陳秀玲 李景富 張麗莉 張俊峰 王傲雪

（東北農(nóng)業(yè)大學，哈爾濱 150030）

隨著市場需求量的增加，果蔬的種植面積越來越大，特別是保護地栽培面積的增加，病害的防控成為生產(chǎn)環(huán)節(jié)的重中之重。傳統(tǒng)的化學防治，不僅造成果蔬上的農(nóng)藥殘留，危及人畜健康，而且嚴重的污染環(huán)境，已不符合當前人們對品質生活的要求。同時，化學農(nóng)藥的大量使用，導致了耐藥性菌株的出現(xiàn)，使防治效果不斷下降［1-3］。運用微生物進行生物防治是一種有效的防治手段，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的作用也逐漸體現(xiàn)［4］。近年來，越來越多的微生物被分離和鑒定出來，用于生物防治的研究［5，6］。

真核生物的rRNA 基因是高度重復的串聯(lián)序列單位，由18S、5.8S 和28S rRNA 聯(lián)結組成1 個轉錄單位，彼此被轉錄單元內(nèi)間隔區(qū)（ITS）分開［7］。其中核糖體RNA 中的ITS 序列的進化速率較快，已被廣泛用于探討屬內(nèi)種間甚至種內(nèi)個體間的遺傳關系。在動物、高等植物、真菌以及藻類等種質鑒定及系統(tǒng)進化研究中發(fā)揮了重要作用［8-11］。

本實驗室從草炭土中分離得到一株生防真菌，對多種病害均能起到抑制作用。本研究在對該菌生防作用研究的基礎上，對其5.8S rDNA-ITS 的基因片段進行擴增分析，構建系統(tǒng)發(fā)育樹，對其遺傳分類地位進行分析，旨在為進一步利用該菌進行生物防治奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

供試生防菌從吉林市郊草炭土中分離得到，供試病原菌番茄灰霉?。˙otrytis cinerea）、番茄葉霉?。–ladosporium fulvum）、番茄綿疫?。≒hytophthora parasitica）、番茄黃萎?。╒ertillium dahliae）、番茄枯萎?。‵usarium wilt）、楊樹爛皮病（Valsa sordida Nit.）、楊樹枯萎病（Alternaria）、黑穗醋栗葉斑病（Pseudopeziza ribis Kleb.）病原真菌由實驗室保存。

1.2 方法

1.2.1 供試生防菌的分離 采用平板分離法，每升分離培養(yǎng)基包含MgSO4·7H2O 0.5 g、K2HPO40.8 g、KCl 0.15 g、NH4NO31 g、葡萄糖3 g 和瓊脂20 g。高壓滅菌后，加入終濃度為0.5 g/L 的氯霉素制備分離平板，以抑制細菌的生長。取1 g 土樣，溶解于9 mL 無菌水中，涂布平板后置于22℃恒溫培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)，待長出菌落后，轉接到馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（potato-dextrose agar，PDA）上，進行單孢分離。取純化的菌落，進行后續(xù)試驗。

1.2.2 供試菌株抑菌效果分析 利用對峙培養(yǎng)法，對供試菌株生防作用進行研究。生防菌與病原菌分別接種于相同組分的PDA 培養(yǎng)基上活化，然后分別從各活化菌落邊緣用打孔器打下10 mm 直徑的菌絲餅，將病原菌分別與生防菌對峙培養(yǎng)。生防菌菌絲餅與病原菌菌絲餅間距離為4 cm，并以單獨培養(yǎng)的病原菌菌絲餅為對照。每組試驗重復進行3 次，對峙培養(yǎng)試驗培養(yǎng)皿在22℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)。分別在接種后第4 天、第8 天測量菌落生長直徑，計算抑菌率。抑菌率計算公式為：抑菌率（%）=［（對照平均直徑-處理平均直徑）/對照平均直徑］×100%。

1.2.3 供試菌株與番茄灰霉病病原菌共生的掃描電鏡分析 供試生防菌與番茄灰霉病菌共培養(yǎng)在同一個培養(yǎng)皿中，兩種菌接種間距為1 cm，在共培養(yǎng)的3、4、5、6 和7 d 分別取樣，以供試生防菌和番茄灰霉病菌的單獨培養(yǎng)為對照，掃描電鏡下觀察不同培養(yǎng)時間兩種菌間的相互作用。

