闞南方，張青瑞，楊曉萌，曹長青

（青島科技大學(xué)化工學(xué)院，山東 青島266042）

細胞內(nèi)的代謝網(wǎng)絡(luò)是一組酶反應(yīng)及傳輸互動的過程。體內(nèi)途徑通量的量化是細胞生理學(xué)和代謝工程學(xué)的一個重要目標(biāo)。隨著計算機技術(shù)的迅速發(fā)展，憑借數(shù)學(xué)和計算機系統(tǒng)結(jié)合理論方法對代謝過程進行量化分析，從而提高反應(yīng)效率和產(chǎn)物轉(zhuǎn)化率，有助于改進現(xiàn)有的生物反應(yīng)技術(shù)［1－2］。

大多數(shù)理論方法，例如代謝通量分析（MFA），都是以代謝網(wǎng)絡(luò)中各種代謝產(chǎn)物的化學(xué)計量反應(yīng)為基礎(chǔ)［3］。代謝網(wǎng)絡(luò)的反應(yīng)細節(jié)與實驗測得的胞外代謝產(chǎn)物積累速率相結(jié)合，以此為約束條件來確定通量分布。以化學(xué)計量為約束，線性規(guī)劃被用來最大化目標(biāo)函數(shù)，這同樣在通量平衡分析（FBA）中使用［3］。這些方法已廣泛應(yīng)用于各種微生物系統(tǒng)中。近年來，代謝網(wǎng)絡(luò)的反應(yīng)細節(jié)已經(jīng)被用來確定基元模式，它被定義為與胞外代謝產(chǎn)物相關(guān)的最小酶集合［4］，這些酶可以使該模式能夠在穩(wěn)定的代謝通量分布狀況下朝一定方向進行。基元模式分析易估計代謝產(chǎn)物的最大產(chǎn)量，確定反應(yīng)方向所固有的通量分布以及使用矩陣代數(shù)確定代謝網(wǎng)絡(luò)的通量［5］。Xu等［6］利用基元模式分析了釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）的葡萄糖厭氧發(fā)酵過程，預(yù)測出了最佳代謝路徑及代謝表型，有效地指導(dǎo)了工程菌株釀酒酵母的構(gòu)建，提高了乙醇產(chǎn)量。趙權(quán)宇等［7］綜述了基元模式分析（elementary modes analysis，EMA）的算法和軟件開發(fā)現(xiàn)狀及其在代謝通量分解、生物過程模擬、菌株設(shè)計等方面的應(yīng)用。

1，3－丙二醇（1，3－PD）作為具有優(yōu)良性質(zhì)的聚酯、聚醚和聚亞胺酯的單體，是一種應(yīng)用前景廣闊的化工原料［8］。生物柴油的生產(chǎn)過程中會副產(chǎn)10%的粗甘油，而克雷伯氏桿菌（K.pneumoniae）可將此粗甘油作為碳源和能源物質(zhì)來生產(chǎn)高附加值的1，3－PD，既解決了粗甘油的處理問題又降低了不可再生資源的消耗，減少了環(huán)境污染。因此，微生物法生產(chǎn)1，3－PD越來越受到人們的重視［9］。

作者在此利用K.pneumoniae不同發(fā)酵階段下實驗測得的胞外代謝產(chǎn)物積累速率，以基元模式為約束條件，應(yīng)用線性規(guī)劃對其微氧和厭氧發(fā)酵進行優(yōu)化分析，擬為菌株改造和1，3－PD生產(chǎn)提供理論指導(dǎo)。

