姜景彬，彭祥珍，許向陽，陳秀玲，李景富

（東北農(nóng)業(yè)大學園藝學院，哈爾濱 150030）

番茄抗黃化曲葉病基因Ty-1的遺傳分析與AFLP標記

姜景彬，彭祥珍，許向陽，陳秀玲，李景富*

（東北農(nóng)業(yè)大學園藝學院，哈爾濱 150030）

研究以番茄黃化曲葉病抗病品種“10033”與感病品種“10981”為親本配制雜交組合，利用P1、P2、F1、F2、BC1P1和BC1P26個世代進行番茄黃化曲葉病抗性基因Ty-1的遺傳規(guī)律分析。用288對AFLP引物對215株F2代分離群體進行連鎖分析。得到4個與番茄黃化曲葉病抗病基因Ty-1連鎖的AFLP標記分別是E62M37-D、E51M 44-C、E45M61-E、E40M60-A，與抗病基因Ty-1的連鎖遺傳距離分別為8.9、17.5、19.6和30.8 cM。

番茄黃化曲葉病毒??；Ty-1；遺傳分析；AFLP

番茄（Lycopersicon esculentum Mill.）是世界各國廣泛種植的蔬菜作物之一，也是我國主栽蔬菜作物之一，近年來隨著番茄種質(zhì)資源商品化，番茄病蟲害迅速擴散蔓延，成為影響番茄產(chǎn)量和品質(zhì)的主要因素。其中番茄黃化曲葉?。═YLCD）是限制番茄生產(chǎn)的重要病害之一。該病害由雙生病毒科（Geminiviridae）菜豆金色花葉病毒屬（Begomovirus）的番茄黃化曲葉病毒（Tomato yellow leaf curl virus，TYLCV）引起，并通過煙粉虱（Bemisia tobaci）傳播，是一種毀滅性病害[1]。19世紀60年代以色列等國報道以來，TYLCD在世界范圍內(nèi)開始大面積爆發(fā)流行，自2002年傳入我國南方以來，目前在我國以自南向北、自西向東的趨勢蔓延，在番茄生產(chǎn)上造成嚴重危害。已成為影響世界番茄生產(chǎn)的主要限制因素之一。

目前抗番茄黃化曲葉病毒病的基因有Ty-1、Ty-2、Ty-3、Ty-3a、Ty-4、Ty-5等，其中研究較多的是Ty-1、Ty-2和Ty-3基因[2-5]。番茄黃化曲葉病毒病屬檢疫性病害，利用常規(guī)育種方法進行抗病育種困難較大，利用分子標記與常規(guī)方法結合才能高效、準確地進行抗病材料的篩選與鑒定。本研究利用AFLP分子標記，尋找與番茄黃化曲葉病毒病抗病基因Ty-1緊密聯(lián)鎖的分子標記，為分子標記輔助育種奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

供試番茄材料分別是對TYLCV抗病親本10033 （P1）和感病親本10981（P2），其中抗病親本10033由亞洲蔬菜研究發(fā)展中心提供，感病親本10981由東北農(nóng)業(yè)大學番茄研究所提供。母本10033與父本10981雜交獲得F1代，F(xiàn)1代分別與父、母本回交獲得BC1P1和BC1P2兩個回交世代，同時F1代自交獲得F2代，用P1、P2、F1、F2、BC1P1和BC1P26個世代進行番茄黃化曲葉病抗性基因Ty-1的遺傳規(guī)律分析，利用F2代分離群體進行分子標記。

1.2 方法

1.2.1 接種鑒定

田間播種鑒定依靠煙粉虱傳播使材料獲得病毒表現(xiàn)癥狀，毒源為浙江省農(nóng)業(yè)科學院蔬菜研究所溫室內(nèi)保存的帶毒煙粉虱。在含有大量帶毒煙粉虱的防蟲溫室內(nèi)將P1、P2、F1、F2、BC1P1和BC1P26個世代的種子于2010年8月播種于10 cm× 10 cm營養(yǎng)缽中。發(fā)病期間不噴施任何殺蟲劑，任其自然發(fā)病。