1.2.4 供試菌株基因組DNA 提取 從生長10 d 的PDA 固體培養(yǎng)基上刮取100 mg 菌絲體，在液氮中迅速研磨，基因組DNA 提取采用改良CTAB 法［12］。經(jīng)5 μL RNaseA（10 mg/mL）的消化后，DNA 沉淀溶于30 μL ddH2O 中，經(jīng)瓊脂糖電泳及分光光度計檢測后保存到-20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5 供試菌株5.8S rDNA-ITS 基因片段擴增 5.8S rDNA-ITS 基因片段擴增采用引物ITS4 5'-TCCTCCG- CTTATTGATATGC-3'，ITS5：5'-CCTTGTTACGACTTTTACTTCC-3'［13］。PCR 反應體系25 μL，包括DNA模板25 ng，上下游引物各1 μL，PCR 緩沖液（10×）2.5 μL，dNTP（2.5 mmol/L）2.0 μL，0.5 U Taq 酶1.0 μL，用ddH2O 補齊25 μL。擴增條件：94℃變性3 min；94℃變性40 s，52℃退火1 min，72℃延伸 2 min，35 次循環(huán)；最后72℃延伸10 min。利用UNIQ-10 柱式DNA 膠回收試劑盒（上海生工生物工程技術服務有限公司）純化PCR 產(chǎn)物，peasy-T1 cloning vector試劑盒（北京全式金生物技術有限公司）連接、轉化后，進行藍白斑篩選。選取單克隆進行PCR 檢測，陽性克隆送至北京六合華大基因科技股份有限公司測序。

1.2.6 序列分析及系統(tǒng)發(fā)育樹構建 序列比對利用NCBI 數(shù) 據(jù) 庫 的BlastX 工 具（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/）進行，序列多重比對利用EBI數(shù)據(jù)庫的Clustal 在線工具（http：//www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2/index.html）和Clustalx 2.012 軟 件 進行［14］。系統(tǒng)發(fā)育樹構建利用MEGA 5.0（http：//www.megasoftware.net/）［15］，采用相鄰連接法（Neighborjoining，NJ）構建系統(tǒng)發(fā)育樹，對構建的樹進行自檢（Bootstrap），重復設定為1 000 次。

2 結果

2.1 供試生防菌的獲得及菌株抑菌效果分析

分離到的菌株培養(yǎng)初期菌落為白色，隨培養(yǎng)時間的增加逐漸轉黃；在光照條件下為粉紅色或橘紅色。抑菌試驗（圖1）表明，供試生防菌對供試病原菌都有一定抑制作用，抑菌效果隨培養(yǎng)時間的增加而逐漸提高。供試生防菌與病原菌接觸后病原菌菌落直徑不再增加，而供試生防菌逐漸侵入病原菌生長圈。在培養(yǎng)后8 d 供試生防菌對B. cinerea、P. parasitica、P. ribis Kleb.抑菌率達87.5%，對Vertill- ium dahliae、Alternaria、F. wilt、C. fulvum 和V. sordida Nit.的抑菌率分別為80%、78%、75%、62.8%和62.5%，說明供試生防菌具有一定的抑菌作用。

圖1 抑菌效果分析

2.2 供試菌株與番茄灰霉病病原菌共生的掃描電鏡分析

供試菌株與番茄灰霉病菌共培養(yǎng)時，番茄灰霉病的生長受到明顯抑制。在共培養(yǎng)3 d 時，兩種菌的菌絲剛剛接觸，灰霉病病原菌的生長幾乎未受到影響（圖2-A）。隨著共培養(yǎng)時間的增長（5 d），B. cinerea 的受抑制狀況明顯加強（圖2-B）。到了共培養(yǎng)后期（7 d），灰霉病菌的菌絲體較弱，且無分生孢子產(chǎn)生，而供試生防菌生長旺盛，并且產(chǎn)生大量分生孢子（圖2-C）。由此進一步證實番茄灰霉病病原菌的生長受供試生防菌的抑制。

圖2 供試菌株與番茄灰霉病菌共生的電鏡分析

2.3 菌株DNA的提取

提取出的菌株DNA，稀釋10 倍后，經(jīng)紫外分光光度計測定，OD260/OD280>1.8，DNA 純度較好。經(jīng)計算后，DNA 濃度為396.5 ng/μL（表1）。

