于澤源，滕 歆，徐雅琴，李興國

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，哈爾濱 150030；2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)理學(xué)院，哈爾濱 150030）

復(fù)合酶法提取樹莓果實(shí)多糖工藝優(yōu)化的研究

于澤源1，滕 歆1，徐雅琴2，李興國1

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，哈爾濱 150030；2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)理學(xué)院，哈爾濱 150030）

通過單一酶法（果膠酶、纖維素酶、木瓜蛋白酶）提取多糖，確定果膠酶、纖維素酶與木瓜蛋白酶進(jìn)行復(fù)合提取樹莓果實(shí)多糖，多糖檢測方法為苯酚-硫酸法。在復(fù)合酶配比試驗(yàn)基礎(chǔ)上，選擇復(fù)合酶配比及用量、pH、溫度及提取時間為自變量，以多糖得率為響應(yīng)值，利用響應(yīng)面分析法優(yōu)化并結(jié)合實(shí)際，得出最佳提取工藝：復(fù)合酶配比（果膠酶∶纖維素酶∶木瓜蛋白酶）=2.5∶1.7∶2.1，復(fù)合酶用量2.6%、pH 4、溫度55℃、提取時間2.6 h，驗(yàn)證試驗(yàn)得率達(dá)到4.12%。

多糖；復(fù)合酶；響應(yīng)面分析；樹莓

樹莓（Rraspberry）是薔薇科（Rasaceae）懸鉤子屬（Rubus）植物，灌木性果樹，歐美國家廣泛栽培，我國從南到北、從西到東均有野生品種分布。樹莓柔嫩多汁，色澤宜人，風(fēng)味獨(dú)特，富含多種維生素和礦物質(zhì)元素，尤其富含多糖、黃酮類、SOD、鞣化酸等活性物質(zhì)，具有多種利用途徑和利用價值[1]。目前關(guān)于樹莓果實(shí)的研究主要集中在多酚、鞣花酸等活性物質(zhì)[2-3]，而對于樹莓多糖研究少有報道。

近年研究表明，多糖具有免疫調(diào)節(jié)、抗氧化、抗腫瘤、降血脂、增強(qiáng)免疫力等生物活性[4-7]，研究指出樹莓多糖具有明顯的促進(jìn)淋巴細(xì)胞增殖作用并對羥基自由基和超氧陰離子具有較強(qiáng)的清除能力[8]。樹莓果實(shí)多糖的其他功能有待進(jìn)一步研究。研究樹莓果實(shí)多糖的提取工藝，有利于促進(jìn)樹莓的綜合利用與深度開發(fā)，提高樹莓產(chǎn)品的附加值。

目前多糖提取的常用方法主要有水提取法、稀酸浸提法、稀堿浸提法、酶解法、超聲法、微波法等。近年多采用混合或輔助手段降低溶劑用量，提高提取效率。采用熱水法提取樹莓果實(shí)多糖，容易把蛋白質(zhì)、苷類等水溶性成分浸出，從而使提取液存放時腐敗變質(zhì)，為后續(xù)分離帶來困難，且該法提取率也不高[9]。多糖的提取方法還有稀堿液浸提法、稀酸液浸提法，但由于稀酸、稀堿條件下，易使多糖發(fā)生糖苷鍵斷裂，部分多糖發(fā)生水解而使多糖提取率減少，應(yīng)避免采用稀堿液浸提法和稀酸液浸提法。

本試驗(yàn)采用復(fù)合酶法提取樹莓果實(shí)多糖，復(fù)合酶法提取的實(shí)質(zhì)是通過酶解反應(yīng)強(qiáng)化傳質(zhì)過程，提高多糖得率。選用果膠酶、纖維素酶和木瓜蛋白酶進(jìn)行復(fù)合，主要利用果膠酶和纖維素酶水解果膠和纖維素及木瓜蛋白酶對植物細(xì)胞中游離的蛋白質(zhì)有分解作用，有利于多糖的浸出。此法具有條件溫和、雜質(zhì)易除和得率高等優(yōu)點(diǎn)，并結(jié)合響應(yīng)面分析法對提取工藝條件進(jìn)行優(yōu)化[10-12]，為進(jìn)一步研究其生理活性和開發(fā)利用黑龍江省小漿果資源提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與試劑