1.2.2 病情調(diào)查及數(shù)據(jù)處理

接種后定期觀察發(fā)病情況，30 d左右待感病親本完全發(fā)病時逐株調(diào)查6個世代各株的發(fā)病情況，按照申書興方法進行病情分級[6]：0級-無癥狀；1 級-明脈、葉片輕黃化；3級-葉片黃化、邊緣上卷；5級-葉片重黃化、皺縮、少數(shù)葉片畸形；7 級-葉片重黃化、畸形縮小，植株明顯矮化；9級-葉片嚴重畸形縮小，植株嚴重矮化，甚至枯死。根據(jù)通用的番茄病毒病群體分級標準[3]，將各世代的番茄植株分為免疫（I，不表現(xiàn)癥狀，病情指數(shù)0）、高抗（HR，0<病情指數(shù)≤2）、抗病（R，2<病情指數(shù)≤15）、中抗（MR，15<病情指數(shù)≤30）、感病（S，30<病情指數(shù)≤100）；并將I、HR、R及MR歸為抗病，將S歸為感病，最后進行抗病性遺傳的適合性測驗，確定番茄抗病親本的抗性遺傳規(guī)律。

1.2.3 DNA提取

采用改良的CTAB法[7]提取親本和F2群體各單株DNA，在1%瓊脂糖凝膠和Eppendorf蛋白核酸測定儀上測定DNA質(zhì)量和濃度，用去離子水稀釋至50 ng·μL-1。

1.2.4 抗感池構建

采用BSA構池法在F2群體中隨機選取10株高抗單株和10株高感單株，分別提取DNA，然后DNA進行等量混合，分別構建抗病基因池（BR）和感病基因池（BS）。

1.2.5 AFLP標記

AFLP標記參照Vos等的方法[8]。酶切用Eco RⅠ/ MseⅠ酶切；預擴增引物用E00和M00；選擇性擴增用E引物和M引物組合的288對引物。

1.2.5.1 基因組DNA的酶切與連接

酶切連接反應體系：模板DNA 100～500 ng，Eco RⅠ（10 U·μL-1）0.5 μL，MseⅠ（10 U·μL-1）0.5 μL，Eco RⅠadapter（5 pmol·μL-1）1.0 μL，MseⅠadapte（50 pmol·μL-1）1.0 μL，ATP（100 mmol·L-1），10×buffer 5.0 μL，T4DNA連接酶（5 U·μL-1）0.6 μL，加ddH2O至25 μL。37℃水浴鍋中酶切與連接6～8 h或過夜。

1.2.5.2 酶切鏈接產(chǎn)物預擴增

預擴增體系：DNA（酶切連接后產(chǎn)物）2 μL，EcoRⅠprimer（E0050ng·μL-1）0.6μL，MseⅠ-primer （M00 50 ng·μL-1）0.6 μL，10×buffer 2 μL，dNTPs （2.5 mmo·L-1）1.6 μL，MgCl21.2 μL，TaqDNA聚合酶（5 U·μL-1）0.2 μL，加ddH2O至20 μL。

預擴增程序：預擴增反應在PCR儀上進行，程序為94℃預變性3 min；94℃變性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸1 min，24個循環(huán)；72℃延伸10 min；4℃終止反應。預擴增完成后，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測預擴增結果，將預擴增產(chǎn)物稀釋20～40倍，用于選擇性擴增。

1.2.5.3 選擇性擴增

選擇性擴增體系：DNA（預擴增產(chǎn)物稀釋25×）5 μL，Exx（50 ng·μL-1）1.0 μL，Mxx（50 ng·μL-1）1.0 μL，10×buffer 2.0 μL，dNTPs（2.5 mmol·L-1）1.6 μL，MgCl21.2 μL，Taq DNA聚合酶（5 U·μL-1）0.2 μL，加ddH2O至總體系20 μL。

