孟利強(qiáng)，李晶，趙曉宇，張淑梅，曹旭，陳靜宇，沙長(zhǎng)青

（1.黑龍江省科學(xué)院微生物研究所，哈爾濱 150010；2.黑龍江省科學(xué)院高技術(shù)研究院，哈爾濱 150020；3.黑龍江省科學(xué)院，哈爾濱 150080）

生防細(xì)菌TF28抗菌蛋白的分離純化及理化特性

孟利強(qiáng)1,2，李晶1,2，趙曉宇1,2，張淑梅1,2，曹旭1,2，陳靜宇1，沙長(zhǎng)青2,3*

（1.黑龍江省科學(xué)院微生物研究所，哈爾濱 150010；2.黑龍江省科學(xué)院高技術(shù)研究院，哈爾濱 150020；3.黑龍江省科學(xué)院，哈爾濱 150080）

為得到生防細(xì)菌TF28產(chǎn)生的抗菌蛋白，明確其蛋白理化特性。采用硫酸銨分級(jí)鹽析法得到抗菌蛋白粗提物，采用Q Sepharose Fast Flow陰離子交換層析及Superdex 75分子篩凝膠層析方法進(jìn)行分離純化。獲得單一抗菌活性蛋白P28，純度達(dá)到94.48%，經(jīng)檢測(cè)該抗菌蛋白分子質(zhì)量為36.8 ku。該抗菌蛋白具有一定的熱穩(wěn)定性和酸堿穩(wěn)定性；經(jīng)蛋白酶K在37℃處理30 min活性降低為原有活性的75.1%，對(duì)紫外線、胰蛋白酶不敏感。結(jié)果表明，經(jīng)過分離純化得到一種抗菌活性蛋白P28，該抗菌蛋白具有一定的熱穩(wěn)定性和酸堿穩(wěn)定性，對(duì)蛋白酶K具有一定的耐受性，對(duì)紫外線、胰蛋白酶不敏感。

生防；抗菌蛋白；拮抗作用；分離純化；理化特性

從生防細(xì)菌發(fā)酵液中提取分離抗菌物質(zhì)并將其應(yīng)用于植物病害防治是目前生物防治的重要途徑[1-3]。生防細(xì)菌TF28是從大豆根部分離出的一株拮抗內(nèi)生細(xì)菌，前期研究發(fā)現(xiàn)該菌產(chǎn)生的抗菌蛋白具有廣譜高效抑菌活性[4]。經(jīng)鑒定，該菌屬于解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens），是一類可產(chǎn)生豐富胞外拮抗物質(zhì)的革蘭氏陽性細(xì)菌，從中分離出具有較好生防應(yīng)用價(jià)值的拮抗物質(zhì)，并對(duì)其進(jìn)行開發(fā)利用逐漸成為應(yīng)用研究的熱點(diǎn)[5-7]。

本研究主要對(duì)TF28菌株所產(chǎn)生的抗菌蛋白進(jìn)行分離、純化和分析，并對(duì)其理化性質(zhì)進(jìn)行研究，為進(jìn)一步研究該蛋白的分子遺傳基礎(chǔ)、和研制該菌株抗菌蛋白生物農(nóng)藥提供理論基礎(chǔ)[8-9]。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

拮抗菌株解淀粉芽孢桿菌TF28及立枯絲核菌（Rhizoctonia solani f.sp.vedolens）為黑龍江省科學(xué)院微生物研究所分離保存。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 硫酸銨分級(jí)鹽析條件確定

分級(jí)沉淀方法參照文獻(xiàn)[4]，設(shè)置分級(jí)濃度為20%、40%、60%、80%、100%，確定抗菌蛋白的硫酸銨鹽析的最適飽和度。

1.2.2 Q Sepharose Fast Flow陰離子交換層析

抗菌粗蛋白經(jīng)過離子交換層析進(jìn)一步分離，本研究使用?KTApurifier蛋白分離純化系統(tǒng)的陰離子交換柱Q Sepharose Fast Flow，上樣體積為100 μL，室溫下流速為0.5 mL·min-1，收集流出峰；然后采用階梯梯度洗脫，洗脫緩沖液為2 mol·L-1的NaCl（pH 7.6），洗脫濃度分別為10%、20%、30%、40%、50%，收集各洗脫峰；濃縮各洗脫峰樣品，采用杯碟法[10]檢測(cè)其抑菌活性，并用SDS-PAGE電泳檢測(cè)樣品蛋白組成。