樹莓（秋福），采于東北農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝試驗(yàn)站；果膠酶、纖維素酶、木瓜蛋白酶（上海藍(lán)季科技發(fā)展有限公司，均>30 U·mg-1）；葡萄糖、苯酚、濃硫酸等其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

JJ-2組織搗碎勻漿機(jī)，常州國華電器有限公司；T6新悅-可見分光光度計，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；電子分析天平，北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；HZS-H水浴振蕩器，哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司；pH計，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 樹莓果實(shí)多糖得率計算

總糖含量測定：苯酚-濃硫酸法；還原糖含量測定：3，5-二硝基水楊酸法；多糖含量=總糖含量-還原糖含量。

式中，m為準(zhǔn)確稱取樹莓果實(shí)質(zhì)量，c為由標(biāo)準(zhǔn)曲線計算所得樹莓果實(shí)多糖的質(zhì)量濃度，V為待測溶液體積，D為稀釋倍數(shù)。

1.3.2 復(fù)合酶配比響應(yīng)面試驗(yàn)

首先進(jìn)行單因素試驗(yàn)，設(shè)定液料比為15:1，溫度50℃，提取時間1 h，準(zhǔn)確稱取經(jīng)破碎后的樹莓果實(shí)1 g，分別采用果膠酶（0.4%、0.8%、1.2%、1.6%、2.0%、2.4%、2.8%）、纖維素酶（0.4%、0.8%、1.2%、1.6%、2.0%、2.4%、2.8%）、木瓜蛋白酶（0.4%、0.8%、1.2%、1.6%、2.0%、2.4%、2.8%）提取多糖，過濾后得到提取液，定容100 mL，測定多糖含量，計算得率，確定不同酶用量范圍分別為：果膠酶2.0%～2.8%，纖維素酶1.2%～2.0%，木瓜蛋白酶1.6%～2.4%。在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，根據(jù)響應(yīng)面分析軟件提供的模型，設(shè)果膠酶、纖維素酶、木瓜蛋白酶三因素為自變量，樹莓果實(shí)多糖得率為響應(yīng)值，設(shè)計三因素三水平的響應(yīng)面分析試驗(yàn)，優(yōu)化復(fù)合酶配比。

1.3.3 復(fù)合酶條件優(yōu)化的響應(yīng)面試驗(yàn)

綜合復(fù)合酶配比試驗(yàn)結(jié)果，設(shè)定液料比15∶1，選擇復(fù)合酶用量（A）、pH（B）、提取溫度（C）和提取時間（D）作為自變量，以樹莓果實(shí)多糖得率為響應(yīng)值，根據(jù)Box-Beknhen中心組合試驗(yàn)設(shè)計原理，設(shè)計四因素三水平響應(yīng)面分析試驗(yàn)，得到優(yōu)化的復(fù)合酶酶解條件。

2 結(jié)果與分析

2.1 復(fù)合酶配比響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果及方差分析

利用軟件Design Expert 8.0.0采用中心組合設(shè)計方法（BBD），綜合單因素試驗(yàn)結(jié)果，對復(fù)合酶配比進(jìn)行優(yōu)化，獲得自變量為果膠酶用量、纖維素酶用量、木瓜蛋白酶用量的三因素三水平的響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計的二次多項(xiàng)回歸方程，以多糖得率為考查標(biāo)準(zhǔn)，優(yōu)選出最佳提取條件。試驗(yàn)設(shè)計及結(jié)果見表1、2。

表1 復(fù)合酶配比的Box-Benhnken試驗(yàn)設(shè)計方案及響應(yīng)值Table 1 Box-Behnken experimental design and response value of composite enzyme mixture

表2 復(fù)合酶配比的響應(yīng)面方差分析Table 2 Response surface variance analysis of composite enzyme mixture

對試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行回歸擬合，得到以多糖得率為響應(yīng)值的回歸方程：多糖得率（%）=3.82+0.047A+ 0.037B+0.019C-0.013AB-0.030AC-7.500E-005BC-0.089A2-0.058B2-0.019C2。