1 克雷伯氏桿菌代謝網(wǎng)絡(luò)模型與算法

1.1 代謝網(wǎng)絡(luò)模型

根據(jù)文獻［10］和相關(guān)的生物化學(xué)知識構(gòu)建K.pneumoniae代謝甘油的代謝網(wǎng)絡(luò)，如圖1所示。

為減少不必要的基元模式，便于分析，該代謝網(wǎng)絡(luò)未考慮胞外代謝物琥珀酸和乙醛酸循環(huán)。微氧代謝網(wǎng)絡(luò)包括38個胞內(nèi)代謝物、17個胞外代謝物、52個不同的反應(yīng)，該網(wǎng)絡(luò)主要存在于糖酵解途徑（EM）、戊糖磷酸途徑（PP）、完整的三羧酸（TCA）循環(huán)、氧化磷酸化途徑和1，3－PD合成等代謝途徑中。厭氧代謝網(wǎng)絡(luò)包括33個胞內(nèi)代謝物、16個胞外代謝物、41個不同的反應(yīng)。在厭氧條件下TCA循環(huán)是不完整的［10］（包括生成酮戊二酸的氧化途徑）且不包括氧化磷酸化途徑。

圖1 克雷伯氏桿菌的代謝網(wǎng)絡(luò)模型Fig.1 Metabolic network mode for K.pneumoniae

1.2 算法

采用Metatool 5.1軟件對K.pneumoniae代謝網(wǎng)絡(luò)進行基元模式分析，采用Matlab軟件，利用線性規(guī)劃求解不同發(fā)酵階段各基元模式通量分布，具體算法步驟如下：

目標(biāo)函數(shù)為：

約束條件為：

式中：Z為基元模式通量rj的線性組合；i為測量的代謝產(chǎn)物；j為基元模式；cj為生物量在第j個基元模式的化學(xué)計量系數(shù)；rj為第j個基元模式的通量；Sij為第i個代謝產(chǎn)物在第j個基元模式中的化學(xué)計量系數(shù)；vi為第i個可測代謝產(chǎn)物積累速率。

1.3 實驗數(shù)據(jù)

K.pneumoniae代謝甘油產(chǎn)1，3－PD的實驗數(shù)據(jù)、發(fā)酵培養(yǎng)基組成、發(fā)酵條件參見文獻［11］。甘油、1，3－PD和乙醇的不同發(fā)酵階段的積累速率由相鄰2h測得的積累量差計算得到，如表1所示。

表1 各種代謝產(chǎn)物在不同時間點的積累速率／（mmol·L－1·h－1）Tab.1 Accumulation rates of various metabolites at different time points／（mmol·L－1·h－1）

由表1可看出，延遲期［11］（0～2h），細胞物質(zhì)開始增加，菌株幾乎不增加；對數(shù)期（2～6h），菌株生長提供了足夠的物質(zhì)基礎(chǔ)，代謝旺盛，1，3－PD有較高的積累速率；穩(wěn)定期（6～8h），營養(yǎng)物質(zhì)不斷消耗，菌株數(shù)目保持相對穩(wěn)定，1，3－PD積累達到最高峰。

2 結(jié)果與討論

利用基元模式對K.pneumoniae代謝網(wǎng)絡(luò)進行代謝途徑分析，在微氧條件下計算可得771個基元模式，在厭氧條件下計算可得97個基元模式。

以生物量最大化為目標(biāo)函數(shù)，甘油消耗速率標(biāo)準(zhǔn)化為1mol·L－1·h－1，在微氧和厭氧條件下以甘油、1，3－PD、乙醇為決定變量，應(yīng)用線性規(guī)劃計算K.pneumoniae在微氧和厭氧條件下不同發(fā)酵階段各基元模式合成生物量和1，3－PD的通量值見圖2。在微氧條件下因從第182個基元模式后生物量和1，3－PD合成的通量值幾乎為零，故在圖2a～f中省略。

