張 舒 石玉鐲 陳欣欣 孫 強

腫瘤是一種分化障礙性疾病，最基本的特征是細胞過度增生和分化程度的降低或完全喪失，一般說來，分化程度越低，腫瘤的惡性度越高［1］。惡性腫瘤多易發(fā)生轉(zhuǎn)移，從而危及患者的生命及影響治療的效果。乳腺癌是女性常見惡性腫瘤之一。盡管乳腺癌的治療已經(jīng)取得非常大的進展，但仍有一定比例的女性5 年內(nèi)出現(xiàn)復發(fā)或者轉(zhuǎn)移。乳腺癌中多個受體、抗體或基因的失活或過度表達均會影響患者的生存和預后，包括雌激素受體(ER)、孕激素受體(PR)、人表皮生長因子受體2(HER -2)、p53 等蛋白水平和Ki67 指數(shù)等［2］。這些指標從分子水平上也常作為臨床乳腺癌的分型指標。

膜受體酪氨酸激酶(RTK)-PI3K-AKT-mTOR通路可以調(diào)節(jié)細胞增殖、代謝、凋亡等功能，且mTOR通路異?；罨梢源龠M腫瘤的發(fā)生發(fā)展［3，4］。Notch通路則是調(diào)控細胞分化的重要通路，它的上調(diào)可抑制細胞分化［5，6］。大量實驗證明在乳腺癌中這兩條通路常存在異?；罨?］。有研究在細胞實驗中證明，mTOR 在轉(zhuǎn)錄水平上上調(diào)Notch 信號通路使細胞由分化轉(zhuǎn)向增殖從而促進腫瘤發(fā)生［1，8］。且mTOR 與Notch 通路共同活化具有高度相關性在人乳腺癌組織中已得到驗證［9］。但mTOR-Notch 通路共同活化的相關性與腫瘤的惡性程度、預后是否有深入的聯(lián)系，目前尚未有研究闡明。本實驗將在組織水平上研究mTOR 和Notch 通路的相關水平與腫瘤惡性程度以及預后指標的關系，探討mTOR 和Notch 共同活化水平對乳腺癌治療或預后的指導意義。

材料與方法

1.人乳腺癌組織:進行免疫組織化學分析的乳腺癌標本共57 例，均為浸潤性導管癌，來源于北京協(xié)和醫(yī)院病理科2008 年1 ～12 月的外科手術標本。患者均為女性，平均年齡52.8(29 ～82)歲。同時選取5 例乳腺腺瘤及腺病標本作為對照。用于Western blot 法檢測的乳腺癌標本共33 例，均為浸潤性導管癌，取自北京協(xié)和醫(yī)院2008 年12 月～2009 年3 月間收治的乳腺癌病例。患者均為女性，平均年齡51.6(31 ～72)歲。用于免疫染色的57 例人乳腺癌組織標本的切片根據(jù)染色結(jié)果，分為高、中、低分化3 組;根據(jù)陽性淋巴結(jié)率［陽性淋巴結(jié)率(%)=轉(zhuǎn)移的淋巴結(jié)數(shù)目/術中清除的淋巴結(jié)總數(shù)×100%］，將乳腺癌樣品分陽性淋巴結(jié)率＜15%，及≥15%兩組;根據(jù)雌激素受體(ER)、孕激素受體(PR)、人表皮生長因子受體2(HER-2)、p53 的免疫組化結(jié)果分為ER(+)(ER≥2)、ER(-)(ER ＜2)、PR(+)(PR ＞0)、PR(-)(PR =0)、HER-2(+)(HER-2 ＞0)、HER-2(-)(HER -2 =0)、p53(+)(p53 ＞0)、p53(-)(p53 =0)8 組。用于Western blot 法檢測的33 例乳腺癌組織標本預先取部分組織進行冷凍切片染色，分為低、中高分化2 組;根據(jù)陽性淋巴結(jié)率，分為陽性淋巴結(jié)率＜15%及≥15%兩組;根據(jù)ER、PR、HER-2、Ki67 的免疫組化結(jié)果分為ER(+)(ER ＞0)、ER(-)(ER =0)、PR(+)、PR(-)、HER -2(+)、HER - 2(-)、Ki67 指數(shù)≥50%、Ki67 指數(shù)＜50%共8 組。

2.抗體:pS6(Ser235/236)和S6 抗體由多肽(CAKRRRLp-SpSLRA 和CNGYDTSAQ EDMT-NH2)注射兔子，得到免疫血清，經(jīng)純化獲得。β - actin 單克隆抗體(Santa Cruz 公司)，Hes1 抗體(Chemicon 公司)，Notch1 抗體(Sigma 公司)，Western blot 二抗(Santa Cruz 公司)，免疫組化染色二抗(北京中杉金橋生物技術有限公司)。