方程中各項(xiàng)系數(shù)絕對值的大小直接反映各因素對指標(biāo)值的影響程度，系數(shù)的正負(fù)反映影響方向。

由表2可知，以多糖得率為響應(yīng)值時，模型P<0.0001，表明該二次方程模型極顯著。同時失擬項(xiàng)P=0.5814>0.0500，表明正交試驗(yàn)結(jié)果和數(shù)學(xué)模型擬合良好，即可用數(shù)學(xué)模型推測試驗(yàn)結(jié)果。R2=0.9779，表明97.79%的數(shù)據(jù)可用此方程解釋。變異系數(shù)為0.45%，說明模型的置信度較高，模型方程能夠較好反映真實(shí)的試驗(yàn)值。另外，由表2可知，各因素對多糖得率影響的顯著程度由大到小為果膠酶用量＞纖維素酶用量＞木瓜蛋白酶用量。各因素交互作用對多糖得率的影響強(qiáng)弱程度由大到小為AC>AB>BC。

根據(jù)該模型得到的最優(yōu)提取工藝條件為：果膠酶用量2.47%、纖維素酶用量1.72%、木瓜蛋白酶用量2.14%，在此條件下樹莓果實(shí)多糖理論得率為3.83%?？紤]實(shí)際操作條件修正為：果膠酶用量2.5%、纖維素酶用量1.7%、木瓜蛋白酶用量2.1%，果膠酶用量∶纖維素酶用量∶木瓜蛋白酶用量=2.5∶1.7∶2.1在此條件下對樹莓果實(shí)多糖提取，實(shí)際獲得的得率為3.79%，與預(yù)測值接近。

2.2 復(fù)合酶工藝條件優(yōu)化的響應(yīng)面分析試驗(yàn)

2.2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果及方差分析

對復(fù)合酶提取過程進(jìn)行條件優(yōu)化，以自變量為酶用量、pH、溫度和提取時間設(shè)計四因素三水平的響應(yīng)面試驗(yàn)，以多糖得率為考查標(biāo)準(zhǔn)，選出最佳提取條件。響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果及方差分析結(jié)果見表3、4。

表3 復(fù)合酶條件優(yōu)化的Box-Benhnken試驗(yàn)設(shè)計方案及響應(yīng)值Table 3 Box-Behnken experimental design and response value of compound enzyme optimization

表4 復(fù)合酶條件優(yōu)化的響應(yīng)面方差分析Table 4 Response surface variance analysis of of compound enzyme optimization

對試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行回歸擬合，得到以多糖得率為響應(yīng)值的回歸方程：多糖得率（%）=4.13+0.090A+ 0.050B+0.021C-0.075D-0.015AB+2.150E-003AC-0.028AD+6.450E-003BC+0.026BD-0.028CD-0.15A2-0.18B2-0.18C2-0.17D2。

由表4可知，以多糖得率為響應(yīng)值時，模型P< 0.0001，表明該二次方程模型極顯著。同時失擬項(xiàng)P=0.0524>0.0500，表明正交試驗(yàn)結(jié)果和數(shù)學(xué)模型擬合良好，即可用數(shù)學(xué)模型推測試驗(yàn)結(jié)果。R2= 0.9848，表明98.48%的數(shù)據(jù)可用此方程解釋。變異系數(shù)為0.71%，表明模型置信度較高，模型方程能夠較好反映真實(shí)的試驗(yàn)值。另外，由表4可知，各因素對多糖得率影響的顯著程度由大到小為酶用量>提取時間>pH>溫度。各因素交互作用對多糖得率的影響強(qiáng)弱程度由大到小為AD>CD>BD>AB> BC>AC。

2.2.2 響應(yīng)面交互作用分析

各試驗(yàn)因素間的交互作用對響應(yīng)值的影響見圖1～5。圖1為當(dāng)溫度55℃，提取時間為2.5 h時，復(fù)合酶用量和pH的交互作用對多糖得率的影響。當(dāng)復(fù)合酶用量2.4%～2.9%，pH 3.6～4.6時，多糖得率較高。當(dāng)pH固定不變時，多糖得率隨復(fù)合酶用量的增加先升高后略有降低；當(dāng)復(fù)合酶用量固定不變時，隨著pH增大，多糖得率先升高后降低。

圖1 復(fù)合酶用量和pH交互作用對多糖得率的影響Fig.1 Effects of compound enzymes dosage and pH on extraction yield

圖2為pH 4，提取時間2.5 h時，復(fù)合酶用量和溫度的交互作用對多糖得率的影響。當(dāng)復(fù)合酶用量在2.4%～2.9%，溫度51～58℃時，多糖得率較高。當(dāng)復(fù)合酶用量固定不變時，多糖得率隨溫度的升高先升高后降低；當(dāng)溫度固定不變時，隨復(fù)合酶用量的增加，多糖得率先升高后略有降低。