2.1 不同發(fā)酵階段最優(yōu)模式分析

2.1.1 微氧條件下最優(yōu)模式分析

本實驗的最優(yōu)模式為各發(fā)酵階段生物量合成的積累速率最大的基元模式。由圖2a～c可見，在微氧條件下，不同發(fā)酵階段的最優(yōu)模式是相同的，即模式124、146、178、182。這4個最優(yōu)模式途徑都包含EM途徑、PP途徑、TCA循環(huán)、轉(zhuǎn)氫酶途徑、氧化磷酸化途徑和1，3－PD合成途徑。它們的主要區(qū)別在于：（1）甘油（GLY）轉(zhuǎn)化為磷酸二羥基丙酮（DHAP）的途徑不同。在模式124、178中，GLY經(jīng)甘油脫氫酶（GDH）、二羥丙酮激酶（DHAK）催化生成DHAP；模式146、182啟動了GLP系統(tǒng)，即GLY經(jīng)甘油激酶（glpK）、3－磷酸甘油醛脫氫酶（glpAD）催化生成DHAP；（2）磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）生成丙酮酸（PYR）的途徑不同。在模式124、146中，PEP經(jīng)丙酮酸激酶（PYK）催化生成PYR；在模式178、182中，1，3－二羥基丙酮（DHA）經(jīng)DHAK催化和PEP參與反應(yīng)生成PYR。雖然具體反應(yīng)路徑有些不同，但節(jié)點后反應(yīng)通量相同，故增加了其最優(yōu)模式途徑。

圖2 不同時間點各基元模式合成生物量和1，3－PD的通量值Fig.2 The biomass and 1，3－PD fluxes of elementary modes at different time points

在不同發(fā)酵時間點（1h、4h、7h），每個最優(yōu)模式的生物量積累速率分別為2.16mg·L－1·h－1、7.30 mg·L－1·h－1、2.60mg·L－1·h－1，4個最優(yōu)模式的生物量積累速率之和分別占各發(fā)酵階段總生物量的56%、67%、29%。由圖2a～c還可以看出，除了最優(yōu)模式，各發(fā)酵階段下剩下的生物量合成幾乎平均分配在5、6、8、9、19、20、28、29、30、31、32、33、35、37、41、43次優(yōu)模式中，除了含有EM途徑、PP途徑和TCA循環(huán)外，還增加了PEP生成草酸乙酸（Oxa）的回補路徑。次優(yōu)模式在不同發(fā)酵階段的生物量積累速率分別為0.38mg·L－1·h－1、0.912mg·L－1·h－1、1.617 mg·L－1·h－1，其生物量積累速率之和分別占各發(fā)酵階段總生物量的42.4%、43.8%、43.9%。由此可以看出，微氧條件下，延遲期和對數(shù)期對生物量合成有利的途徑主要集中在最優(yōu)模式。而在穩(wěn)定期，次優(yōu)模式對生物量合成的影響逐漸增大。另外，對于生物量的合成，延遲期啟動的基元模式較多，但貢獻量主要集中在最優(yōu)和次優(yōu)模式中，其余模式貢獻量相對較少，對數(shù)期和穩(wěn)定期啟動的基元模式相對較少，但在對數(shù)期最優(yōu)模式對生物量的貢獻尤為突出。

由圖2d～f可以看出，在不同發(fā)酵時間點（1h、4h、7h），每個最優(yōu)模式的1，3－PD積累速率分別為2.0mmol·L－1·h－1、6.8mmol·L－1·h－1、2.4mmol·L－1·h－1。在對數(shù)期和穩(wěn)定期，1，3－PD合成幾乎都由最優(yōu)模式提供。在延遲期，基元模式啟動較多，此發(fā)酵階段71%的1，3－PD合成量由最優(yōu)模式提供，剩下的1，3－PD合成量幾乎平均分配在模式118、139、168、170中，與最優(yōu)模式相比，未啟動氧化磷酸化途徑，增加了乙酰輔酶A（AcCoA）消耗NADH2生成副產(chǎn)物乙酸的反應(yīng)，其1，3－PD積累速率均為0.464 mmol·L－1·h－1，貢獻了此發(fā)酵階段1，3－PD總合成量的27%?？傊?，在微氧條件下，對數(shù)期的最優(yōu)模式對生物量和1，3－PD合成貢獻較大。

