劉琳 賈培培 盧偉東 郭奇林 郭立忠

（1.青島農業(yè)大學生命科學學院 山東省應用真菌重點實驗室，青島 266109；2.西北農林大學生命科學學院，楊凌 712100）

真姬菇（Hypsizigus marmoreus），別名玉蕈，味道比平菇鮮，肉質比滑菇厚，質地脆嫩、口感極佳，因具有獨特的蟹香味，又稱蟹味菇。據報道，真姬菇富含蛋白質和人體必需的8 種氨基酸，在日本，人們把其與珍貴的松茸相提并論，享有“聞則松茸，食則玉蕈”的美譽，已成為僅次于金針菇的重要食用菌品種［1］。真姬菇含有多種生物活性物質，具有抗癌、防癌、降血壓、提高免疫力、延長壽命等獨特功效。從真姬菇子實體中提取的核糖體抑制蛋白Hypsin、膠原質蛋白HM23 及多糖均具有顯著的抗腫瘤效果［2-4］。Ikemizu 等［5］從真姬菇菌絲體中提取分離到血管緊張素轉換酶抑制劑（ACEI），ACEI 能夠有效降低血壓，減緩高血壓和糖尿病患者腎功能的衰退，且副作用小，世界衛(wèi)生組織將其推薦為抗高血壓的一線藥物。因此，真姬菇作為一種食藥兩用真菌具有巨大的開發(fā)潛力和良好的市場前景。

真姬菇屬于中偏低溫型食用菌，溫度是影響其生長及品質的重要因素［6］。菌絲生長最適溫度20-25℃，30℃以上生長緩慢，超過 35℃時菌絲不再生長，45℃以上無法存活。當溫度較高時，菌蓋變薄且展開加快，菇體色澤變白，鮮菇品質明顯下降。目前，真姬菇的栽培已經規(guī)?；捎诟邷貙ζ渖L的限制，增加了周年栽培成本，國內真姬菇只在大型超市中出售，且價格較高［7］。研究真姬菇溫度脅迫相關機理是解決高溫限制，降低生產成本、提高產量的有效方法，而真姬菇在高溫脅迫下的抗逆機理研究尚未見報道。本研究應用雙向電泳和質譜蛋白質組技術，通過比較最適溫度（25℃）和高溫脅迫條件下（42℃）真姬菇菌絲體的蛋白表達差異，篩選與高溫脅迫緊密相關的蛋白，并探討其功能，旨在為實現通過基因操作選育耐熱性強的優(yōu)良真姬菇菌種，降低周年栽培生產成本奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

白真姬菇G12 為青島農業(yè)大學山東省應用真菌重點實驗室保藏。將G12 接種到PDA 平板上，25℃培養(yǎng)3 周后分為兩組：對照組（繼續(xù)在25℃培養(yǎng)2 h）、高溫處理組（42℃熱激2 h）。

1.2 方法

1.2.1 菌絲體全蛋白的提取 刮取對照組和高溫處理組的真姬菇菌絲體各1.0 g，液氮研磨后，分別用Tris-飽和酚法［8］、TCA/丙酮法［9］、尿素裂解法［10］提取菌絲體全蛋白。采用Bradford 法［11］測定提取液中全蛋白總量，SDS-PAGE［12］檢測蛋白，分離膠濃度為12%，濃縮膠濃度為5%，Marker 上樣體積4 μL，蛋白上樣體積17 μL。

1.2.2 雙向電泳 選用24 cm 的IPG 膠條（pH4-7），蛋白上樣量1.2 mg，膠條水化16 h 后，進行等電聚焦。聚焦參數：溫度20℃，最大電流50 μA/膠條。聚焦程序：100 V×1 h，500 V×1 h，1 000 V×1 h，8 000 V×4 h，8 000 V×8 h，500 V×∞。第一向電泳等電聚焦結束后，迅速取出IPG 膠條，吸干膠條上的礦物油和多余的樣品，將膠條先后置于平衡緩沖液Ⅰ［6 mol/L 尿素、75 mmol/L Tris-HCl（pH8.8）、30%甘油、2% SDS、0.002% 溴酚藍、1% DTT］和平衡緩沖液Ⅱ［6 mol/L 尿素、75 mmol/L Tris-HCl（pH8.8）、30%甘油、2% SDS、0.002%溴酚藍、2.5%碘乙酰胺］中各平衡15 min，取出膠條，吸去多余的平衡液。第二向SDS-PAGE 凝膠電泳采用Ettan-DALT-Six 系統(tǒng)，水浴循環(huán)儀設定溫度為20℃，聚丙烯酰胺凝分離膠濃度為12.5%，電泳程序設置為2 W×45 min，17 W/gel 電泳至溴酚藍前沿距離玻璃板下緣0.5 cm 時停止電泳。凝膠染色采用銀染。

