劉群錄，張寶智，張彥婷，王婷婷

（1.上海交通大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物學(xué)院，上海 200240；2.上海交通大學(xué)農(nóng)業(yè)部都市農(nóng)業(yè)（南方）重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200240；3.上海城市植物資源開發(fā)與應(yīng)用工程技術(shù)研究中心，上海 200231；4.上海交通大學(xué)陸伯勛食品安全研究中心，上海 200240；5.東北林業(yè)大學(xué)園林學(xué)院，哈爾濱 150040）

響應(yīng)面法優(yōu)化木槿花色苷超聲輔助提取工藝研究

劉群錄1,2,3,4，張寶智1,2，張彥婷1,2，王婷婷5

（1.上海交通大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物學(xué)院，上海 200240；2.上海交通大學(xué)農(nóng)業(yè)部都市農(nóng)業(yè)（南方）重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200240；3.上海城市植物資源開發(fā)與應(yīng)用工程技術(shù)研究中心，上海 200231；4.上海交通大學(xué)陸伯勛食品安全研究中心，上海 200240；5.東北林業(yè)大學(xué)園林學(xué)院，哈爾濱 150040）

以單花盛花期木槿花瓣為試材，運(yùn)用Box-Behnken中心組合試驗(yàn)和響應(yīng)面法考查液料比、超聲提取時(shí)間、溫度3個(gè)因素對花色苷提取率的影響，并優(yōu)化提取工藝。結(jié)果表明，木槿花瓣中花色苷的最優(yōu)條件為：提取劑0.1%鹽酸甲醇，超聲（功率300W）提取時(shí)間3 min、超聲溫度56℃、液料比41∶1（mL∶g）。在此條件下，花色苷的得率預(yù)測值為（38.19±3.45）mg·100 g-1，驗(yàn)證值為（37.79±4.17）mg·100 g-1，與預(yù)測值的相對誤差為1.04%，說明響應(yīng)面法優(yōu)化木槿花瓣中提取花色苷的工藝可行。

木槿；超聲輔助提??；花色苷；響應(yīng)面法；Box-Behnken設(shè)計(jì)

木槿（Hibiscus syriacusL.）別名木錦、面花、籬障花、朱槿、赤槿、朝開暮落花，為錦葵科木槿屬落葉灌木或小喬木，據(jù)記載已有近3000年的栽培歷史[1]。已有研究表明木槿花瓣中含多種生物活性物質(zhì)如花色苷[2-6]等，具有抗氧化[7]、清除自由基[8]、抗突變活性[9]、減輕肝功能障礙[10]以及抗腫瘤[11]功能，而且木槿易繁殖、生長快，是有較大開發(fā)前景的天然植物色素資源。

超聲輔助提取技術(shù)因其提取效率高、成本低廉，在食品和植物化學(xué)領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。響應(yīng)面法（Response Surface Methodology）是利用合理的試驗(yàn)設(shè)計(jì)，采用多元二次回歸方程擬合因素與響應(yīng)值間的函數(shù)關(guān)系，通過對回歸方程的分析尋求最優(yōu)工藝參數(shù)，解決多變量問題的一種統(tǒng)計(jì)方法[12]。Box-Behnken設(shè)計(jì)因其因素水平少、試驗(yàn)次數(shù)少等優(yōu)點(diǎn)，近年來在試驗(yàn)設(shè)計(jì)中應(yīng)用較多[13-15]。張婕等利用正交試驗(yàn)優(yōu)化利用乙醇提取木槿花中原花青素的技術(shù)參數(shù)，但其優(yōu)化的提取時(shí)間長達(dá)30 min，耗時(shí)過長[16]。

本文研究影響木槿花色苷超聲提取效果的各因素，并通過響應(yīng)面分析法確定最佳提取工藝條件，以期為木槿花色素資源的開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

研究試材為粉花垂枝木槿，取自上海交通大學(xué)大學(xué)植物標(biāo)本園（31°2'N,121°4'E）。9月份于上午7:00篩選長勢良好且一致的待放木槿花蕾掛牌作標(biāo)記，采摘整個(gè)單花花期（一個(gè)白晝）中處于盛花期的花瓣，用不銹鋼鑷子摘除雄蕊后，放入牛皮紙信封，采后立即帶回試驗(yàn)室。稱取花冠著色部分樣品，經(jīng)液氮速凍后保存于4℃冰箱備用。

1.2 儀器與試劑

GeneQuant pro紫外/可見光分光光度計(jì)（美國Bio?chrom有限公司）；PHB-4型便攜式pH計(jì)（上海精密科學(xué)儀器有限公司）；超聲波提取儀（JY92-ⅡD寧波新芝）；水浴鍋DK-S22型（上海精宏試驗(yàn)設(shè)備有限公司）；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.3.1 測定指標(biāo)與方法