1.2.3 Superdex 75分子篩凝膠層析

收集活性峰進(jìn)行分子篩凝膠層析，使用?KTApurifier蛋白分離純化系統(tǒng)，室溫，流速0.4 mL·min-1，待基線走平后，手動(dòng)上樣，上樣體積100 μL，收集各個(gè)吸收峰；樣品濃縮、檢測(cè)及活性峰SDS-PAGE電泳檢測(cè)（同1.2.2）。

1.2.4 抗菌蛋白純度檢驗(yàn)

采用高壓液相色譜（HPLC）反相C18柱，對(duì)分子篩層析分離得到的活性峰組分進(jìn)行純度檢驗(yàn)，固定相為Symmetry C18，（4.6×250 mm，5 μL），流動(dòng)相為0.1%三氟乙酸（TFA）水溶液（A相）和0.1%三氟乙酸（TFA）乙睛溶液（B相）；洗脫速度0.8 mL· min-1，檢測(cè)波長(zhǎng)280 nm，溫度25℃；使用A、B混合液為流動(dòng)相，其中B液含量從5%～95%逐漸升高，洗脫時(shí)間為50 min。

1.2.5 抗菌蛋白P28的理化特性

熱穩(wěn)定性：將抗菌蛋白分別置于50、70、90和100℃水浴30 min，然后分別采用杯碟法測(cè)定其活性。

pH穩(wěn)定性：將抗菌蛋白pH分別調(diào)至2.0、4.0、6.0、8.0、70.0、12.0，置4℃過夜，再將各自pH值調(diào)回中性后測(cè)定其抑菌活性。

紫外線、蛋白酶穩(wěn)定性測(cè)定方法參照文獻(xiàn)[4]，其中蛋白酶選用胰蛋白酶、蛋白酶。

2 結(jié)果與分析

2.1 硫酸銨分級(jí)鹽析條件確定

鹽析粗蛋白經(jīng)透析、濃縮后測(cè)定抗菌活性，結(jié)果如圖1所示，當(dāng)硫酸銨鹽析飽和度為20%、60%、80%、100%時(shí)，粗提物抑菌活性較弱，當(dāng)硫酸銨鹽析飽和度為40%時(shí)，粗提物抑菌活性最強(qiáng)，由此確定20%～40%硫酸銨飽和度為沉淀抗菌蛋白的最佳硫酸銨飽和度。

圖1 最佳硫酸銨鹽析飽和度的確定Fig.1 Determination of optimum ammonium sulfate saturation

2.2 Q Sepharose Fast Flow陰離子交換層析

將Q Sepharose Fast Flow陰離子交換柱平衡后，手動(dòng)上樣100 μL，先收集洗脫峰，之后待基線走平后，開始洗脫，采用階梯梯度洗脫，洗脫緩沖液（pH 7.6）鹽濃度由低到高，分別為10%、20%、30%、40%、50%、100%，收集各洗脫峰，結(jié)果如圖2。濃縮各峰并測(cè)定其活性，流出峰沒有抑菌活性，洗脫峰活性如圖3，10%的洗脫峰活性很弱，20%、30%、40%的洗脫峰活性相對(duì)較強(qiáng)，而50%的洗脫峰活性相對(duì)較弱。據(jù)此洗脫條件可以優(yōu)化為：先用10%梯度的洗脫液洗脫出現(xiàn)Ⅰ峰，然后用40%梯度洗脫液洗脫出現(xiàn)Ⅱ峰，最后用50%梯度洗脫出Ⅲ峰，結(jié)果如圖4。

分別收集Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ峰，濃縮并做活性檢測(cè)，結(jié)果如圖5，Ⅰ峰和Ⅲ峰活性很弱，Ⅱ峰活性很強(qiáng)。

2.3 陰離子交換層析活性峰SDS-PAGE電泳檢測(cè)

采用SDS-PAGE電泳檢測(cè)上述活性峰Ⅱ，結(jié)果如圖6，Ⅱ峰相對(duì)于粗提物的帶型有所減少，共有5～6條可見帶，分別分布在各個(gè)區(qū)域，分子質(zhì)量各異，該步驟達(dá)到初步分離效果。

圖2 Q Sepharose Fast Flow階梯梯度洗脫峰Fig.2 Gradient elution peak of Q Sepharose Fast Flow

圖3 階梯梯度洗脫各峰抗菌活性Fig.3 Antibacterial activity of gradient elution peaks

圖4 Q Sepharose fast flow三步梯度洗脫曲線Fig.4 Three-step gradient elution curves of Q Sepharose Fast Flow