3.免疫組化染色:組織蠟塊由北京協(xié)和醫(yī)院病理科免疫組化室切片并制片，分別進行HE、pS6、Notch1 抗體免疫組化染色。所有切片由高年資病理科醫(yī)師閱片。pS6 基因表達產(chǎn)物定位于細胞質(zhì)，Notch1 基因表達產(chǎn)物定位于細胞核及細胞質(zhì)，以出現(xiàn)棕黃色顆粒作為陽性細胞。對陽性細胞計數(shù)，以陽性細胞百分比計分。由此得到的免疫組化定量結(jié)果。

4.Western blot 法:將凍存于-80℃下的乳腺癌組織標本切取稱量10mg 置入EP 管中，加入裂解液800μl 進行超聲裂解，每次5s，間隔6s，重復20 次，10000r/min 離心15s 后98℃加熱10min 變性。4℃離心機中，15000r/min 離心15min，得到的上清為總蛋白裂解液。SDS-PAGE 膠電泳檢測pS6、Hes1、β-actin的蛋白表達水平，樣品即為上述總蛋白裂解液。Western blot 法檢測結(jié)果經(jīng)AlphaEase FC 凝膠圖像分析軟件進行灰度分析，以β-actin 的灰度值作為內(nèi)參，計算整合密度值(代表面積與平均密度值的乘積)，得到pS6 和Hes1 的相對表達水平的定量結(jié)果。

5.統(tǒng)計學方法:免疫組化染色和Western blot 法檢測的定量結(jié)果的回歸分析均應用Stata 9.2 軟件。以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。其中免疫組化定量結(jié)果回歸分析中，以每張切片中pS6 及對應Notch1 陽性細胞百分比得分作為變量;Western blot 法檢測定量結(jié)果回歸分析中，以pS6 和Hes1 的整合密度值作為變量，計算二者之間的相關性。

結(jié) 果

1.免疫染色和Western blot 法分別對mTOR 通路與Notch 通路活化程度定量:mTOR 活化可使下游的S6K 磷酸化，故用S6K 底物S6 的 磷酸化水平(pS6)作為mTOR 信號通路活化的指示蛋白。通過免疫組化染色，在57 例乳腺癌組織及5 例乳腺良性疾病中檢測pS6 與Notch 受體Notch1 的表達水平，分別得到pS6 和Notch1 的陽性細胞百分比，結(jié)果如表1。

表1 pS6 與Notch1 在免疫組化染色中的陽性細胞百分比

Hes1 是Notch 的下游靶點，當Notch 信號活化時，Hes1 的表達量升高，故而常作為Notch 信號活化的指示蛋白。通過Western blot 法檢測33 例乳腺癌組織中pS6 與Notch 配體Hes1 的蛋白表達水平，篩選后得到30 例有效結(jié)果，對Western blot 法檢測結(jié)果進行灰度分析，得到pS6 與Hes1 的整合密度值，結(jié)果如表2。

2.mTOR 與Notch 通路共同活化的相關性在低分化中更顯著:在免疫組化染色樣本中，低分化組樣本中pS6 與Notch1 相關性最大，相關系數(shù)為0.547(P ＜0.01)，隨著分化程度的升高，兩者相關性逐漸降低，中分化組中相關系數(shù)為0.431，高分化組中相關系數(shù)為0.199(表3)。而在良性對照組中，雖然pS6 均為陽性，Notch1 表達均＜5%或為陰性，幾乎完全不相關。說明在低分化乳腺癌中mTOR-Notch 通路活化程度最高。

表2 pS6 與Hes1 在Western blot 法中的整合密度值

表3 免疫組化染色樣本中mTOR 通路與Notch 通路表達與分化的關系

Western blot 法檢測樣本中可以得到類似結(jié)果，低分化組中pS6 與Hes1 相關性最高(相關系數(shù)=1.756，P ＜0. 01)，高于中高分化組(相關系數(shù)=0.613)，說明低分化乳腺癌中mTOR -Notch 通路活化程度最高，詳見表4。

表4 Western blot 法檢測樣本中mTOR-Notch 通路表達與分化的關系

3.mTOR 與Notch 相關性在具有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的乳腺癌中更顯著:在免疫組化樣本及Western blot法檢測樣本中，mTOR 與Notch 相關性均在陽性淋巴結(jié)率≥15%組更顯著(P 均＜0.05，表5、表6)。

表5 免疫組化樣本中mTOR-Notch 通路表達與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關系

表6 Western blot 法檢測樣本中mTOR-Notch 通路表達與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關系

4. mTOR 與Notch 相關性在ER(-)、HER -2(+)、Ki67 指數(shù)≥50%及p53(-)的乳腺癌中更顯著:在免疫組化樣本中，ER(-)組、HER -2(+)組，p53(-)組中，pS6 與Notch1 的相關性較同組更高，并且差異具有統(tǒng)計學意義(表7)。在Western blot 法檢測樣本中，ER(-)組、PR(-)組、HER -2(+)組及Ki67指數(shù)≥50%組中，pS6 與Hes1 相關性最高，差異具有統(tǒng)計學意義(表8)。