稱取一定質(zhì)量的樣品，用研缽在液氮中研磨成粉末，按一定比例加入提取液，進(jìn)行超聲處理。在3 000 r·min-1離心5 min后待測。木槿花花色苷含量的測定采用pH示差法[17]，吸取花色苷提取液1 mL，分別用pH 1.0和pH 4.5緩沖液稀釋定容至3 mL。室溫下放置15 min，以蒸餾水作參比，在最大吸收波長520和700 nm處測定二者的吸光值，計(jì)算花色苷含量。以矢車菊素-3-葡萄糖苷作為花色苷標(biāo)準(zhǔn)，總花色苷含量以矢車菊素-3-葡萄糖苷含量表示，用以下公式計(jì)算木槿花瓣花色苷超聲輔助提取率。

式中：R：即花色苷提取率。A：吸光值；ε：矢車菊-3-葡萄糖苷摩爾消光系數(shù)（29 600）；MW：花色苷分子質(zhì)量（449.2）；DF：稀釋倍數(shù)；V：體積（mL）；W：樣品質(zhì)量（g）；L：光程（1 cm）。

1.3.2 單因素試驗(yàn)

以新鮮木槿花瓣為原料，在恒溫水浴條件下，進(jìn)行花色苷提取產(chǎn)量的單因素試驗(yàn)。提取劑為0.1%鹽酸甲醇；料液比是指提取液體積（mL）與剪碎木槿花瓣質(zhì)量（g）之比，試驗(yàn)所用液料比10∶1～70∶1，提取溫度30～80℃，提取時(shí)間1～7 min。

1.3.3 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，以木槿花色苷提取時(shí)間（A）、料液比（B）、提取溫度（C）3個(gè)因素，采用Box-Behnken設(shè)計(jì)3因素3水平試驗(yàn)并與花色苷提取產(chǎn)量進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)，應(yīng)用響應(yīng)面分析法，對木槿花瓣中總花色苷的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，因素水平設(shè)計(jì)見表1。

表1 Box-Behnken設(shè)計(jì)試驗(yàn)因素水平及其編碼表Table 1 Factors and levels in the Box-Behnken design

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

所有試驗(yàn)均重復(fù)3次，取平均值。通過Design Expert 8.0.5軟件對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，研究各自變量交互作用并預(yù)測木槿花瓣花色苷提取的最優(yōu)工藝參數(shù)。采用Origin 8.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)整理和作圖，用SAS 9.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，統(tǒng)計(jì)方法采用One-Way ANOVA。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素處理對木槿花色苷提取率的影響

不同處理對木槿花瓣中花色苷提取率的影響如圖1。在超聲提取溫度40℃，超聲功率300 W，液料比20∶1條件下，不同超聲時(shí)間對木槿總花色苷得率的影響見圖1-A。由圖1-A可知，提取時(shí)間在1～4 min范圍內(nèi)，花色苷提取率呈上升趨勢（P<0.05）?；ㄉ仗崛r(shí)間超過4 min時(shí)，花色苷的提取率下降（P<0.05），可能是由于環(huán)境中光、氧和微生物等作用致使其穩(wěn)定性下降所致[18]。木槿花色苷最佳提取時(shí)間設(shè)定為4 min。

在超聲提取時(shí)間4 min，超聲功率300 W，提取溫度60℃條件下，不同液料比對木槿花瓣中總花色苷得率的影響見圖1-B。由圖1-B可知，液料比10∶1～20∶1，隨料液比增加，提取率顯著提高（P<0.05），液料比為30∶1～70∶1時(shí)，提取液中花色苷含量上升幅度減小，且相鄰兩處理間差異不顯著（P>0.05）；前期溶劑量越大，溶媒傳質(zhì)過程越快，有效成分浸出越完全，提取率越大，但當(dāng)溶劑過大時(shí)，探頭式超聲能量對沉滯低層的木槿花瓣空化效應(yīng)和機(jī)械效應(yīng)等的強(qiáng)度減弱，影響超聲提取效果，故選用20∶1作為提取液料比。

在超聲提取時(shí)間4 min，超聲功率300 W，液料比20∶1條件下，不同超聲溫度對木槿花瓣總花色苷得率的影響見圖1-C。溫度為30～50℃，花色苷提取產(chǎn)量顯著升高（P<0.05）。溫度在控制50～ 60℃，提取產(chǎn)量增加不顯著（P>0.05），溫度超過60℃，花色苷提取產(chǎn)量顯著下降（P<0.05）。其原因可能是較低提取溫度使花色苷溶出速率緩慢，而較高提取溫度加速花色苷的溶出[19]。提取溫度越高，能耗越大，溫度過高會造成部分花色苷分解而降低花色苷提取產(chǎn)量，故提取溫度以60℃為宜。

圖1 不同單因素處理對木槿花色苷提取率的影響Fig.1 Effect of single factor treatment on anthocyandins extraction yield of Hibiscus syriacus L.

