王洪振，陳 徐，黃二沖，程 軍，周曉馥，劉春明，金太成

(吉林師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,吉林 四平 136000)

0 引言

玉米(ZeamaysL)是重要的糧食、飼料和工業(yè)原料作物，玉米的組織培養(yǎng)研究是玉米生物技術(shù)育種的基礎(chǔ)性工作，一直深受重視．相對(duì)于玉米幼胚，玉米成熟種子易于大量保存，不受生長(zhǎng)季節(jié)和數(shù)量限制，可以隨時(shí)取用．因此，成熟玉米種子是一種較理想的適用于玉米組織培養(yǎng)的外植體．1974年，Green等首次報(bào)道玉米成熟胚組織培養(yǎng)誘導(dǎo)出愈傷組織，但是沒(méi)有獲得再生植株[1]．1987年，Wang等報(bào)道利用玉米成熟胚組織培養(yǎng)得到了再生植株[2]．此后，以成熟胚為外植體的玉米組織培養(yǎng)取得成功的報(bào)道越來(lái)越多[3-9]．

玉米種子消毒是成熟胚組織培養(yǎng)的第一步，對(duì)玉米成熟胚組織培養(yǎng)的成功有重要影響．現(xiàn)有的報(bào)道中，大部分實(shí)驗(yàn)中使用0.1%升汞(HgCl2)作為消毒劑[10-24]，也有使用0.2%升汞的報(bào)道[25]．趙錦慧等研究了0.1%升汞消毒時(shí)間對(duì)成熟胚污染率的影響，結(jié)果表明，消毒時(shí)間在5 min以上時(shí),胚無(wú)污染現(xiàn)象,但8 min以上時(shí),胚周?chē)邪l(fā)黑現(xiàn)象,消毒時(shí)間越長(zhǎng),發(fā)黑癥狀越嚴(yán)重．因此,綜合污染情況以及誘導(dǎo)與繼代情況,確定最適合的消毒時(shí)間為5～7 min[15]．由于升汞(氯化汞)是一種劇毒試劑，消毒原理是Hg2+可以與帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)結(jié)合，使蛋白質(zhì)變性，從而殺死菌體．升汞的消毒效果極佳，但易在植物材料上殘留．消過(guò)毒的外植體材料要用無(wú)菌水反復(fù)多次洗滌以將藥劑除凈．氯化汞也會(huì)給環(huán)境造成較大污染，應(yīng)盡量減少或不用氯化汞為宜[26]．

次氯酸鈉也是一種植物組織培養(yǎng)中常用的消毒劑，它可以釋放出活性氯離子，從而殺死菌體．其消毒能力很強(qiáng)，而且消毒后氯氣很容易揮發(fā)而不會(huì)因?yàn)橄緞埩舳鴮?duì)材料造成傷害，對(duì)環(huán)境無(wú)害．2011年，呂杰等報(bào)道使用10%次氯酸鈉消毒處理玉米種子進(jìn)行玉米成熟胚組織培養(yǎng)的研究[27]．當(dāng)前使用次氯酸鈉進(jìn)行玉米種子消毒的報(bào)道較少，因此本文設(shè)計(jì)了2%次氯酸鈉溶液對(duì)三種玉米種子進(jìn)行不同時(shí)間的消毒處理，目的是優(yōu)化以次氯酸鈉為消毒劑的玉米種子消毒條件，以減少氯化汞的使用，為以成熟玉米種子為材料的實(shí)驗(yàn)研究提供更加環(huán)保的消毒方法．

1 材料與方法

1.1 材料

(1)實(shí)驗(yàn)中所用玉米(Zeamays)種子為平育2B、神50、神56．

(2)試劑.無(wú)水乙醇、MS基本鹽等均為市售分析純?cè)噭温人徕c溶液有效氯含量為10%，現(xiàn)用現(xiàn)配，用蒸餾水稀釋五倍即為本實(shí)驗(yàn)所用2%次氯酸鈉溶液．

(3)儀器設(shè)備.ACCULAB ALC-110.4電子天平，德國(guó)Sartorious 集團(tuán)；YXQ-LS-50SⅡ立式蒸汽滅菌器，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；DL-CJ-2ND 型超凈工作臺(tái)，北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司；PGX-450D型智能光照培養(yǎng)箱，寧波海曙賽福實(shí)驗(yàn)儀器廠.

