王 浩，王紹東，李遠(yuǎn)明，姜 妍，劉 偉，于 佳

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)國(guó)家大豆工程技術(shù)研究中心，哈爾濱 150028）

高效固氮大豆根瘤菌株的篩選研究

王 浩，王紹東*，李遠(yuǎn)明，姜 妍，劉 偉，于 佳

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)國(guó)家大豆工程技術(shù)研究中心，哈爾濱 150028）

研究通過(guò)蛭石篩選，田間小區(qū)試驗(yàn)對(duì)黑龍江省3個(gè)主栽大豆品種黑農(nóng)35、合豐40和綏農(nóng)14進(jìn)行高效根瘤菌株的篩選，篩選出1株慢生大豆根瘤菌HDD12（Bradyrhizobium japonicum）和快生大豆根瘤菌HDD5 （Sinorhizobim fredii）。其中HDD12在合豐40和黑農(nóng)35上接種效果較好，均好于施肥處理和空白對(duì)照處理。HDD5在綏農(nóng)14上接種效果較好，但不如施肥對(duì)照處理。通過(guò)對(duì)產(chǎn)量構(gòu)成情況進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)單株莢數(shù)的增加是接種根瘤菌處理產(chǎn)量增加的主要因素。

大豆；根瘤菌；高效固氮；篩選

大豆是豆科植物，屬于一年生草本，喜溫、耐陰性植物，是我國(guó)重要的糧油兼用作物。大豆根系能夠分泌類黃酮等信號(hào)分子，誘導(dǎo)土壤中的根瘤菌對(duì)其進(jìn)行侵染、定殖，最終分化形成具有固氮活性的組織—根瘤，能夠?qū)⒖諝庵械牡D(zhuǎn)化為可以被大豆生長(zhǎng)利用的氮素養(yǎng)料[1]。

大豆與根瘤菌之間共生關(guān)系的建立受一系列因素影響，土壤酸堿度及不同品種都會(huì)對(duì)根瘤菌的種群結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響[2-5]。在中國(guó)，能夠與大豆結(jié)瘤的根瘤菌主要有慢生根瘤菌屬中的Bradyrhizobium japonicum、B.elkanii、B.liaoningense和B.yuanmingense，中華根瘤菌屬中的Sinorhizobium fredii，以及中慢生根瘤菌屬中的Mesorhizobium tianshanense[6]。而在非原始宿主中，林榕姍等發(fā)現(xiàn)一株分離自苜蓿的根瘤菌S.meliloti XJ96077也能與大豆結(jié)瘤[7]。在巴西，發(fā)現(xiàn)能與大豆結(jié)瘤的根瘤菌Rhizobium tropici和R.sp.[8]。研究結(jié)果表明，大豆根瘤菌的分布具有一定的生物地理特性，即不同生態(tài)環(huán)境會(huì)對(duì)大豆根瘤菌分布特性產(chǎn)生影響。

黑龍江省作為我國(guó)大豆的主要產(chǎn)區(qū)，對(duì)黑龍江省大豆主栽品種進(jìn)行高效大豆根瘤菌的篩選研究，獲得具有高效固氮能力的菌種，將為今后開(kāi)展針對(duì)性的施用根瘤菌肥料以及開(kāi)發(fā)利用優(yōu)良的菌種資源提供技術(shù)支持[9-11]。

1 材料與方法

1.1 大豆品種及菌株

所選用大豆品種為黑龍江省主栽大豆品種：黑農(nóng)35、合豐40和綏農(nóng)14。所用菌種為分離自這3個(gè)大豆品種的根瘤菌，其中8株屬于快生根瘤菌（S.fredii），編號(hào)分別為：HDD1，HDD2，HDD3，HDD4，HDD5，HDD6，HDD7，HDD8；12株屬于慢生根瘤菌（B.japonicum），編號(hào)分別為：HDD9，HDD10， HDD11， HDD12， HDD13， HDD14，HDD15， HDD16， HDD17， HDD18， HDD19，HDD20，另外以USDA110為陽(yáng)性對(duì)照，不接菌處理作為陰性對(duì)照。