1.2.3 數據分析 凝膠銀染后，用UMAX 光密度掃描儀獲得分辨率為300dpi 的電子圖像。采用PDQuest8.0 版軟件進行圖象分析，為驗證自動檢測到的蛋白點，需要對所有蛋白點進行人工檢查和編輯，主要操作包括凝膠蛋白點檢測、圖像背景扣除、蛋白點灰度值標準化。比較處理組和對照組的雙向電泳圖譜，確定差異蛋白點（表達量差異倍數＞3.0），進行蛋白質的膠內酶解及肽段提?。?3］。樣品送北京華大蛋白組研發(fā)中心進行MALDI-TOF-MS 鑒定。根據質譜結果，用MASCOT 軟件搜索MSDB、NCBI 等數據庫，初步鑒定相關蛋白并分析其生理功能。

2 結果

2.1 全蛋白提取方法的評價

為了制備適合蛋白質組分析的蛋白樣品，獲得較好的雙向電泳效果，分別采用TCA/丙酮法、Tris-飽和酚法和尿素裂解法提取真姬菇菌絲體的全蛋白。Bradford 法檢測蛋白量結果表明，TCA/丙酮法獲得的蛋白總量最高，達到1.6 mg/g 菌絲體；Tris-飽和酚法稍低，蛋白量為1.36 mg/g 菌絲體；尿素裂解法僅得到蛋白0.89 mg/g 菌絲體。全蛋白提取液的SDSPAGE 結果（圖1）表明，3 種方法提取的菌絲體蛋白分子量都在19-118 kD 之間；全蛋白濃度大小順序為Tris-飽和酚法＞尿素裂解法＞TCA/丙酮法。將上述3 種方法制備的菌絲體全蛋白提取液應用于雙向電泳檢測，凝膠圖譜分析（圖2）表明，Tris-飽和酚法獲得的全蛋白提取液在凝膠上可檢測到900多個蛋白點且雜質少，而其它兩種方法的全蛋白提取液，圖譜上蛋白點較少。因此，選擇Tris-飽和酚法提取真姬菇對照組和高溫處理組的菌絲體全蛋白。

2.2 高溫脅迫下的差異表達蛋白

圖1 SDS-PAGE 檢測3 種方法提取的全蛋白

圖2 三種方法提取的全蛋白2-DE 圖譜

采用Tris-飽和酚法提取真姬菇菌絲體對照組和高溫處理組的全蛋白，然后進行雙向電泳檢測，用PDQuest8.0 版軟件分析電泳凝膠圖譜。對照組凝膠上約有890 個蛋白點，高溫處理組凝膠上約有930個蛋白點（圖3）。軟件分析對照組和高溫處理組的凝膠圖譜，篩選出12 個表達豐度差異倍數大于3 的蛋白點，其中6 個蛋白點的表達量上調，6 個蛋白點的表達量下調。凝膠上，這12 個蛋白點分布在分子量80 kD 以下，pH4-6 的區(qū)域。

圖3 對照組和高溫處理組菌絲體全蛋白2-DE 圖譜比較

2.3 差異表達蛋白的質譜鑒定

將12 個具有顯著表達差異的蛋白點進行質譜鑒定，根據獲得的信息用MASCOT 軟件搜索MSDB、NCBI 等數據庫，初步鑒定7 個蛋白。另外5 個蛋白由于分辨率或靈敏度不夠（酶解不充分或樣品含有雜質），或者因匹配率、覆蓋率太低未能被鑒定。7個被鑒定的蛋白質中，6 個蛋白表達量上調（點1、7、8、9、10 和11），1 個蛋白表達量下調（點2）。蛋白鑒定結果如下：DEHA2G15532p（點1），Spa2 同源結構域（點2），肽酶M76 家族（點7），HSP70（點8），SNF2家族的DNA 修復蛋白（點9），細胞色素p450（點10），SAM 域家族和鋅指蛋白的混合物（點11）。各蛋白的詳細信息見表1。