2.1.2 厭氧條件下最優(yōu)模式分析

由圖2g～i可見，在厭氧條件下，第1h、7h，模式29、35為最優(yōu)模式；第4h，模式31、37為最優(yōu)模式。與微氧相比，該4個基元模式主要途徑不包含氧化磷酸化途徑和GLP系統(tǒng)。它們的主要區(qū)別在于：（1）PEP轉(zhuǎn)化為PYR的途徑不同。在模式29、35中，PEP經(jīng)PYK催化生成PYR；在模式31、37中，DHA經(jīng)DHAK催化和PEP參與反應(yīng)生成PYR；（2）AcCoA生成的副產(chǎn)物不同。在模式29、35中，AcCoA消耗NADH2生成副產(chǎn)物乙醇（Eth）；在模式31、37中，Ac－CoA消耗ATP生成副產(chǎn)物乙酸（AC）。

在第1h、7h，最優(yōu)模式29、35的生物量積累速率分別為0.252mg·L－1·h－1、2.60mg·L－1·h－1，其積累速率之和分別占各發(fā)酵階段總生物量的61%、59%；在第4h，最優(yōu)模式31、37生物量積累速率為3.9mg·L－1·h－1，占該發(fā)酵階段總生物量的80.2%。由圖2g～i還可以看出，除了最優(yōu)模式，模式22、26在延遲期和穩(wěn)定期中也在運行，除了含有EM途徑、PP途徑和TCA循環(huán)外，在PYR節(jié)點處經(jīng)乳酸脫氫酶（Ldha）催化消耗NADH2生成了副產(chǎn)物乳酸，其生物量積累速率分別為0.0402mg·L－1·h－1、1.8 mg·L－1·h－1，其積累速率之和分別占各發(fā)酵階段總生物量的9.7%、41%。此外，模式31、37在對數(shù)期為最優(yōu)模式，但在延遲期對生物量的貢獻也較顯著，其生物量積累速率為0.121mg·L－1·h－1，其積累速率之和占該發(fā)酵階段總生物量的29.3%。由此可以看出，厭氧條件下，延遲期和穩(wěn)定期基元模式啟動較少，對生物量貢獻較為集中；而在對數(shù)期基元模式啟動較多，最優(yōu)模式31、37對生物量貢獻尤為突出。

由圖2j～l可以看出，在第1h、7h，最優(yōu)模式29、35的1，3－PD積累速率分別為0.322mmol·L－1·h－1、3.8mmol·L－1·h－1，其積累速率之和分別占各發(fā)酵階段總合成量的44.3%、42.5%；在第4h，最優(yōu)模式31、37的1，3－PD積累速率為9.7mmol·L－1·h－1，占該發(fā)酵階段總生物量的40.4%。由圖2j～l可以看出，模式22、26在延遲期和穩(wěn)定期的1，3－PD積累速率分別為0.101mmol·L－1·h－1、4.57mmol·L－1·h－1，貢獻了各發(fā)酵階段1，3－PD總合成量的13.9%、57.3%。模式31、37在延遲期的1，3－PD積累速率為0.304mmol·L－1·h－1，貢獻了此發(fā)酵階段總1，3－PD合成量的41.8%。而對數(shù)期基元模式啟動較多，除了最優(yōu)模式外，其余模式貢獻了此發(fā)酵階段1，3－PD合成量的59.6%。總之，在厭氧條件下，對數(shù)期的最優(yōu)模式對生物量和1，3－PD合成貢獻較大。

綜上所述，無論微氧和厭氧條件，生物量和1，3－PD合成都主要集中在對數(shù)期，尤其在微氧條件下，其合成量在對數(shù)期明顯高于延遲期和穩(wěn)定期。