圖5 洗脫峰抗菌活性比較Fig.5 Comparison of the antibacterial activity

圖6 離子交換活性峰SDS-PAGE電泳檢測(cè)Fig.6 Testing elution curves by SDS-PAGE electrophoresis

2.4 Superdex 75分子篩凝膠層析

收集陰離子交換層析后的Ⅱ峰，濃縮至合適濃度后，用Superdex 75分子篩凝膠層析，進(jìn)一步分離純化，上樣緩沖液為0.05 mol·L-1的磷酸緩沖液，0.15 mol·L-1NaCl，pH7.0，層析結(jié)果見圖7。

圖7 Superdex 75凝膠層析分離曲線Fig.7 Separation curve gel chromatography Superdex 75

由層析圖譜可知，有3個(gè)主要吸收峰，A、B、C，將3個(gè)峰收集濃縮，測(cè)定活性，結(jié)果如圖8，A峰活性最強(qiáng)，B峰和C峰活性很弱。

2.5 Superdex 75分子篩凝膠層析活性峰SDSPAGE電泳檢測(cè)

取A峰抗菌蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢測(cè)，結(jié)果如圖9，樣品為單一條帶，說明該抗菌蛋白經(jīng)過分子篩分離純化后純度達(dá)到電泳級(jí)水平，分子質(zhì)量為36.8 ku，命名為P28。

圖8 凝膠層析各峰活性比較Fig.8 Comparison of the antibacterial activity

圖9 凝膠層p析ea單k峰電泳檢測(cè)Fig.9 Testing single curve by SDS-PAGE electrophoresis

圖10 抗菌蛋白純度高效液相色譜檢測(cè)Fig.10 Testing the purity quotient of antibacterial protein by HPLC

2.6 抗菌蛋白純度檢驗(yàn)

采用高效液相色譜技術(shù)檢測(cè)抗菌蛋白的純度，固定相Symmetry C18柱子，待走平基線后，按試驗(yàn)方法自動(dòng)上樣，開始洗脫，結(jié)果見圖10和表1。

表1 高效液相色譜純度檢測(cè)數(shù)據(jù)Table 1 Testing data of purity quotient by HPLC

由圖10和表1可知，在保留時(shí)間2.428 min時(shí)出現(xiàn)目的蛋白P28，純度到達(dá)94.48%，樣品中僅有少量雜質(zhì)存在。

2.7 抗菌蛋白P28的理化特性

抗菌蛋白分別于不同溫度下處理30 min，活性變化如表2。

經(jīng)70、90和100℃處理30 min活性下降較為明顯，抑菌率分別為原有的84.2%、72.2%和64.7%，而50℃處理30 min該蛋白活性僅降低3.8%。由此可見，該抗菌蛋白對(duì)溫度不敏感。

將抗菌蛋白分別調(diào)至不同的pH，活性變化如表3所示，抗菌蛋白活性在pH 4～10范圍時(shí)，活性變化較小，活性在pH 2和pH 12時(shí)分別降低15.4%和16.9%，可見該抗菌蛋白對(duì)pH不敏感。

紫外線的穩(wěn)定性：紫外線照射對(duì)該抗菌蛋白活性無明顯影響。

蛋白酶的穩(wěn)定性：胰蛋白酶對(duì)該抗菌蛋白活性無影響，蛋白酶K使該蛋白活性降低24.9%。

表2 抗菌蛋白的熱穩(wěn)定性Table 2 Thermal stability of antibacterial protein

表3 抗菌蛋白的pH穩(wěn)定性Table 3 pH stability of antibacterial protein

3 討論與結(jié)論

利用拮抗菌防治植物病害備受關(guān)注，拮抗菌產(chǎn)生的抗菌物質(zhì)在防治植物病害中具有重要作用，了解拮抗菌及其抗菌物質(zhì)的特性是生物防治得以實(shí)現(xiàn)的前提條件[11-12]。張雙鳳等從拮抗菌LC-105的發(fā)酵液中分離純化出一種對(duì)棉花黃萎病大麗輪枝菌具有抑制作用的抗菌蛋白質(zhì)[13]。齊愛勇等B21菌株產(chǎn)生的抗菌蛋白經(jīng)過層析純化，得到一種單一蛋白，分子質(zhì)量為43 ku[14]。