選擇性擴增程序：擴增在PCR儀上進行，程序為94℃預變性3 min；94℃變性30 s，65℃退火30 s（每個循環(huán)降0.7℃），72℃延伸1 min，12個循環(huán)；94℃變性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸1 min（每個循環(huán)增加1 s），25個循環(huán)；72℃延伸10 min；4℃終止反應。95℃變性5 min后進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，觀察并記錄條帶。

1.2.6 數(shù)據(jù)分析

AFLP標記中，有帶型記為“1”，無帶型記為“0”，缺失記為“-”。數(shù)據(jù)統(tǒng)計完成后利用Mapmaker 3.0軟件計算遺傳距離，臨界LOD值取3.0。

2 結果與分析

2.1 番茄TYLCD抗性鑒定與遺傳分析

通過對6個世代各單株黃化曲葉病抗感性觀察統(tǒng)計，鑒定結果顯示（見表1），抗病親本10033和感病親本10981的黃化曲葉病毒病發(fā)病率分別為1.2%和100%，分別屬于高抗和高感類型。Fl代抗性水平明顯高于感病親本，其群體病情指數(shù)為20.1，屬于中抗類型，但抗病親本屬于高抗類型，F(xiàn)l代抗性水平接近抗病親本，有少量葉片輕黃化，表明抗病基因在Fl代表現(xiàn)為部分顯性。

表1 番茄黃化曲葉病抗感性鑒定結果Table 1 Resistance identification results of TYLCD

F2代各病級植株分布范圍較大，病株分布在0～9級，其中0～1級的高抗植株56株，3～5級的中抗植株110株，7～9級的感病植株49株。通過卡方分析，高抗株數(shù)、中抗株數(shù)和感病株數(shù)的比例符合單基因控制的若將高抗和中抗植株（0～5級）一起劃分為抗病群體，則抗病株數(shù)有166株，感病株數(shù)為49株，其抗感比例也符合單基因控制的BC1P1和BC1P2群體的卡方適應性分析結果也說明10033對黃花曲葉病毒病的抗性符合單基因控制的分離比例。經(jīng)過六世代抗病性遺傳分析可得，抗黃化曲葉病毒病番茄材料10033的抗性由一個不完全顯性單基因控制。

2.2 AFLP標記

2.2.1 DNA提取

本試驗采用改良CTAB法提取兩個親本（10033、10981）、F1和10033×10981群體的215個F2單株的DNA，提取后用1%瓊脂糖電泳檢測。

從圖1中可以看到，各帶型整齊一致，主帶清晰而集中，無拖尾降解現(xiàn)象，說明DNA結構完整且純度高，符合對DNA模板要求極高的AFLP和SSR分子標記的要求，可用于下一步試驗。

圖1 部分樣本基因組DNA電泳圖Fig.1 Electrophoresis results of genome DNA of part samples

2.2.2 引物篩選

用父母本10981和10033對288對AFLP引物進行初篩，篩出父母本間有差異的引物108對（見圖2），篩出率37.5%。然后利用抗感池對初篩的引物進行復選，篩出25對差異明顯和多態(tài)性較好的引物，結果見表2。

圖2 10033×10981群體篩選出的部分AFLP特異引物Fig.2 Screened AFLP primers on 10033×10981 population

表2 用于群體F2單株選擇性擴增的特異引物Table 2 Special primers used in amplication of F2individual plants of 10033×10981

2.2.3 F2單株PCR擴增

利用F2代群體的215個單株的DNA為模板，對25對多態(tài)性好、差異明顯的AFLP引物進行選擇擴增，然后用聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測（見圖3），并記錄譜帶。

結果見圖3。

圖3 引物E40/M60在部分F2單株中的擴增結果Fig.3 Amplified products on AFLP primer of E40/M60 on partial F2population