2.2 不同發(fā)酵階段NADH2、ATP代謝分析

K.pneumoniae代謝網(wǎng)絡(luò)中，EM途徑和轉(zhuǎn)氫酶途徑提供還原當(dāng)量NADH2，1，3－PD合成時消耗NADH2。其中，DHA在DHAK催化下生成DHAP時消耗ATP，PEP在PYK催化下生成PYR時提供ATP。在微氧條件下，K.pneumoniae代謝網(wǎng)絡(luò)啟動了GLP調(diào)控系統(tǒng)和氧化磷酸化途徑。其中，GLP調(diào)控系統(tǒng)提供ATP和消耗NADH2，在氧化磷酸化途徑中氧氣作為電子受體，NADH2可經(jīng)過呼吸鏈將電子傳遞給氧氣，同時偶聯(lián)著NAD＋和ATP的形成。此外，PYR在丙酮酸脫氫酶（Pdh）催化下生成AcCoA時提供NADH2。而在厭氧條件下，通過生成乙酸等副產(chǎn)物消耗NADH2、合成目的產(chǎn)物1，3－PD來調(diào)節(jié)NAD＋／NADH2的平衡。

表2 在微氧和厭氧條件下不同時間點最優(yōu)基元模式的NADH2、ATP百分比／%Tab.2 The percentage of NADH2，ATP from the optimal elementary modes at different time points under micro－aerobic and anaerobic conditions／%

由表2可見，無論微氧和厭氧條件，各發(fā)酵階段最優(yōu)模式對NADH2、ATP的貢獻均較大。其中微氧條件下的對數(shù)期尤為突出。微氧條件下，最優(yōu)模式在對數(shù)期貢獻了此發(fā)酵階段的89.0%的NADH2和78.5%的ATP；厭氧條件下，對數(shù)期基元模式啟動較多，最優(yōu)模式31、37集中貢獻了59.9%的NADH2和50.5%的ATP。在厭氧條件下，1，3－PD合成是為細胞生長維持NAD＋／NADH2平衡不可或缺的途徑［9］，存在轉(zhuǎn)氫酶途徑，無氧化磷酸化途徑。模式29、35經(jīng)生成乙醇消耗NADH2，模式31、37經(jīng)生成乙酸提供ATP。在微氧條件下，最優(yōu)模式除滿足目的產(chǎn)物1，3－PD合成對NADH2的需要外，還可通過氧化磷酸化途徑和轉(zhuǎn)氫酶途徑調(diào)節(jié)NADH2，同時產(chǎn)生足夠的ATP。因此，和厭氧相比，K.pneumoniae代謝在微氧條件下啟動了氧化磷酸化途徑，無副產(chǎn)物產(chǎn)生，更利于生物量和1，3－PD的合成。

綜上所述，如果想要最大化地繁殖菌株，以利于目的產(chǎn)物1，3－PD的合成，除優(yōu)化發(fā)酵過程外，應(yīng)改進現(xiàn)有的生物反應(yīng)技術(shù)，應(yīng)用基因敲除或過表達操作手段切斷競爭路徑、增強生物量和1，3－PD合成路徑通量，控制代謝路徑使之向最優(yōu)基元模式方向進行，減少不必要的路徑造成的還原力、能量和碳源的消耗，通過調(diào)節(jié)代謝網(wǎng)絡(luò)中酶活性或構(gòu)建NADH2再生系統(tǒng)等手段維持NAD＋／NADH2和ATP／ADP平衡，實現(xiàn)生物量和1，3－PD合成最大化。

3 結(jié)論

從基元通量模式（elementary flux mode，EFM）角度分析，以生物量最大化為目標(biāo)函數(shù)，應(yīng)用線性規(guī)劃量化K.pneumoniae代謝網(wǎng)絡(luò)，發(fā)現(xiàn)：在微氧條件下，不同發(fā)酵階段生物量合成的最優(yōu)模式是相同的，即模式124、146、178、182；在厭氧條件下，延遲期和穩(wěn)定期的最優(yōu)模式為模式29、35，對數(shù)期為模式31、37。同時，各最優(yōu)模式對1，3－PD合成貢獻也較大；代謝過程中，氧化磷酸化途徑對維持NAD＋／NADH2和ATP／ADP平衡起著重要作用。表明，可以用基元模式分析結(jié)合線性規(guī)劃來量化K.pneumoniae生產(chǎn)1，3－PD的代謝網(wǎng)絡(luò)。

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