圖2 復(fù)合酶用量和溫度交互作用對多糖得率的影響Fig.2 Effects of compound enzymes dosage and temperature on extraction yield

圖3為pH 4，溫度55℃時，復(fù)合酶用量和提取時間的交互作用對多糖得率的影響。當(dāng)復(fù)合酶用量2.3%～2.9%，提取時間2.3～2.9 h時，多糖得率較高。當(dāng)復(fù)合酶用量固定不變時，多糖得率隨提取時間的延長先升高后略有降低；當(dāng)提取時間固定不變時，隨復(fù)合酶用量增大，多糖得率先緩慢升高后降低。

圖3 復(fù)合酶用量和提取時間交互作用對多糖得率的影響Fig.3 Effects of compound enzymes dosage and extraction time on extraction yield

圖4為復(fù)合酶用量2.5%，提取時間2.5 h時，pH和溫度的交互作用對多糖得率的影響。當(dāng)pH 3.7～4.6，溫度53～57.5℃時，多糖得率較高。當(dāng)pH固定不變時，多糖得率隨溫度的升高先升高后降低；當(dāng)溫度固定不變時，隨pH增大，多糖得率先緩慢升高后降低。

圖4 pH和溫度交互作用對多糖得率的影響Fig.4 Effects of pH and temperature on extraction yield

圖5的響應(yīng)曲面和等高線顯示當(dāng)復(fù)合酶用量2.5%，提取溫度55℃時，pH和提取時間的交互作用對多糖得率的影響。當(dāng)pH 3.7～4.65，提取時間2.2～2.8 h時，多糖得率較高。當(dāng)pH固定不變時，多糖得率隨提取時間的升高先升高后降低；當(dāng)提取時間固定不變時，隨pH增大，多糖得率先緩慢升高后降低。

圖5 pH和提取時間交互作用對多糖得率的影響Fig.5 Effects of pH and extraction time on extraction yield

圖6的響應(yīng)曲面和等高線顯示當(dāng)復(fù)合酶用量2.5%，pH 4時，溫度和提取時間的交互作用對多糖得率的影響。當(dāng)溫度53～57.5℃，提取時間2.3～2.8 h時，多糖得率較高。當(dāng)溫度固定不變時，多糖得率隨提取時間的升高先升高后降低；當(dāng)提取時間固定不變時，隨溫度增大，多糖得率先緩慢升高后降低。

圖6 溫度和提取時間交互作用對多糖得率的影響Fig.6 Effects of temperature and extraction time on extraction yield

3 討論與結(jié)論

目前多糖提取方法有水提法、溶劑提取法、微波提取法、酶解法、醇提法等。本研究采用酶解法及三種單一酶復(fù)合方法提高多糖得率，提取方法相對溫和，溫度適宜，不會破壞多糖組分。由于在提取過程中添加酶，在后續(xù)處理上對蛋白進(jìn)行清除，以確保能得到較純多糖。

另外本研究將響應(yīng)曲面法運(yùn)用于優(yōu)化樹莓果實(shí)多糖的提取工藝。經(jīng)試驗(yàn)優(yōu)化后的復(fù)合酶提取樹莓果實(shí)多糖的最佳工藝條件為：復(fù)合酶配比（果膠酶∶纖維素酶∶木瓜蛋白酶）=2.5∶1.7∶2.1，復(fù)合酶用量2.6%，pH 4，溫度55℃，提取時間2.6 h，在此條件下，樹莓果實(shí)多糖得率達(dá)4.12%。與熱水法（提取溫度100℃，提取時間1 h，液料比10∶1，多糖得率3.44%）提取相比，得率相對較高，原因在于果膠酶、纖維素酶和木瓜蛋白酶的加入使植物組織細(xì)胞的細(xì)胞壁破裂，有利于細(xì)胞內(nèi)多糖的浸出，分解樹莓果實(shí)細(xì)胞中游離的蛋白質(zhì)，降低與多糖的結(jié)合力，釋放細(xì)胞壁內(nèi)的活性多糖，多糖得率提高。研究結(jié)果顯示復(fù)合酶法提取樹莓多糖得率較高，將多種多糖提取方法結(jié)合使用最大限度地提高多糖得率，尚待深入研究。

[1]王象欣,徐雅琴.樹莓中多糖提取工藝的研究[J].食品科技, 2007(5):107-109.