解淀粉芽孢桿菌TF28是從大豆根部分離出的一株內(nèi)生細(xì)菌，具有良好的試驗(yàn)室生測(cè)活性，能對(duì)多種植物病原菌的生長(zhǎng)起到抑制作用，是一株具有良好開發(fā)前景的生防細(xì)菌[4,15]。為進(jìn)一步明確解淀粉芽孢桿菌TF28的生防機(jī)制，本文通過硫酸銨分級(jí)沉淀方法得到TF28菌株的抗菌粗蛋白，再通過陰離子交換層析和分子篩凝膠層析分離純化得到一種活性蛋白P28，SDS-PAGE電泳檢測(cè)該蛋白顯示為單一條帶，分子質(zhì)量為36.8 ku，同時(shí)采用高壓液相色譜檢測(cè)其純度為94.48%。此抗菌蛋白不同于已報(bào)道的任何一種抗菌蛋白，是否是一種新的抗菌蛋白，尚待于深入研究確認(rèn)。本研究選用立枯絲核菌作為抗菌蛋白的活性檢測(cè)的指示菌，而對(duì)其他植物病原菌尚未涉及。對(duì)該抗菌蛋白的抑菌譜、抑菌機(jī)理以及該蛋白的結(jié)構(gòu)種類進(jìn)行研究，可為該抗菌蛋白的分離純化試驗(yàn)奠定基礎(chǔ)。

研究抗菌蛋白P28的理化特性發(fā)現(xiàn)，該抗菌蛋白的熱穩(wěn)定性表現(xiàn)為：70、90和100℃處理30 min抗菌活性均有所下降，但均能保持在60%以上，而50℃處理30 min該蛋白活性僅降低3.8%；對(duì)pH不敏感，活性僅在pH 2和pH 12時(shí)降低15.4%和16.9%；對(duì)紫外線和胰蛋白酶不敏感，經(jīng)蛋白酶K 37℃下處理30 min，其抑菌活性降低，但仍能保持原有活性的75.1%?？咕鞍譖28顯示其具有較穩(wěn)定的理化特性，可為進(jìn)一步開發(fā)成為生物農(nóng)藥提供有力保障，也展示了其良好的應(yīng)用潛質(zhì)。

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Isolation,purification and characterization of antifungal protein from Antagonistic bacterium TF28 strain

Meng Liqiang1,2,Li Jing1,2,Zhao Xiaoyu1,2,Zhang Shumei1,2,Cao Xu1,2,Chen Jingyu1,Sha Changqing2,3(1.Institute of Microbiology of Heilongjiang Academy of Sciences,Harbin 150010,China;2.Institute of Advanced Technology of Heilongjiang Academy of Sciences,Harbin 150020,China;3.HeilongjiangAcademy of Sciences,Harbin 150080,China)

This paper aimd to get antifungal proteins isolated from strain TF28 and studies the physicochemical characteristics of the antifungal proteins.Isolation and purification were completed by ammonium sulfate precipitation and chromatography.A single antifungal protein named P28 was obtained with purity 94.48%and molecular weight 36.8 ku.In addition,the antibacterial protein has certain thermal and acid-base stability.The original antibacterial could be lowered by 24.9%after it was treated by proteinase K for 30 min at 37℃and it was not sensitive to UV and trypsin.The antibacterial protein P28 was isolated and purified that had certain thermal and acid-base stability,and was tolerant to protease K to some extent,and not sensitive to ultraviolet and trypsin.

probiotics;classify;mechanism of action;application

Q819

A

1005-9369（2014）02-0083-06

2012-10-24

黑龍江省科學(xué)院青年創(chuàng)新基金項(xiàng)目（2011HK009）

孟利強(qiáng)（1983-），男，助理研究員，碩士，研究方向?yàn)檗r(nóng)業(yè)微生物、抗菌物質(zhì)提取，E-mail：mengliqiang 83420@163.com

*通訊作者：沙長(zhǎng)青，研究員，碩士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)樯锛夹g(shù)及微生物學(xué)，E-mail:shachangqing@vip.163.com

時(shí)間2014-1-17 16:37:49[URL]http://www.cnki.net/kcms/detail/23.1391.S.20140117.1637.007.html

孟利強(qiáng),李晶,趙曉宇,等.生防細(xì)菌TF28抗菌蛋白的分離純化及理化特性[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2014,45(2):83-88.

Meng Liqiang,Li Jing,Zhao Xiaoyu,et al.Isolation,purification and characterization of antifungal protein from Antagonistic bacterium TF28 strain[J].Journal of Northeast Agricultural University,2014,45(2):83-88.(in Chinese with English abstract)