［9］。研究表明靶向EGFR 治療能改善轉(zhuǎn)移性結(jié)腸癌患者的預(yù)后［10］?，F(xiàn)在有兩種抗EGFR 抗體，帕尼單抗(panitumumab，IgG2 型)和西妥昔單抗(cetuximab，IgG3 型嵌合抗體)，已經(jīng)用于臨床上對(duì)轉(zhuǎn)移性結(jié)腸癌的治療。除了單純的單克隆抗體藥物，還有一些基于抗體的藥物用于抗腫瘤研究，如抗體藥物偶聯(lián)物(ADCs)、免疫毒素和免疫脂質(zhì)體［11］。這類藥物不僅能夠通過阻斷配受體結(jié)合或阻止受體二聚體化抑制腫瘤增殖，其偶聯(lián)的化療藥物還能發(fā)揮強(qiáng)大的腫瘤殺傷力［12，13］。事實(shí)證明，聯(lián)合基于抗體的靶向治療(針對(duì)腫瘤特異性高表達(dá)靶點(diǎn)如EGFR、HER-2 等)比單獨(dú)用藥效果更好［14］。因此，腫瘤治療中抗體藥物、化療藥物和其他藥物聯(lián)合治療會(huì)取得更好的療效。

有報(bào)道指出，針對(duì)靶點(diǎn)EGFR 和HER-2 研制的一種強(qiáng)化雙特異性融合蛋白Ec -LDP -Hr -AE，屬于抗體藥物偶聯(lián)物(ADCs)。該融合蛋白對(duì)高表達(dá)EGFR 或HER -2 的腫瘤細(xì)胞有較好的親和性，強(qiáng)化的融合蛋白組裝有力達(dá)霉素的烯二炔發(fā)色團(tuán)AE，作為“彈頭”分子對(duì)腫瘤細(xì)胞具有很強(qiáng)的殺傷作用［15］。在以往的報(bào)道中，具有靶向功能的融合蛋白Ec-LDP-Hr 只是作為發(fā)色團(tuán)的一種靶向載體工具來研究，并沒有深入探討融合蛋白對(duì)腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)活性。在本實(shí)驗(yàn)中，筆者首先驗(yàn)證了融合蛋白Ec -LDP -Hr 對(duì)高表達(dá)HER -2 和EGFR 的結(jié)腸癌腫瘤細(xì)胞HCT-15 的結(jié)合活性，并發(fā)現(xiàn)融合蛋白Ec -LDP -Hr 能抑制HCT -15 的生長和克隆形成，這可能是通過抑制腫瘤細(xì)胞靶點(diǎn)EGFR/HER -2 的表達(dá)而產(chǎn)生的。同樣，強(qiáng)化融合蛋白Ec -LDP -Hr -AE 對(duì)HCT-15 細(xì)胞也有很強(qiáng)的細(xì)胞毒性，在較低濃度(10-10mol/L)就能引起腫瘤細(xì)胞的凋亡。在結(jié)腸癌裸鼠移植模型中發(fā)現(xiàn)，融合蛋白Ec -LDP -Hr 能在一定程度發(fā)揮抑瘤效果，并且該融合蛋白及其強(qiáng)化融合蛋白聯(lián)合有相加作用，抗腫瘤效應(yīng)比單獨(dú)給藥要強(qiáng)。

綜上所述，基于抗體CDR 和配體寡肽的EGFR/HER-2 雙靶向融合蛋白Ec - LDP - Hr 不僅具有“導(dǎo)向”載體作用，還有一定的抗腫瘤活性。聯(lián)合融合蛋白Ec-LDP-Hr 及其強(qiáng)化形式Ec-LDP-Hr -AE 可能為高表達(dá)靶點(diǎn)EGFR/HER-2 的結(jié)腸癌提供一種新的治療策略。

1 Jemal A，Bray F，Center MM，et al. Global cancer statistics［J］.Cancer Journal for Clinicians，2011，61(2):69 -90

2 Blok E，Kuppen P，Leeuwen J，et al. Cytoplasmic overexpression of HER-2:a key factor in colorectal cancer［J］. Clinical Medicine Insights:oncology，2013，7:41 -51

3 Campanella C，Mottolese M，Cianciulli A，et al. Epidermal growth factor receptor gene copy number in 101 advanced colorectal cancer patients treated with chemotherapy plus cetuximab［J］. J Transl Med，2010，8(1):36

4 Baselga J，Arteaha CL. Critical update and emerging trends in epidermal growth receptor targeting in cancer［J］. J Clin Oncol，2005，23(11):2445 -2459

5 Shankaran V，Obel J，Benson AD. Predicting response to EGFR inhibitors in metastatic colorectal cancer:current practice and future directions［J］. Oncologist，2010，15(2):157 -167

6 Guo XF，Zhu XF，Shang Y，et al. A bispecific enediyne-energized fusion protein containing ligand - based and antibody - based oligopeptides against epidermal growth factor receptor and human epidermal growth factor receptor 2 shows potent antitumor activuty［J］. Clin Cancer Res，2010，16(7):2085 -2094

7 Garden OJ，Rees M，Poston GJ，et al. Guidelines for resection of colorectal cancer liver metastases［J］. Gut，2006，55(suppl 3):iii1-iii8

8 Lieu C，Kopetz S. The Src family of protein tyrosine kinases:a new and promising target for colorectal cancer therapy［J］. Clinical colorectal cancer，2010，9(2):89 -94

9 Grünwald V，Hidalgo M. Developing inhibitors of the epidermal growth factor receptor for cancer treatment［J］. J Natl Cancer Inst，2003，95(12):851 -867

10 Winder T，Lenz HJ. Vascular endothelial growth factor and epidermal growth factor signaling pathways as therapeutic targets for colorectal cancer［J］. Gastroenterology. 2010，138(6):2163 -2176

11 Sapra P，Shor B. Monoclonal antibody - based therapies in cancer:advances and challenges［J］. Pharmacology ＆ Therapeutics，2013，138(3):452 -469

12 Pedersen MW，Jacobsen HJ，Koefoed K，et al. Sym004:A novel synergistic anti - epidermal growth factor receptor antibody mixture with superior anticancer efficacy［J］. Cancer Res，2010，70(2):588 -597

13 Sapra P，Damelin M，Dijoseph J，et al. Long-term tumor regression induced by an antibody-drug conjugate that targets 5T4，an oncofetal antigen expressed on tumor - initiating cells［J］. Mol Cancer Ther，2013，12(1):38 -47

14 Shankaran V，Obel J，Benson AD. Predicting response to EGFR inhibitors in metastatic colorectal cancer:current practice and future directions［J］. Oncologist，2010，15(2):157 -167

15 Zhong GS，Zhang SH，Li Y，et al. A tandem scFv - based fusion protein and its enediyne -energized analogue show intensified therapeutic efficacy against lung carcinoma xenograft in athymic mice［J］.Cancer Lett，2010，295(1):124 -133