1.2 方法

(1)玉米種子消毒及浸泡處理 挑選大小均勻飽滿的成熟玉米種子，用清水沖洗后用75%乙醇消毒1 min，2%次氯酸鈉溶液分別消毒4 min、6 min、8 min、10 min、12 min．然后放入無(wú)菌50 ml三角瓶中，每瓶10粒種子，加入無(wú)菌水，以剛能浸沒(méi)為準(zhǔn)． (2)玉米種子污染觀察 將消毒后的種子放入培養(yǎng)箱中進(jìn)行暗培養(yǎng)，溫度設(shè)為26 ℃．每天觀察種子生長(zhǎng)情況，以種子長(zhǎng)菌和無(wú)菌水變渾濁為污染標(biāo)準(zhǔn)，并分別于24 h、48 h、72 h和96 h進(jìn)行觀察．(3)成熟胚愈傷組織的誘導(dǎo) 以優(yōu)化后的消毒條件處理玉米種子神56，無(wú)菌水浸泡72 h后剝?nèi)〕墒炫?，沿胚軸縱切兩半，切口向下接種于MS愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，在25 ℃±1 ℃智能光照培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)三周后統(tǒng)計(jì)愈傷組織誘導(dǎo)率并進(jìn)行繼代培養(yǎng)．

愈傷組織誘導(dǎo)率=(出愈的胚數(shù)/接種的胚數(shù))×100%．

1.3 培養(yǎng)基

實(shí)驗(yàn)中所用培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基，除基本培養(yǎng)基不同外均添加:Glu(300 mg/L)+CH(500 mg/L)+Pro(700 mg/L)+KT(0.5 mg/L)+3%蔗糖+瓊脂(7.5 g/L)，pH 5.8.在此基礎(chǔ)上，添加不同濃度的2,4-D制成誘導(dǎo)培養(yǎng)基，所用2,4-D濃度分別為0.5、1.0、2.0、3.0、4.0 mg/L，分別命名為k1、k2、k3、k4、k5培養(yǎng)基,常規(guī)高壓消毒．試驗(yàn)中所用繼代培養(yǎng)基分別與所用誘導(dǎo)培養(yǎng)基相同．

2 結(jié)果與分析

2.1 玉米種子消毒條件的優(yōu)化

三種玉米種子平育2B、神50、神56，分別用2%次氯酸鈉溶液消毒4 min、6 min、8 min、10 min，12 min，結(jié)果如表1、表2和表3所示．“-”表示未污染，“+”表示已經(jīng)污染．

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，2%次氯酸鈉溶液處理玉米種子平玉2B 8 min以上，處理玉米種子神50 8 min以上，處理玉米種子神56 10 min以上均達(dá)到了較好的消毒效果．

2.2 神56成熟胚愈傷組織的誘導(dǎo)與繼代

不同2,4-D濃度對(duì)神56愈傷組織誘導(dǎo)率的影響見(jiàn)圖1．在五種成熟胚誘導(dǎo)培養(yǎng)基k1、k2、k3、k4、k5上，神56成熟胚均成功誘導(dǎo)出愈傷組織，在k3培養(yǎng)基上的誘導(dǎo)效果最佳．