2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化紫葉李葉片花色苷超聲輔助提取工藝

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，取3個(gè)自變量，分別為提取時(shí)間（A）、料液比（B）、提取溫度（C），以木槿花色苷提取率為響應(yīng)值（R）進(jìn)行三因素三水平響應(yīng)面分析試驗(yàn)，試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見表2。

表2 花色苷提取Box-Behnken設(shè)計(jì)試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Box-Behnken design layout and experimental results

對回歸模型進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表3。從表3中可以看出，回歸模型達(dá)到極顯著水平（P< 0.01），誤差項(xiàng)不顯著，失擬項(xiàng)（P>0.05）不顯著以及R2Adj=0.9629和RSN（信噪比）為19.996，回歸方程具有較高的擬合度和可信度，說明回歸方程與實(shí)際情況吻合較好，可用以推測真實(shí)試驗(yàn)的提取效果。進(jìn)一步對回歸方程各項(xiàng)進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，表明自變量與響應(yīng)值線性關(guān)系顯著，可以用于預(yù)測超聲輔助提取試驗(yàn)的理論預(yù)測。

方差分析結(jié)果中，A項(xiàng)P≤0.05，說明時(shí)間對木槿花色苷提取率影響顯著；B、C項(xiàng)P≤0.01，說明液料比、溫度對木槿花色苷提取率影響極顯著；AB項(xiàng)P≤0.01，說明超聲波作用時(shí)間與液料比兩因素的交互作用影響極顯著；BC項(xiàng)P≤0.05，說明溫度與液料比兩因素的交互作用影響顯著。由于各因素對木槿花色苷提取率的影響不是簡單的線性關(guān)系，為了明確各因素對響應(yīng)值R的影響，對表2試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行回歸分析，得到如下方程：

對回歸方程中一次項(xiàng)系數(shù)的絕對值進(jìn)行比較，可判斷因子影響的主次性，結(jié)合方差分析結(jié)果，確定對花色苷提取率的影響從大到小的順序依次為提取溫度、超聲時(shí)間、料液比。

表3 響應(yīng)面二次回歸方程模型方差分析結(jié)果Table 3 Analysis of variance for the developed quadratic regression model

圖2直觀地給出各因素交互作用的響應(yīng)面3D圖和等高線圖。等高線的形狀可反映出交互效應(yīng)的強(qiáng)弱，橢圓形表示兩因素交互作用顯著，而圓形則與之相反[20]。提取溫度固定為60℃時(shí)，提取時(shí)間和料液比對木槿花色苷提取率的交互作用顯著（見圖2-Ⅰ），與表3中方差分析結(jié)果相同。由響應(yīng)曲面圖可知，適當(dāng)加大料液比能提高花色苷的提取率，縮短色素的提取時(shí)間，在一定料液比范圍內(nèi)，隨著料液比的增大，花色苷提取率增加；料液比超過一定范圍后，花色苷的提取率有下降趨勢，原因可能是料液比過大時(shí)，色素濃度下降，色素分子間作用力變小，其穩(wěn)定性下降而容易分解，導(dǎo)致色素提取率下降[21]。

超聲時(shí)間固定為4 min時(shí)，提取溫度和料液比對木槿花色苷提取率交互作用較顯著（見圖2-Ⅱ），與方差分析結(jié)果相同。提取溫度較低時(shí)，要得到較高提取率必須加大料液比，但液料比過大，提取率反而下降；而提取溫度高時(shí)較低的料液比就能達(dá)到較高的提取率。由此可見，適當(dāng)提高溫度，降低提取液用量，可提高花色苷提取率。

在液料比為30∶1時(shí)，提取時(shí)間與溫度對木槿花色苷提取率的交互作用不顯著（見圖2-Ⅲ）。在提取溫度50℃時(shí)，得到較高色素提取產(chǎn)量需要4 min；溫度提高到60℃時(shí)，提取時(shí)間也只需4 min。這表明，在本試驗(yàn)水平范圍內(nèi)，適當(dāng)增加提取溫度有利于木槿花色苷的溶出。但提取溫度過高，花色素變得不穩(wěn)定，提取產(chǎn)率反而下降。