表1 菌株DNA 提取物純度和含量測定結果

2.4 5.8S rDNA-ITS序列分析

以基因組DNA 為模板，通過PCR 反應，對5.8S rDNA-ITS 和18S rDNA 擴增產(chǎn)物純化、測序后，得到593 bp 的片段（圖3）。

圖3 18S rDNA 及 5.8S rDNA-ITS PCR 產(chǎn)物

圖4 基于5.8S rDNA-ITS 序列的多序列比對分析

將測序得到的5.8S rDNA-ITS 序列與GenBank/EMBL/DDBJ 數(shù)據(jù)庫中已知菌株的5.8S rRNA-ITS 經(jīng)BLAST 搜索比對及（http：//www.ebi.ac.uk/Tools/clus talw2/ index.html）和（http：//www.ch.embnet.org/softw are/BOX_form.html）在線比對，得知5.8S rDNA-ITS序列包括了菌株的部分18S rDNA、全部ITS1、5.8S rDNA、ITS2 序列和部分28S rDNA 序列（圖4）。該菌株5.8S rDNA-ITS 與Bionectria ochroleuca xsd08089（淡色生赤殼菌）最為接近，其相似性達94%。結合該菌株的菌落、菌絲及分生孢子的形態(tài)特征，初步確定該菌株屬于淡色生赤殼菌。將該菌株5.8S rDNA-ITS 序列登陸GenBank，登記號為GU112754，命名為WY-1。

2.5 供試菌株的系統(tǒng)發(fā)育分析

在NCBI 數(shù)據(jù)庫中，搜索已報道的具有生防作用的真菌的5.8S rDNA-ITS 序列，進行的系統(tǒng)發(fā)育樹構建（圖5）。以常見的木霉屬（Trichoderma）為例，木霉屬為無性型，其有性型為肉座菌屬（Hypocrea），本研究中利用5.8S rDNA-ITS 序列將T. harzianum、T. viride、T. atroviride、H. pachybasioides 和H. virens 聚為一大類，表明此進化樹構建成功。供試菌株WY-1與B. ochroleuca 和Clonostachys rosea 聚為一類，其中C. rosea 為B. ochroleuca 的無性型，進一步證明了供試菌株WY-1 屬于淡色生赤殼菌。

圖5 基于5.8S rDNA-ITS 序列的系統(tǒng)發(fā)育樹

3 討論

淡色生赤殼菌是優(yōu)良的生防菌，是一類廣泛存在于土壤中近似于木霉的植物病原真菌的重寄生菌，可寄生多種植物病原真菌的菌絲和菌核，具有較好的生防潛力，已用于防治多種植物病害。

核糖體RNA 基因（rDNA）序列分析被認為是最能反應物種之間遺傳關系的指標之一［16］，真菌核糖體內(nèi)轉錄間隔區(qū)（ITS）是位于核糖體大小亞基rRNA 之間的區(qū)域，被5.8S rRNA 基因分隔為ITS1和ITS2 片段。ITS1 和ITS2 是中度保守區(qū)域，其保守性基本上表現(xiàn)為種內(nèi)相對一致，種間差異比較明顯。這種特點使ITS 非常適合于真菌物種的分子鑒定以及屬內(nèi)物種間或種內(nèi)差異較明顯的菌群間的系統(tǒng)發(fā)育關系分析［17，18］。

本研究通過對供試菌株的5.8S rDNA-ITS 序列的測序結果分析，確定該菌株為淡色生赤殼菌，但該菌株的5.8S rDNA-ITS 序列與GenBank 核酸數(shù)據(jù)庫中的已知淡色生赤殼菌序列只有94%的相似性。說明該菌株在進化過程中基因發(fā)生了突變，發(fā)育成一株新的淡色生赤殼菌菌株，可用來防治菌核病菌、尖鐮孢霉、最終極腐霉等真菌病害，在苗床使用其制成的菌劑，提高育苗與移植的成活率，保持秧苗健壯生長，被認為是以菌治菌最有希望的生物農(nóng)藥。