1.2 蛭石篩選

1.2.1 種子消毒催芽

大豆種子經(jīng)仔細(xì)挑選（取種粒飽滿，種皮完整）后，95%乙醇浸泡30 s，直接放入0.1%升汞中，浸泡消毒4 min，取出，反復(fù)用大量的無(wú)菌水沖洗7次，最后浸泡在剛好沒(méi)過(guò)豆粒的無(wú)菌水中浸泡2 h，至種子完全吸脹后，擺入水瓊脂平板中，倒置，28℃，黑暗處，催芽3 d。

1.2.2 菌液培養(yǎng)及接種濃度

供試菌株用TY液體培養(yǎng)基試管培養(yǎng)，選取不同濃度菌液測(cè)定OD600吸光值及進(jìn)行平板計(jì)數(shù)。通過(guò)平板計(jì)數(shù)的結(jié)果確定接種所需的菌體濃度及接種量。

TY液體培養(yǎng)基（g·1 000 mL-1）：胰蛋白胨5，酵母粉3，CaCl2·H2O 0.7,pH 6.8～7.2。

1.2.3 雙層缽栽種體系

將蛭石拌低氮營(yíng)養(yǎng)液，裝入一次性塑料杯（底部打孔，穿入紗布條）中，用牛皮紙封口，放置在裝滿水的玻璃瓶上，間歇式濕熱滅菌3 h，待用。

調(diào)整菌液濃度，至OD600=2.0（約109cfu·mL-1），將已發(fā)芽的大豆種子在菌液中浸泡15 min后栽入滅菌的雙層缽體系中，每瓶一粒種子，再用移液器接種2 mL菌液。不同大豆品種接種不同菌株作為一個(gè)處理，每個(gè)處理5個(gè)重復(fù)。

1.2.4 生長(zhǎng)條件及收獲

蛭石盆栽置于溫室（溫度25℃，光強(qiáng)7 000～8 000 lx，光照時(shí)間13 h）中定期澆水。生長(zhǎng)至開(kāi)花期（約45 d）收獲植株，測(cè)定生物量，并進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.3 土著根瘤菌數(shù)量調(diào)查

為了保證接種的根瘤菌在田間具有較強(qiáng)競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)，有必要針對(duì)接種土壤進(jìn)行土著根瘤菌數(shù)量調(diào)查，在小區(qū)試驗(yàn)區(qū)內(nèi)較遠(yuǎn)位置取兩點(diǎn)（A點(diǎn)和B點(diǎn)），采集少量耕層土。采用最大或然數(shù)法（Most probable number，MPN）對(duì)土著根瘤菌進(jìn)行計(jì)數(shù)。

將黑農(nóng)35種子消毒后，催芽處理（同1.2.1），栽入無(wú)菌蛭石大試管（40 mm×300 mm），內(nèi)裝拌有低氮營(yíng)養(yǎng)液的蛭石中（121℃間歇滅菌，每次2 h），接種10-1～10-7稀釋度的土壤懸液1 mL，并設(shè)置不接種土壤懸液作為對(duì)照，每個(gè)稀釋度4個(gè)重復(fù)。放置于光照培養(yǎng)箱中7 000 lx，溫度維持在15～25℃，光照時(shí)間16 h，生長(zhǎng)5 w后進(jìn)行結(jié)瘤調(diào)查。中間視情況補(bǔ)加無(wú)菌水。用MPN法計(jì)算單位重量土體中所包含根瘤菌數(shù)目。

1.4 小區(qū)接種試驗(yàn)

選取蛭石回接中的優(yōu)勢(shì)菌株（S.fredii HDD5，分離自合豐40；B.liaoningense HDD12，分離自黑農(nóng)35）進(jìn)行小區(qū)接種試驗(yàn)。