[2]王麗,王振宇,樊梓鸞,等.樹莓總多酚及其抗氧化功能研究[J].中國林副特產(chǎn),2011(5):17-20.

[3]李小萍.紅樹莓果中鞣花酸的提取、純化及抗氧化性和抑菌活性的初步研究[D].蘭州:甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué),2010:6.

[4]于澤源,任中杰,徐雅琴,等.黑穗醋栗多糖抗氧化及抑制非酶糖基化活性的研究[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報,2012,43(10):73-78.

[5]Lia S P,Zhang G H,Zeng Q,et al.Hypoglycemic activity of polysaccharide,with antioxidation,isolated from cultured Cordyceps mycelia[J].Phytomedicine,2006,13:428-433.

[6]Monobe M,Ema K,Kato E,et al.Immunostimulating activity of a crude polysaccharide derived from green tea(Camellia sanensis) extract[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry,2008,56: 1423-1427.

[7]Takata R,Yamamoto R,Yanai K,et al.Immunostimulatory effects of a polysaccharide-rich substance with antitumor activity isolated from black currant(Ribes nigru L.)[J].Bioscience Biotechnology and Biochemitry,2005,69(11):2042-2050.

[8]陳坤華,方軍,宮斌,等.覆盆子提取成分促進(jìn)淋巴細(xì)胞增殖作用及環(huán)核苷酸的關(guān)系[J].上海免疫學(xué)雜志,1995,15(5):302-304.

[9]劉明學(xué),牛靖娥,蘇忠偉,等.覆盆子多糖提取、結(jié)構(gòu)分析及自由基清除作用研究[J].食品科技,2009,34(7):163-167.

[10]Sun Y X,Kennedy J F.Application of response surface methodology for optimization of polysaccharides production parameters from the roots of Codonopsis pilosula by a central composite design [J].Carbohydrate Polymers,2010,80:949-953.

[11]劉軍海,黃寶旭,蔣德超.響應(yīng)面分析法優(yōu)化艾葉多糖提取工藝研究[J].食品科學(xué),2009(2):114-118.

[12]Yin G H,Dang Y L.Optimization of extraction technology of the Lycium barbarum polysaccharides by Box-Behnken statistical design[J].Carbohydrate Polymers,2008,74:603-610.

Study on extraction process of raspberry polysaccharide with compound enzyme method

YU Zeyuan1,TENG Xin1,XU Yaqin2,LI Xingguo1(1.School of Horticulture,Northeast Agricultural University,Harbin 150030,China;2.School of Science, Northeast Agricultural University,Harbin 150030,China)

Single enzyme(pectinase,cellulase,papain)method was used for extracting polysaccharide,determined by pectinase,cellulase and papain compound to extract the raspberry fruit polysaccharide,the content of polysaccharide was measured by phenol-sulfuric acid method.Based on the ratio of compound enzyme test,the mathematical regression model was established about the dependent variable(extraction yield of polysaccharide)and independent variables(dosage of compound enzymes,pH,temperature and extraction time),and the optimum extraction condition was obtained by response surface methodology(RSM)as followed,composite enzyme mixture(pectinase, cellulase,papain)=2.5∶1.7∶2.1,the dosage of compound enzyme was 2.6%,pH 4,temperature 55℃, extraction time 2.6,the actual value was 4.12%.

polysaccharide;compound enzymes;RSM;raspberry

S663.9

A

1005-9369（2014）03-0052-07

時間2014-3-20 17:46:00 [URL]http://www.cnki.net/kcms/detail/23.1391.S.20140320.1746.001.html

于澤源,滕歆,徐雅琴,等.復(fù)合酶法提取樹莓果實(shí)多糖工藝優(yōu)化的研究[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報,2014,45(3):52-58.

Yu Zeyuan,Teng Xin,Xu Yaqin,et al.Study on extraction process of raspberry polysaccharide with compound enzyme method[J].Journal of Northeast Agricultural University,2014,45(3):52-58.(in Chinese with English abstract)

2013-08-08

黑龍江省教育廳面上項(xiàng)目（12531023）；黑龍江省研究生創(chuàng)新科研項(xiàng)目（YJSCX2012—010HLJ）

于澤源（1961-），男，教授，博士，博士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)楣弋a(chǎn)品產(chǎn)后加工及生理。E-mail:yzy@neau.edu.cn