表1 玉米種子平育2B 2%次氯酸鈉溶液消毒結(jié)果

表2 玉米種子神56 2%次氯酸鈉溶液消毒結(jié)果

表3 玉米種子神56 2%次氯酸鈉溶液消毒結(jié)果

3 討論與結(jié)論

3.1 玉米種子的消毒

玉米種子的消毒是實(shí)驗(yàn)研究的第一步，對(duì)后續(xù)實(shí)驗(yàn)的成功起著非常重要的作用．玉米種子的消毒不僅在玉米成熟胚培養(yǎng)中有重要應(yīng)用，而且在以玉米種子為基礎(chǔ)的萌動(dòng)胚和以玉米幼苗不同部位為外植體的其他研究中也有廣泛的應(yīng)用，近年來(lái)這方面的報(bào)道也越來(lái)越多[28-30]．這些報(bào)道中進(jìn)行玉米種子消毒所用的消毒劑都是升汞(氯化汞)．氯化汞作為最為常用的消毒劑，殺菌能力最強(qiáng)，但它對(duì)外植體的傷害也最大，且不易去除，一般使用0.01%～1%低濃度[31]．如前所述，氯化汞也會(huì)給環(huán)境造成較大污染，應(yīng)盡量減少或不用氯化汞為宜[26]．次氯酸鈉殺菌力強(qiáng)，易去除，不留殘毒，是使用較多的殺菌劑之一[32]．因此本實(shí)驗(yàn)優(yōu)化了以次氯酸鈉為消毒劑的玉米種消毒條件優(yōu)化研究．結(jié)果表明，使用2%次氯酸鈉溶液處理玉米種子10 min以上達(dá)到很好的消毒效果．

為了進(jìn)一步檢驗(yàn)次氯酸鈉對(duì)玉米種子的消毒效果和實(shí)際應(yīng)用，實(shí)驗(yàn)中選取神56玉米種子進(jìn)行成熟胚培養(yǎng)研究．在五種誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，均誘導(dǎo)出了愈傷組織，實(shí)驗(yàn)結(jié)果(見(jiàn)圖1)表明本實(shí)驗(yàn)的玉米種子消毒條件可以應(yīng)用于玉米成熟胚的組織培養(yǎng)研究中．

3.2 神56成熟胚愈傷組織的誘導(dǎo)

圖1 神56成熟胚不同誘導(dǎo)培養(yǎng)基的培養(yǎng)結(jié)果

本實(shí)驗(yàn)也研究了不同質(zhì)量濃度2,4-D對(duì)神56玉米種子成熟胚誘導(dǎo)的影響．實(shí)驗(yàn)中設(shè)計(jì)了五種愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基，所用2,4-D質(zhì)量濃度分別為0.5、1.0、2.0、3.0、4.0 mg/L，分別命名為k1、k2、k3、k4、k5培養(yǎng)基．實(shí)驗(yàn)結(jié)果(見(jiàn)圖1)表明在一定濃度范圍內(nèi)，玉米成熟胚的愈傷組織誘導(dǎo)率隨著2,4-D的濃度增加而增大．當(dāng)2,4-D濃度為2.0 mg/L時(shí)，誘導(dǎo)率達(dá)到最大，濃度繼續(xù)增大時(shí)，誘導(dǎo)率反而下降．因此k3培養(yǎng)基的誘導(dǎo)效果最好,所用激素組合為2.0 mg/L 2,4-D和0.5 mg/L KT．

本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果與賈秀萍、張立軍和季麗麗等的結(jié)果相似，而與項(xiàng)艷和裴冬麗等的結(jié)果略有不同．賈秀萍、張立軍和季麗麗等人的研究表明2,4-D濃度為2.0 mg/L時(shí)愈傷組織的誘導(dǎo)率最高[11,13,23]．項(xiàng)艷等的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明自交系178在含有4.0 mg/L 2,4-D的誘導(dǎo)培養(yǎng)基上產(chǎn)生了最高的愈傷組織誘導(dǎo)頻率[10]．裴冬麗等發(fā)現(xiàn)豫玉32在添加4.0 mg/L 2,4-D的培養(yǎng)基上胚性愈傷組織誘導(dǎo)率最高[20]．綜合分析導(dǎo)致所用2,4-D質(zhì)量濃度不同的原因，是由于進(jìn)行成熟胚愈傷組織誘導(dǎo)時(shí)不同的玉米品系對(duì)外源植物激素的需求不同所致．因此，不同的玉米品系進(jìn)行成熟胚培養(yǎng)時(shí)，對(duì)外源植物激素開(kāi)展優(yōu)化研究是非常有必要的．

總之，本研究以三種玉米種子平育2B、神50、神56為實(shí)驗(yàn)材料，優(yōu)化了以次氯酸鈉為消毒劑的消毒條件，為當(dāng)前以升汞為主要消毒劑的研究提供了替代方法．本研究還優(yōu)化了神56成熟胚愈傷組織的誘導(dǎo)條件，這些結(jié)果必將在以玉米種子為材料的研究中發(fā)揮越來(lái)越重要的參考作用．

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