菌株接種于鴨嘴瓶?jī)?nèi)YMA固體培養(yǎng)基平面上。28℃培養(yǎng)一周，將菌體用生理鹽水洗下，離心收集。取少量菌體稀釋，測(cè)定OD600吸光值，與平板計(jì)數(shù)的結(jié)果相結(jié)合，計(jì)算總接種量。

YMA固體培養(yǎng)基配方（g·1 000 mL-1）：甘露醇10，K2HPO40.25，KH2PO40.25，MgSO4·7H2O 0.2，NaCl 0.1，酵母粉0.8，瓊脂粉15，pH 6.8～7.0。

試驗(yàn)于東北農(nóng)業(yè)大學(xué)阿城畜牧園區(qū)內(nèi)進(jìn)行。采用隨機(jī)區(qū)組試驗(yàn)設(shè)計(jì)，重復(fù)3次。小區(qū)行長(zhǎng)5.7 m，壟距40 cm，面積41.61 m2。大豆品種為黑農(nóng)35、合豐40和綏農(nóng)14。株距10 cm，人工點(diǎn)播。播種時(shí)隨即施入根瘤菌肥水劑，接種菌液濃度約為1.5×108cfu·mL-1，每行接1 L菌液，每個(gè)小區(qū)接種量約為1.35×1012個(gè)。追肥處理于大豆初花期追施尿素150 kg·hm-2。小區(qū)試驗(yàn)占地約0.2 hm2。5月18日播種，10月8日收獲，收獲后考種調(diào)查產(chǎn)量及主要產(chǎn)量性狀。

于2011年5月下旬播種，10月中旬收獲。

2 結(jié)果與分析

2.1 蛭石篩選結(jié)果

對(duì)蛭石篩選的植株進(jìn)行地上部植株干重、鮮瘤重、干瘤重三項(xiàng)指標(biāo)的測(cè)定。每個(gè)品種各項(xiàng)指標(biāo)最優(yōu)的前四株菌株見(jiàn)表1。

從表1可以看出，B.japonicum HDD12在3個(gè)品種中都是優(yōu)勢(shì)的共生固氮菌株，在黑農(nóng)35中，該菌株的接種效果最好。S.fredii HDD5在合豐40和綏農(nóng)14中是優(yōu)勢(shì)菌株。因此，選取在3個(gè)品種中普遍的優(yōu)勢(shì)菌株HDD12和HDD5作為小區(qū)接種試驗(yàn)菌株。

2.2 土著根瘤菌數(shù)量測(cè)定結(jié)果

MPN法測(cè)定土著根瘤菌數(shù)量的植株結(jié)瘤情況見(jiàn)表2。

由此可知，A點(diǎn)的數(shù)量指標(biāo)為4、2、1，查MPN表，可以計(jì)算A點(diǎn)每克土中含土著根瘤菌的數(shù)量為9.5×102個(gè)，B點(diǎn)的數(shù)量指標(biāo)為4、4、2，查MPN表，可得B點(diǎn)每克土中含土著根瘤菌的數(shù)量為7.0×102個(gè)。土著根瘤菌數(shù)量較少，適宜接種根瘤菌。

表1 蛭石篩選結(jié)果Table 1 Result of vermiculite screen

表2 MPN法測(cè)定土著根瘤菌數(shù)量的植株結(jié)瘤情況Table 2 Nodulation result of MPN to test the host rhizobium number

2.3 小區(qū)接種試驗(yàn)結(jié)果

不同處理小區(qū)產(chǎn)量的情況見(jiàn)圖1。

圖1結(jié)果表明，對(duì)合豐40接種HDD12能夠增產(chǎn)，接種HDD12+施肥以及接種HDD5并不增產(chǎn)。對(duì)黑農(nóng)35接種HDD12和HDD5都能夠增產(chǎn)，但是HDD12接種效果更好，比CK處理增產(chǎn)35.6%，比施肥處理增產(chǎn)9%。綏農(nóng)14接種HDD12和HDD5效果均低于施肥對(duì)照處理。