從響應(yīng)面分析圖上可找出最佳參數(shù)及各參數(shù)間交互作用?；貧w模型存在最大值點(diǎn)，即木槿花花色苷提取率最大估計(jì)值為（38.19±3.45）mg·100 g-1，與之對應(yīng)的試驗(yàn)條件為超聲溫度56℃，液料比41∶1 mL·g-1，超聲處理時(shí)間3 min。為了檢驗(yàn)響應(yīng)面法的可行性，按照最佳的超聲輔助提取條件進(jìn)行花色苷提取的驗(yàn)證試驗(yàn)，得實(shí)際木槿花色苷提取率為（37.79±4.17）mg·100 g-1，與預(yù)測值的相對偏差為1.04%，說明采用響應(yīng)面法優(yōu)化得到的提取條件可靠。

圖2 不同自變量交互作用對木槿花色苷提取量影響的響應(yīng)面和等高線Fig.2 Response surface and contour plots for the interaction effects of three independent variables on the extraction yield of total anthocyandins from Hibiscus syriacus L.

3 結(jié)論

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，用響應(yīng)面法優(yōu)化花色苷的超聲波提取條件。結(jié)果表明，料液比和溫度對提取率的影響顯著；時(shí)間與液料比、液料比與溫度交互作用對得率影響顯著。對花色苷提取率影響從大到小順序依次為提取溫度、超聲時(shí)間、料液比。木槿花色苷超聲波輔助提取最佳條件為：提取時(shí)間3 min、超聲溫度56℃、液料比41∶1（mL·g-1），花色苷得率預(yù)測值為（38.19±3.45）mg·100 g-1，驗(yàn)證值為（37.79±4.17）mg·100 g-1，與預(yù)測值的相對誤差為1.04%。

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LIU Qunlu1,2,3,4,ZHANG Baozhi1,2,
ZHANG Yanting1,2,WANG Tingting5(1.School of Agriculture and Biology,Shanghai JiaoTong University, Shanghai 200240,China;2.Key Laboratory of Urban Agriculture(South),Ministry of Agriculture, Shanghai JiaoTong University,Shanghai 200240,China;3.Shanghai Engineering Research Center of Sustainable Plant Innovation,Shanghai 200231,China;4.Bor.S.Luh Food Safety Research Center, Shanghai JiaoTong University,Shanghai 200240,China;5.School of Landscape,Northeast Forestry University,Harbin 150040)

Based on single factor extraction tests,Box-Behnken design and response surface methodology(RSM)were employed to optimize the extraction conditions for anthocyanins from flowers of Hibiscus syriacusL.at blossom stage.Extraction time,solvent-solid ratio and ultrasound temperature were investigated.The results demonstrated that the optimum ultrasound assisted extraction conditions for anthocyanins were as follows:organic solvent 0.1%hydrochloric acid in methanol,extraction time 3 min, ultrasound temperature 56℃and liquid-solid ratio 41:1(mL·g-1).Under the optimum conditions,the theoretical extraction rate was(38.19±3.45)mg·100 g-1,while the extraction rate of anthocyanins actuallymeasured was(37.79±4.17)mg·100 g-1,with relative error of 1.04%,which revealed response surface methodology was feasible to optimize the ultrasonic assisted extraction of anthocyandins from flowers ofH. syriacusL.

Hibiscus syriacusL.;ultrasonic assisted extraction;anthocyanins;response surface methodology;Box-Behnken design

S687.3

A

1005-9369（2014）02-0054-06

2013-03-15

國家科技支撐項(xiàng)目（2008BAJ10B04-5）；上海市科學(xué)技術(shù)委員會資助項(xiàng)目（09dz1205003）

劉群錄（1970-），男，副教授，博士，研究方向?yàn)閳@林植物應(yīng)用，E-mail:liuql@sjtu.edu.cn

時(shí)間2014-1-17 16:39:41[URL]http://www.cnki.net/kcms/detail/23.1391.S.20140117.1639.011.html

劉群錄,張寶智,張彥婷,等.響應(yīng)面法優(yōu)化木槿花色苷超聲輔助提取工藝研究[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2014,45(2):54-59.

Liu Qunlu,Zhang Baozhi,Zhang Yanting,et al.Optimization of ultrasonic extraction of anthocyanins fromHibiscus syriacus L.using response surface methology[J].Journal of Northeast Agricultural University,2014,45(2):54-59.(in Chinese with English abstract)

Optimization of ultrasonic extraction of anthocyanins fromHibiscus syriacusL.using response surface methology