4 結論

本研究對一株從草炭土中分離的生防菌進行了抑菌作用分析，該菌對番茄灰霉病、番茄葉霉病、番茄綿疫病、番茄黃萎病、番茄枯萎病、楊樹爛皮病、楊樹枯萎病和黑穗醋栗葉斑病均有抑制作用。利用5.8S rDNA-ITS序列比對分析及系統(tǒng)發(fā)育樹構建表明，該菌為淡色生赤殼菌，確定了其遺傳分類地位。

［1］ Palmer CL, Horst RK, Langhans RW. Use of bicarbonates to inhibit in vitro colony growth of Botrytis cinerea［J］. Plant Disease, 1997, 81（12）：1432-1438.

［2］ Knight SC, Anthony VM, Brady AM, et al. Rationale and perspectives on the development of fungicides［J］. Annual Reviews of Phytopathoogy, 1997, 35：349-372.

［3］ Zhang CQ, Hu JL, Wei FL, et al. Evolution of resistance to different classes of fungicides in Botrytis cinerea from greenhouse vegetables in eastern China［J］. Phytoparasitica, 2009, 37：351-359.

［4］ Sharma RR, Singh D, Singh R. Biological control of postharvest diseases of fruits and vegetables by microbial antagonists：A review［J］. Biological Control, 2009, 50：205-221.

［5］ Janisiewicz WJ, Pimenta RS, Jurick WM. A novel method for selecting antagonists against postharvest fruit decays originating from latent infections［J］. Biological Control, 2011, 59（3）：384-389.

［6］ Junaid JM, Dar NA, Bhat TA, et al. Commercial biocontrol agents and their mechanism of action in the management of plant pathogens［J］. Int J Modern Plant& Anim Sci, 2013,1（2）: 39-57.

［7］ 張志華, 洪葵.核酸序列直接分析在真菌鑒定方面的應用［J］.華南熱帶農(nóng)業(yè)大學學報, 2006, 12（2）：39-42.

［8］ Mark A, Ragan, Carolyn J, et al. Amolecular phylogeny of the marine red algae（Rhodophyta）based on the nuclear small-subunit rRNA gene［J］. Plant Biology, 1994, 91：7276-7280.

［9］ Freshwarer DW, Fredericq S. A gene phylogeny of the red algae（Rhodophyta）based on plastid rbcL［J］. Plant Biology, 1994, 91：7281-7285.

［10］ Gurgel CFD, Liao LM, Fredericq S, et al. Systematics of Gracilariopsis（Gracilariales, Rhodophyta）based on rbcL sequence analyses and morphological evidence［J］. Journal of Phycology, 2003, 39（1）：154-171.

［11］ 李敏, 隋正紅, 易恒, 等.龍須菜5.8S rRNA 和ITS 區(qū)的克隆與系統(tǒng)學分析［J］.中國海洋大學學報, 2009, 39：77-83.

［12］ 吳發(fā)紅, 黃東益, 黃小龍, 等.幾種真菌DNA 提取方法的比較［J］.中國農(nóng)學通報, 2009, 25（8）：62-64.

［13］ White TJ, Bruns TD, Lee SB, et al. Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics, ［M］//Imis MA. PCR Protocols：A guide to methods and applications. Academic Press, 1990：315-322.

［14］ Larkin MA, Blackshields G, Brown NP, et al. Clustal W and Clustal X version 2.0［J］. Bioinformatics, 2007, 23：2947-2948.

［15］ Tamura K, Peterson D, Peterson N, et al. MEGA5：molecular evolutionary genetics analysis using maximum likelihood, evolutionary distance, and maximum parsimony methods［J］. Molecular Biology and Evolution, 2011, 228（10）：2731-2739.

［16］ 孫廣宇, 彭友良, 李振歧, 等.核苷酸序列分析在真菌系統(tǒng)學研究中的應用［J］.西北農(nóng)林科技大學學報：自然科學版, 2003, 31（6）：187-192.

［17］ 哈瑞根.食品微生物實驗室手冊［M］.李衛(wèi)華, 譯.北京：中國輕工業(yè)出版社, 2004.

［18］ 林曉民, 李振岐, 王少先.真菌rDNA 的特點及在外生菌根菌鑒定中的應用［J］.西北農(nóng)業(yè)學報, 2005, 14（2）：120-125.