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        一株淡色生赤殼菌的生防作用分析及系統(tǒng)發(fā)育樹構建

        2014-01-14 04:39:38陳秀玲李景富張麗莉張俊峰王傲雪
        生物技術通報 2014年5期
        關鍵詞:淡色生防菌灰霉病

        陳秀玲 李景富 張麗莉 張俊峰 王傲雪

        (東北農(nóng)業(yè)大學,哈爾濱 150030)

        隨著市場需求量的增加,果蔬的種植面積越來越大,特別是保護地栽培面積的增加,病害的防控成為生產(chǎn)環(huán)節(jié)的重中之重。傳統(tǒng)的化學防治,不僅造成果蔬上的農(nóng)藥殘留,危及人畜健康,而且嚴重的污染環(huán)境,已不符合當前人們對品質生活的要求。同時,化學農(nóng)藥的大量使用,導致了耐藥性菌株的出現(xiàn),使防治效果不斷下降[1-3]。運用微生物進行生物防治是一種有效的防治手段,在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的作用也逐漸體現(xiàn)[4]。近年來,越來越多的微生物被分離和鑒定出來,用于生物防治的研究[5,6]。

        真核生物的rRNA 基因是高度重復的串聯(lián)序列單位,由18S、5.8S 和28S rRNA 聯(lián)結組成1 個轉錄單位,彼此被轉錄單元內(nèi)間隔區(qū)(ITS)分開[7]。其中核糖體RNA 中的ITS 序列的進化速率較快,已被廣泛用于探討屬內(nèi)種間甚至種內(nèi)個體間的遺傳關系。在動物、高等植物、真菌以及藻類等種質鑒定及系統(tǒng)進化研究中發(fā)揮了重要作用[8-11]。

        本實驗室從草炭土中分離得到一株生防真菌,對多種病害均能起到抑制作用。本研究在對該菌生防作用研究的基礎上,對其5.8S rDNA-ITS 的基因片段進行擴增分析,構建系統(tǒng)發(fā)育樹,對其遺傳分類地位進行分析,旨在為進一步利用該菌進行生物防治奠定理論基礎。

        1 材料與方法

        1.1 材料

        供試生防菌從吉林市郊草炭土中分離得到,供試病原菌番茄灰霉?。˙otrytis cinerea)、番茄葉霉?。–ladosporium fulvum)、番茄綿疫?。≒hytophthora parasitica)、番茄黃萎?。╒ertillium dahliae)、番茄枯萎?。‵usarium wilt)、楊樹爛皮病(Valsa sordida Nit.)、楊樹枯萎病(Alternaria)、黑穗醋栗葉斑病(Pseudopeziza ribis Kleb.)病原真菌由實驗室保存。

        1.2 方法

        1.2.1 供試生防菌的分離 采用平板分離法,每升分離培養(yǎng)基包含MgSO4·7H2O 0.5 g、K2HPO40.8 g、KCl 0.15 g、NH4NO31 g、葡萄糖3 g 和瓊脂20 g。高壓滅菌后,加入終濃度為0.5 g/L 的氯霉素制備分離平板,以抑制細菌的生長。取1 g 土樣,溶解于9 mL 無菌水中,涂布平板后置于22℃恒溫培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng),待長出菌落后,轉接到馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(potato-dextrose agar,PDA)上,進行單孢分離。取純化的菌落,進行后續(xù)試驗。

        1.2.2 供試菌株抑菌效果分析 利用對峙培養(yǎng)法,對供試菌株生防作用進行研究。生防菌與病原菌分別接種于相同組分的PDA 培養(yǎng)基上活化,然后分別從各活化菌落邊緣用打孔器打下10 mm 直徑的菌絲餅,將病原菌分別與生防菌對峙培養(yǎng)。生防菌菌絲餅與病原菌菌絲餅間距離為4 cm,并以單獨培養(yǎng)的病原菌菌絲餅為對照。每組試驗重復進行3 次,對峙培養(yǎng)試驗培養(yǎng)皿在22℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)。分別在接種后第4 天、第8 天測量菌落生長直徑,計算抑菌率。抑菌率計算公式為:抑菌率(%)=[(對照平均直徑-處理平均直徑)/對照平均直徑]×100%。

        1.2.3 供試菌株與番茄灰霉病病原菌共生的掃描電鏡分析 供試生防菌與番茄灰霉病菌共培養(yǎng)在同一個培養(yǎng)皿中,兩種菌接種間距為1 cm,在共培養(yǎng)的3、4、5、6 和7 d 分別取樣,以供試生防菌和番茄灰霉病菌的單獨培養(yǎng)為對照,掃描電鏡下觀察不同培養(yǎng)時間兩種菌間的相互作用。