3 討論

3.1 菌絲體全蛋白的提取

TCA/丙酮法能夠將真姬菇菌絲體中的所有干物質沉淀，蛋白損失少，因此獲得的全蛋白總量最多。但其沉淀的蛋白因與膜或其它組織結合而較難溶解，需要大量裂解液才能溶解完全，所以蛋白質提取液濃度較低。Tris-飽和酚法由于只收集酚相、苯酚與水相的界面，蛋白質總量較TCA/丙酮法少，但沉淀蛋白易溶于裂解液，因此，獲得的蛋白提取液濃度最高。TCA/丙酮法制備的樣品由于雜質多且鹽濃度高，電壓很難順利到達聚焦電壓，聚焦不充分造成蛋白點較少；尿素裂解法獲得的全蛋白在雙向電泳凝膠圖譜上蛋白點較少，可能與樣品蛋白總量少且濃度較低有關。Tris-飽和酚法制備的全蛋白提取液，蛋白濃度高，蛋白總量能夠滿足雙向電泳檢測需求，獲得的雙向電泳圖譜，蛋白得率高，分辨率高，重復性好，因此，以Tris-飽和酚法作為真姬菇菌絲體全蛋白的提取方法。

表1 差異蛋白點的質譜鑒定結果

3.2 差異表達蛋白的功能分析

在已被鑒定的7 個蛋白中，DEHA2G15532p（點1）目前僅在漢遜德巴利酵母的兩個菌株中發(fā)現，數據庫中沒有其結構和功能的相關信息，其它6 個蛋白質按其參與的生理代謝過程歸納為5 類。

3.2.1 調節(jié)功能和信號轉導有關的蛋白質：Spa2 同源結構域（SHD）、SAM 域家族蛋白和鋅指蛋白 Spa2 同源結構域（SHD）與多種蛋白相互作用，參加細胞信號的轉導過程［14，15］。Ryan 等［16］的研究表明，SHD 是GIT（G-protein-coupled receptors kinase interacting protein）家族蛋白的功能域，能夠與p21 基因激活的磷酸化蛋白激酶（PAK）相互作用，PAK 通過調節(jié)Rac1/Cdc42 誘導激活絲裂原活化蛋白激酶（Mitogen-activated protein kinases，MAPKs），MAPKs信號轉導通路將細胞外刺激信號轉導至細胞及其核內，并引起細胞生物學反應，調節(jié)細胞的極化和分裂。在釀酒酵母細胞中，Spa2蛋白定位于極性生長點，為細胞極性生長所必需，另外，Spa2 蛋白在細胞交配過程中的形態(tài)學變化中起重要作用，缺失Spa2 基因，細胞交配效率降低了90%［17］。高溫脅迫下，真姬菇細胞通過Spa2 同源結構域參與的信號轉導過程，調節(jié)細胞的極性生長和分裂。SHD 的表達量下調導致細胞分裂次數減少或分裂周期延長，真姬菇菌絲細胞的生長繁殖受到抑制。這在一定程度上降低了細胞的能量消耗，有利于提高真姬菇在逆境中的生存能力。

Schultz 等［18］的研究表明，SAM 是重要的蛋白結合域，參與細胞內的信號轉導過程。pH 結構域是SAM 的重要功能區(qū)域，約由100-120 個氨基酸殘基組成，與磷酸肌醇類化合物具有很強的親和力［19］。SAM 域家族蛋白通過與磷酸肌醇類化合物的相互作用，對胞外刺激做出反應，轉移至細胞膜上［20］。另有文獻報道pH結構域能夠與G蛋白的β、γ亞基結合，并參與調節(jié)宿主蛋白的活性［21］。高溫處理后，SAM域家族蛋白的表達量顯著上調，說明它可能參與真姬菇抗高溫反應的信號轉導過程。Orrecilla 等［22］監(jiān)測了魚腥藻（Anabaena sp. PCC7120）細胞內的游離Ca2+濃度，發(fā)現熱激20 min 細胞內的游離Ca2+濃度達到最大值。試驗中我們發(fā)現熱激后真姬菇菌絲體細胞內的Ca2+濃度明顯增加。高溫脅迫下，真姬菇可能通過磷脂酰肌醇信號通路，以Ca2+作為第三信使，引發(fā)一系列生理生化反應，緩解逆境傷害。

鋅指蛋白（點11）是一種具有手指狀結構域的轉錄因子，通過和核酸結合或與蛋白質發(fā)生相互作用，在轉錄水平上調控基因的表達。高溫脅迫下，鋅指蛋白通過表達量上調，調控高溫相關基因的表達，參與真姬菇的高溫脅迫過程。

3.2.2 蛋白質降解有關的蛋白：肽酶M76 家族 肽酶M76 家族蛋白能夠將蛋白質直接水解為氨基酸［23］。有研究表明，高等植物在冷害、干旱、光輻射和高溫等環(huán)境脅迫下會誘導蛋白發(fā)生錯誤折疊，如果不受抑制將導致細胞死亡［24］。高溫下，Bt 棉棉鈴中的肽酶活性顯著增加，促進了蛋白質的分解，導致細胞內可溶性蛋白含量大幅度下降［25］。高溫脅迫下，真姬菇菌絲體細胞可能通過提高肽酶的表達量，促進錯誤折疊蛋白的降解，增強生存能力。