2.2.4 連鎖分析

通過Mapmaker 3.0軟件，對分離群體單株的抗病性和分子標記的分離數(shù)據(jù)進行連鎖分析，得出遺傳距離。結果表明：E62M37-D、E51M44-C、E45M61-E、E40M60-A與抗病基因Ty-1的連鎖遺傳距離分別為8.9、17.5、19.6和30.8 cM。

3 討論與結論

本試驗采用穩(wěn)定成熟的AFLP標記方法，對番茄抗黃化曲葉病Ty-1基因進行研究，獲得4個緊密連鎖的標記，對促進分子標記輔助番茄黃化曲葉病抗病育種具有重要作用。以抗病基因Ty-1相連鎖的標記為依據(jù)，可以進行抗番茄黃化曲葉病標記輔助選擇育種，也為分子標記多抗性聚合育種提供依據(jù)，可大大提高育種效率。

對六個世代抗病性調(diào)查分析結果表明，番茄黃抗化曲葉病Ty-1基因的抗性由不完全顯性單基因控制，這與Pilowsky和Cohen利用抗源LA121與普通番茄雜交，通過對F1、F2、F3和BC1代的抗性遺傳研究結果一致[9]。Hassan等通過對LA121和LA373抗性遺傳研究，認為這些材料的抗性是數(shù)量性狀[10]。Ji等認為醋栗番茄攜帶的抗TYLCV基因是顯性單基因[11]。Anbinder等認為，抗性材料大多具有多基因抗性，可見不同來源的野生品種其抗性是由不同的遺傳機制控制，且在絕大數(shù)情況下，抗性涉及多基因控制[12]，即使有主效單個抗性基因，也會有一些微效多基因或數(shù)量性狀基因起作用。此外在進行抗病性接種鑒定時，試驗結果較易受氣候條件、栽培條件和人為因素（如接種方法、預處理）等外在因子的影響[13]。因此，不同番茄抗性材料，在不同環(huán)境條件下，對黃化曲葉病毒的抗性不同。

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Genetic analysis and AFLP molecular marker of tomato yellow leaf curl virus geneTy-1 in tomato

JIANG Jingbin,PENG Xiangzhen,XU Xiangyang, CHEN Xiuling,LI Jingfu(School of Horticulture,Northeast Agricultural University,Harbin 150030, China)

In this study,crosses were made with resistant tomato variety 10033 and susceptible variety 10981 to tomato yellow leaf curl virus disease.Six generation P1,P2,F1,F2,BC1P1and BC1P2were used to analyze the genetic ofTy-1.Through AFLP analysis of 215 F2progenies using 288 AFLP primer combinations.Four AFLP markers linked to theTy-1 were identified.The genetic distance of E62M37-D,E51M44-C,E45M61-E and E40M60-A were 8.9,17.5,19.6 and 30.8 cM,respectively.

tomato yellow leaf curl virus disease;Ty-1;genetic analysis;AFLP ?

S436.412

A

1005-9369（2014）03-0034-06

時間2014-3-21 8:31:00 [URL]http://www.cnki.net/kcms/detail/23.1391.S.20140321.0831.002.html

姜景彬,彭祥珍,許向陽,等.番茄抗黃化曲葉病基因Ty-1的遺傳分析與AFLP標記[J].東北農(nóng)業(yè)大學學報,2014,45(3):34-39.

Jiang Jingbin,Peng Xiangzhen,Xu Xiangyang,et al.Genetic analysis and AFLP molecular marker of tomato yellow leaf curl virus geneTy-1 in tomato[J].Journal of Northeast Agricultural University,2014,45(3):34-39.(in Chinese with English abstract)

2012-03-28

國家“十二五”支撐計劃項目（2012BAD02B02-7）；現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術體系專項（CARS-25-A-15）作者簡介：姜景彬（1978-），男，農(nóng)藝師，碩士，研究方向為蔬菜遺傳育種。E-mail:jjb1248@126.com

*通訊作者：李景富，教授，博士生導師，研究方向為蔬菜遺傳育種與生物技術。E-mail:lijf-2005@126.com