        1.2.4 供試菌株基因組DNA 提取 從生長10 d 的PDA 固體培養(yǎng)基上刮取100 mg 菌絲體,在液氮中迅速研磨,基因組DNA 提取采用改良CTAB 法[12]。經(jīng)5 μL RNaseA(10 mg/mL)的消化后,DNA 沉淀溶于30 μL ddH2O 中,經(jīng)瓊脂糖電泳及分光光度計檢測后保存到-20℃?zhèn)溆谩?/p>

        1.2.5 供試菌株5.8S rDNA-ITS 基因片段擴增 5.8S rDNA-ITS 基因片段擴增采用引物ITS4 5'-TCCTCCG- CTTATTGATATGC-3',ITS5:5'-CCTTGTTACGACTTTTACTTCC-3'[13]。PCR 反應體系25 μL,包括DNA模板25 ng,上下游引物各1 μL,PCR 緩沖液(10×)2.5 μL,dNTP(2.5 mmol/L)2.0 μL,0.5 U Taq 酶1.0 μL,用ddH2O 補齊25 μL。擴增條件:94℃變性3 min;94℃變性40 s,52℃退火1 min,72℃延伸 2 min,35 次循環(huán);最后72℃延伸10 min。利用UNIQ-10 柱式DNA 膠回收試劑盒(上海生工生物工程技術服務有限公司)純化PCR 產(chǎn)物,peasy-T1 cloning vector試劑盒(北京全式金生物技術有限公司)連接、轉化后,進行藍白斑篩選。選取單克隆進行PCR 檢測,陽性克隆送至北京六合華大基因科技股份有限公司測序。

        1.2.6 序列分析及系統(tǒng)發(fā)育樹構建 序列比對利用NCBI 數(shù) 據(jù) 庫 的BlastX 工 具(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)進行,序列多重比對利用EBI數(shù)據(jù)庫的Clustal 在線工具(http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2/index.html)和Clustalx 2.012 軟 件 進行[14]。系統(tǒng)發(fā)育樹構建利用MEGA 5.0(http://www.megasoftware.net/)[15],采用相鄰連接法(Neighborjoining,NJ)構建系統(tǒng)發(fā)育樹,對構建的樹進行自檢(Bootstrap),重復設定為1 000 次。

        2 結果

        2.1 供試生防菌的獲得及菌株抑菌效果分析

        分離到的菌株培養(yǎng)初期菌落為白色,隨培養(yǎng)時間的增加逐漸轉黃;在光照條件下為粉紅色或橘紅色。抑菌試驗(圖1)表明,供試生防菌對供試病原菌都有一定抑制作用,抑菌效果隨培養(yǎng)時間的增加而逐漸提高。供試生防菌與病原菌接觸后病原菌菌落直徑不再增加,而供試生防菌逐漸侵入病原菌生長圈。在培養(yǎng)后8 d 供試生防菌對B. cinerea、P. parasitica、P. ribis Kleb.抑菌率達87.5%,對Vertill- ium dahliae、Alternaria、F. wilt、C. fulvum 和V. sordida Nit.的抑菌率分別為80%、78%、75%、62.8%和62.5%,說明供試生防菌具有一定的抑菌作用。

        圖1 抑菌效果分析

        2.2 供試菌株與番茄灰霉病病原菌共生的掃描電鏡分析

        供試菌株與番茄灰霉病菌共培養(yǎng)時,番茄灰霉病的生長受到明顯抑制。在共培養(yǎng)3 d 時,兩種菌的菌絲剛剛接觸,灰霉病病原菌的生長幾乎未受到影響(圖2-A)。隨著共培養(yǎng)時間的增長(5 d),B. cinerea 的受抑制狀況明顯加強(圖2-B)。到了共培養(yǎng)后期(7 d),灰霉病菌的菌絲體較弱,且無分生孢子產(chǎn)生,而供試生防菌生長旺盛,并且產(chǎn)生大量分生孢子(圖2-C)。由此進一步證實番茄灰霉病病原菌的生長受供試生防菌的抑制。

        圖2 供試菌株與番茄灰霉病菌共生的電鏡分析

        2.3 菌株DNA的提取

        提取出的菌株DNA,稀釋10 倍后,經(jīng)紫外分光光度計測定,OD260/OD280>1.8,DNA 純度較好。經(jīng)計算后,DNA 濃度為396.5 ng/μL(表1)。