表7 免疫組化樣本中mTOR-Notch 通路表達與ER、PR、HER-2、p53 的關系

表8 Western blot 法檢測樣本中mTOR-Notch 通路表達與ER、PR、HER-2、Ki67 指數(shù)的關系

討 論

mTOR 通路活化后，通過上調(diào)Notch 信號通路抑制細胞分化，從而促進腫瘤增殖。這一現(xiàn)象在多個腫瘤細胞系中得到驗證。二者共同活化在乳腺癌組織中也具有高度的相關性。應用Western blot 法檢測及免疫組化染色，筆者證明了在乳腺癌組織中mTOR 與Notch 共同活化表達相關性與腫瘤分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、ER、PR、HER-2 表達、Ki67 指數(shù)及p53 突變情況有關。

結(jié)果顯示，低分化組中，mTOR 與Notch 相關性最高，隨著分化逐漸升高，相關性逐漸降低，在良性對照組中幾乎完全不相關。在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況的數(shù)據(jù)中筆者發(fā)現(xiàn)，陽性淋巴結(jié)率≥15%組兩者顯著相關，而＜15%組則無顯著相關，說明mTOR 與Notch 同時活化的腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移風險增加，而淋巴結(jié)低轉(zhuǎn)移組或陰性組，兩者無明顯相關。這些結(jié)果說明，在惡性度越高的乳腺癌組織中，mTOR 與Notch 越傾向于同時活化，而在惡性程度低或良性的乳腺腫瘤中則傾向于無明顯相關，因此筆者認為mTOR -Notch 通路活化可使乳腺腫瘤惡性程度升高。

在ER(-)、HER -2(+)、Ki67 指數(shù)≥50%及p53(-)的乳腺癌中，二者相關性更為顯著。ER、PR代表乳腺癌激素受體表達情況，HER -2 的表達也與乳腺癌預后相關。ER(-)、HER -2(+)均提示不良預后，高Ki67 指數(shù)反映腫瘤增殖活性較高，p53 為抑癌基因，其缺失亦提示不良預后［10，11］。以上結(jié)果均支持乳腺癌中惡性程度高的腫瘤具有更高的mTOR、Notch 通路相關性。本實驗也可對所選病例的患者進行隨訪，進一步驗證mTOR、Notch 高相關性與乳腺癌患者預后的關系。

本研究的結(jié)果提示，mTOR 與Notch 通路的共同活化，將來有可能作為檢測乳腺癌惡性程度及判斷預后的指標，并且由于mTOR 和Notch 通路的異常活化是乳腺癌發(fā)病的重要因素，使用mTOR 或Notch 抑制劑，或者二者聯(lián)合用藥，對乳腺癌進行靶向治療。這對未來乳腺癌靶向治療新方案及腫瘤個體化治療具有很好的指導意義。

1 Ma JH，Meng Y，Kwiatkowski DJ，et al.Mammalian target of rapamycin regulates murine and human cell differentiation through STAT3/p63/Jagged/Notch cascade［J］. J Clin Invest，2010. 120(1):103 -114

2 Perou CM，Sorlie T，Eisen MB，et al. Molecular portraits of human breast tumours［J］.Nature，2000. 406(6797):747 -752

3 Manning BD，Cantley LC，AKT/PKB signaling:navigating downstream［J］.Cell，2007，129(7):1261 -1274

4 Sabatini DM. mTOR and cancer:insights into a complex relationship［J］.Nat Rev Cancer，2006. 6(9):729 -734

5 Ehebauer M，Hayward P，Arias AM.Notch，a universal arbiter of cell fate decisions［J］.Science，2006，314(5804):1414 -1415

6 Chen VC，Stull R，Joo D，et al.Notch signaling respecifies the hemangioblast to a cardiac fate［J］.Nat Biotechnol，2008，26(10):1169 -1178

7 Robertson GP.Functional and therapeutic significance of Akt deregulation in malignant melanoma［J］. Cancer Metastasis Rev，2005，24(2):273 -285

8 McKenzie G，Ward G，Stallwood Y，et al. Cellular Notch responsiveness is defined by phosphoinositide 3 - kinase - dependent signals［J］.BMC Cell Biol，2006，7:10

9 石玉鐲，張舒，孫強，等.mTOR -Notch 通路在人乳腺癌組織中的驗證［J］.醫(yī)學研究雜志，2013，42(9):34 -37

10 Knight WA，Osborne CK，McGuire WL，Hormone receptors in primary and advanced breast cancer［J］.Clin Endocrinol Metab，1980，9(2):361 -368

11 Wright C，Angus B，Nicholson S，et al.Expression of c -erbB -2 oncoprotein:a prognostic indicator in human breast cancer［J］. Cancer Res，1989，49(8):2087 -2090