3.2.3 熱激蛋白：HSP70 HSP70 是高溫刺激誘導生成或增加合成的蛋白質，在機體中呈現重要的應對高溫的細胞策略［26］。高溫會導致細胞蛋白質的變性和聚集，如果不受抑制將導致細胞死亡。熱激蛋白與其他蛋白質結合，幫助蛋白質折疊，防止變性蛋白聚合，調節(jié)細胞內環(huán)境以適應外界高溫壓力［27］。Waters 等［28］研究指出植物以復雜的方式對熱脅迫產生應答，而HSP 在復雜的細胞網絡中起主導作用。陸兆明等［29］的研究表明，35℃高溫處理后，雙孢蘑菇菌絲體中HSP70 表達量顯著上調（為對照組的5 倍）。這與本試驗中，高溫處理后HSP70 表達量上調的結果一致?？梢?，HSP70 是食用菌耐熱機制中的重要蛋白之一，高溫下熱激蛋白的表達上調提高了真姬菇的耐熱性和存活率。

3.2.4 解毒有關的蛋白：細胞色素p450 細胞色素p450 是一類能與CO 結合形成復合物，在450 nm附近有最大吸收峰的含血紅素和硫羥基的蛋白。真菌細胞中，細胞色素p450 主要是催化一些具有重要生理功能的內源性物質，如激素、脂肪酸、萜類化合物等的生物合成代謝，以及參與許多外源性物質或一些有毒物質的生物氧化［30］。棉花中，細胞色素p450 的超量表達能顯著增加棉花對黃萎病的抗性［31］。高溫處理后，真姬菇菌絲體中細胞色素p450 的表達量上調，說明其可通過生物合成或代謝相關途徑參與熱應激反應，降低高溫對細胞的毒性。

3.2.5 DNA 修復有關的蛋白質：SNF2家族的DNA修復蛋白 DNA 修復蛋白質能夠通過對自身損傷DNA 的有效修復，維持DNA 的完整性和穩(wěn)定性。在不良環(huán)境條件下，生物體提高DNA 修復蛋白質的表達量是自我保護，防止突變的重要手段。高溫處理后真姬菇菌絲體DNA 修復蛋白的表達量上調是真姬菇在高溫條件下啟動的有效抗逆措施。

4 結論

本研究通過對最適溫度和高溫脅迫條件下真姬菇菌絲體蛋白質的差異表達分析，篩選鑒定出7 個與高溫脅迫相關的蛋白，分別為Spa2、 DEHA2G15532p、肽酶M76 家族、HSP70、SNF2家族的DNA 修復蛋白、細胞色素p450 及AM 域家族和鋅指蛋白的混合物。根據同源蛋白的功能分析探討了真姬菇的抗高溫機制。高溫脅迫下，真姬菇可通過多種機制抵抗高溫刺激。

［1］ 鄭宇, 林興生, 陳福如.真姬菇生物學特性研究初報［J］.食用菌, 2001, 23（3）：12-13.

［2］ Lam SK, Ng TB. Hypsin a novel thermostable ribosome-inactivating protein with antifungal and antiproliferative activities from fruiting bodies of the edible mushroom Hypsizigus marmoreus［J］. Biochemical and Biophysical Research Communications, 2001, 285：1071-1075.

［3］ Kazutaka T, Yutaka A, Shoji O, et al. Isolation of a novel collagenbinding protein from the mushroom, Hypsizigus marmoreus, which inhibits the lewis lung carcinoma cell adhesion to type IV collagen［J］. The Journal of Biological Chemistry, 1995, 270（4）：1481-1484.

［4］ Tetsuro I. Beneficial effects of edible and medicinal mushrooms on health care［J］. International Journal of Medicinal Mushrooms, 2001（3）：291-298.

［5］ Ikemizu S, Kishimoto M, Konishi H. Angiotensin-converting enzyme inhibitors of bunashimeji and enokitake［P］. JP：08099895, 1996, gen Im.

［6］ 李翠翠.真姬菇熱激蛋白HmHSP70 基因克隆及其原核表達分［D］.青島：青島農業(yè)大學, 2009.

［7］ 孫國慶, 郝滌非.蘇北地區(qū)發(fā)展真姬菇生產可行性研究［J］.食用菌, 2011（1）：5-7.