        表1 菌株DNA 提取物純度和含量測定結果

        2.4 5.8S rDNA-ITS序列分析

        以基因組DNA 為模板,通過PCR 反應,對5.8S rDNA-ITS 和18S rDNA 擴增產(chǎn)物純化、測序后,得到593 bp 的片段(圖3)。

        圖3 18S rDNA 及 5.8S rDNA-ITS PCR 產(chǎn)物

        圖4 基于5.8S rDNA-ITS 序列的多序列比對分析

        將測序得到的5.8S rDNA-ITS 序列與GenBank/EMBL/DDBJ 數(shù)據(jù)庫中已知菌株的5.8S rRNA-ITS 經(jīng)BLAST 搜索比對及(http://www.ebi.ac.uk/Tools/clus talw2/ index.html)和(http://www.ch.embnet.org/softw are/BOX_form.html)在線比對,得知5.8S rDNA-ITS序列包括了菌株的部分18S rDNA、全部ITS1、5.8S rDNA、ITS2 序列和部分28S rDNA 序列(圖4)。該菌株5.8S rDNA-ITS 與Bionectria ochroleuca xsd08089(淡色生赤殼菌)最為接近,其相似性達94%。結合該菌株的菌落、菌絲及分生孢子的形態(tài)特征,初步確定該菌株屬于淡色生赤殼菌。將該菌株5.8S rDNA-ITS 序列登陸GenBank,登記號為GU112754,命名為WY-1。

        2.5 供試菌株的系統(tǒng)發(fā)育分析

        在NCBI 數(shù)據(jù)庫中,搜索已報道的具有生防作用的真菌的5.8S rDNA-ITS 序列,進行的系統(tǒng)發(fā)育樹構建(圖5)。以常見的木霉屬(Trichoderma)為例,木霉屬為無性型,其有性型為肉座菌屬(Hypocrea),本研究中利用5.8S rDNA-ITS 序列將T. harzianum、T. viride、T. atroviride、H. pachybasioides 和H. virens 聚為一大類,表明此進化樹構建成功。供試菌株WY-1與B. ochroleuca 和Clonostachys rosea 聚為一類,其中C. rosea 為B. ochroleuca 的無性型,進一步證明了供試菌株WY-1 屬于淡色生赤殼菌。

        圖5 基于5.8S rDNA-ITS 序列的系統(tǒng)發(fā)育樹

        3 討論

        淡色生赤殼菌是優(yōu)良的生防菌,是一類廣泛存在于土壤中近似于木霉的植物病原真菌的重寄生菌,可寄生多種植物病原真菌的菌絲和菌核,具有較好的生防潛力,已用于防治多種植物病害。

        核糖體RNA 基因(rDNA)序列分析被認為是最能反應物種之間遺傳關系的指標之一[16],真菌核糖體內(nèi)轉錄間隔區(qū)(ITS)是位于核糖體大小亞基rRNA 之間的區(qū)域,被5.8S rRNA 基因分隔為ITS1和ITS2 片段。ITS1 和ITS2 是中度保守區(qū)域,其保守性基本上表現(xiàn)為種內(nèi)相對一致,種間差異比較明顯。這種特點使ITS 非常適合于真菌物種的分子鑒定以及屬內(nèi)物種間或種內(nèi)差異較明顯的菌群間的系統(tǒng)發(fā)育關系分析[17,18]。

        本研究通過對供試菌株的5.8S rDNA-ITS 序列的測序結果分析,確定該菌株為淡色生赤殼菌,但該菌株的5.8S rDNA-ITS 序列與GenBank 核酸數(shù)據(jù)庫中的已知淡色生赤殼菌序列只有94%的相似性。說明該菌株在進化過程中基因發(fā)生了突變,發(fā)育成一株新的淡色生赤殼菌菌株,可用來防治菌核病菌、尖鐮孢霉、最終極腐霉等真菌病害,在苗床使用其制成的菌劑,提高育苗與移植的成活率,保持秧苗健壯生長,被認為是以菌治菌最有希望的生物農(nóng)藥。

        4 結論

        本研究對一株從草炭土中分離的生防菌進行了抑菌作用分析,該菌對番茄灰霉病、番茄葉霉病、番茄綿疫病、番茄黃萎病、番茄枯萎病、楊樹爛皮病、楊樹枯萎病和黑穗醋栗葉斑病均有抑制作用。利用5.8S rDNA-ITS序列比對分析及系統(tǒng)發(fā)育樹構建表明,該菌為淡色生赤殼菌,確定了其遺傳分類地位。

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