［8］ Yao Y, Yang YW, Liu JY. An efficient protein preparation for proteomic analysis of developing cotton fibers by 2-DE［J］. Electrophoresis, 2006, 27：4559-4569.

［9］ Wang W, Scali M, Vignani R, et al. Protein extraction for twodimensional electrophoresis from olive leaf, a plant tissue containing high levels of interfering compounds［J］. Electrophoresis, 2003, 24：2369-2375.

［10］ Grinyer J, McKay A, Nevalainen Herbert BR, Saraste M. Fungal proteomics：initial mapping of biological control strain Trichoderma harzianum［J］. Current Genet, 2004, 45：163-169.

［11］ Bradford MM. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of proteindye binding［J］. Anal Biochemistry, 1976, 72：248-254.

［12］ 郭堯君.蛋白質電泳實驗技術［M］. 第2 版. 北京：科學出版社, 2005.

［13］ Kumiko SK, Tadatoshi K, Noriko F, et al. Screening system for D-Asp-containing proteins using D-aspartyl endopeptidase and twodimensional gel electrophoresis［J］. Amino Acids, 2009, 36：125-129.

［14］ Sheu YJ, Santos B, Fortin N, et al. Spa2p interacts with cell polarity proteins and signaling components involved in yeast cell morphogenesis［J］. Molecular Cell Biology, 1998, 18：4053-4069.

［15］ Van DF, Peter M. Spa2 functions as a scaffold-like protein to recruit the Mpk1p MAP kinase module to sites of polarized growth［J］. Current Biology, 2002, 12：1698-1703.

［16］ Ryan JH, Bradford CB. The multifunctional GIT family of proteins［J］. Journal of Cell Science, 2006, 119：1469-1475.

［17］ Arkowiz RA, Lowe N. A small conserved domain in the yeast spa2p is necessary and sufficient for its polarized localization［J］. Journal of Cell Biology, 1997, 138（1）：17-36.

［18］ Schultz J, Bork P, Ponting CP, Hofmann K. SAM as a protein interaction domain involved in developmental regulation［J］. Protein Science, 1997, 6（1）：249-253.

［19］ Baltimore D, Mayer BJ, Ren R, Clark KL. A putative modular domain present in diverse signaling proteins［J］. Cell, 1993, 73（4）：629-630.

［20］ Gibson T, Musacchio A, Thompson J, et al. The PH domain：a common piece in the structural pathwork of signaling proteins［J］. Trends Biochemical Science, 1993, 18（9）：343-348.

［21］ Wang DS, Shaw R, Winkelmann JC, Shaw G. Binding of PH domains of β-adrenergic receptor kinase and β-spectrin to WD40/β-transducin repeat containing regions of the β-subunit of trimeric G-proteins［J］. Biochemical and Biophysical Research Communications, 1994, 203（1）：29-35.

［22］ Torrecilla I, Leganes F, Bonilla I. Use of recombinant aequorin to study calcium transients in response to heat and cold in cyanobacterial［J］. Plant Physiology, 2000, 123（1）：161-175.

［23］ Page MJ, Enrico DC. Evolution of peptidase diversity［J］. Journal of Biological Chemistry, 2008, 283：30010-30014.

［24］ 侯學文, 郭勇.泛肽與植物逆境響應［J］.植物生理學通訊, 1998, 6：474-478.

［25］ 姜周庚, 張延昭, 馮夢詩, 等.高溫脅迫對盛鈴期Bt 棉棉鈴中殺蟲蛋白表達量及氮代謝的影響［J］.中國棉花, 2012, 39（4）：13-15.

［26］ Sorensen JG, Kristensen TN, Loeschcke V. The evolutionary and ecological role of heat shock proteins［J］. Ecology Letters, 2003, 6（11）：1025-1037.

［27］ Krebs RA, Holbrook SH. Reduced enzyme activity following Hsp70 over expression I Drosophila melanogaster［J］. Biochemical Genetics, 2001, 39（1-2）：73-82.

［28］ Waters ER, Lee GJ, Vierling E. Evolution, structure and function of the small heat shock proteins in plants［J］. Journal of Experimental Botany, 1996, 47（3）：325-338.

［29］ 陸兆明, 徐禎, 王珂, 等.雙孢蘑菇耐溫差異蛋白質組學研究［J］.廈門大學學報：自然科學版, 2009, 48（4）：590-593.

［30］ 王海燕, 圖力故爾, 陳強, 黃晨陽.真菌細胞色素P450 研究進展［J］.食用菌學報, 2010, 17（2）：97-102.

［31］ 徐理, 朱龍付, 張獻龍.棉花抗黃萎病機制研究進展［J］.作物學報, 2012, 38（9）：1553-1560.