圖1 小區(qū)接種試驗(yàn)產(chǎn)量柱狀圖Fig.1 Column graph of production in plot experiment

小區(qū)接種試驗(yàn)產(chǎn)量構(gòu)成情況見(jiàn)表3。

從產(chǎn)量構(gòu)成情況來(lái)看，接種根瘤菌對(duì)大豆單株莢數(shù)的增加較為明顯，其中黑農(nóng)35和綏農(nóng)14與對(duì)照相比差異達(dá)顯著水平。單株莢數(shù)的增加在一定程度上能夠提高大豆單位面積的產(chǎn)量。綏農(nóng)14和合豐40接種處理與對(duì)照相比單株空莢數(shù)顯著減少，其他產(chǎn)量性狀與對(duì)照相比差異不顯著。

通過(guò)對(duì)各處理產(chǎn)量的分析，考慮試驗(yàn)費(fèi)用，對(duì)各處理的經(jīng)濟(jì)效益進(jìn)行分析。接種根瘤菌的毛收益見(jiàn)圖2。

表3 小區(qū)接種試驗(yàn)產(chǎn)量構(gòu)成Table 3 Yield component of plot experiment

圖2 小區(qū)接種試驗(yàn)不同處理毛收益Fig.2 Gross income of different treatment in plot experiment

由圖2可知，小區(qū)試驗(yàn)中對(duì)黑農(nóng)35品種接種根瘤菌HDD12經(jīng)濟(jì)效益最好，每公頃增加毛收益4 200余元。另外，對(duì)合豐40接種HDD12，對(duì)綏農(nóng)14接種HDD5也能夠增加收益。

3 討論

本研究通過(guò)蛭石篩選及小區(qū)接種試驗(yàn)，篩選與黑龍江省3個(gè)主栽大豆品種黑農(nóng)35、合豐40和綏農(nóng)14相匹配的根瘤菌菌株，驗(yàn)證根瘤菌接種的增產(chǎn)作用。

通過(guò)對(duì)不同大豆品種各處理的產(chǎn)量分析發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照相比合豐40接種根瘤菌HDD12增產(chǎn)作用明顯，而施肥處理產(chǎn)量略低于對(duì)照，這一結(jié)果表明，對(duì)于大豆施用氮肥并不一定能夠增產(chǎn)，在有些情況還可能抑制產(chǎn)量提高。黑農(nóng)35施肥和接種根瘤菌HDD12均表現(xiàn)出明顯的增產(chǎn)趨勢(shì)，但是接種HDD12的產(chǎn)量要高于施肥處理。另外，HDD12分離自黑農(nóng)35，說(shuō)明原宿主品種更有可能分離出高固氮效能的菌株。而對(duì)綏農(nóng)14施用根瘤菌HDD12和HDD5增產(chǎn)效果不明顯，施肥處理略好于接種處理，說(shuō)明所選用的菌株對(duì)綏農(nóng)14田間共生固氮效率并不高。以上結(jié)果表明不同大豆品種對(duì)根瘤菌及施肥的效果不同，黑農(nóng)35的接種效果要好于另外兩個(gè)品種。兩種菌株相比較，HDD12的接種效果好于HDD5。

本研究中對(duì)不同處理的產(chǎn)量構(gòu)成情況進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，接種根瘤菌能夠增加大豆單株有效莢數(shù)，這一結(jié)果與孟慶英等研究結(jié)論較為一致[12]。但也有研究表明，接種根瘤菌后大豆莢數(shù)減少，粒重和百粒重增加[13]。接種根瘤菌對(duì)于大豆產(chǎn)量性狀的影響在不同研究中存在不一致性，原因尚待后續(xù)研究進(jìn)一步論證。

4 結(jié)論

3個(gè)品種接種HDD12平均產(chǎn)量3 657 kg·hm-2，與對(duì)照相比增產(chǎn)29.5%；接種HDD5平均產(chǎn)量3 306 kg·hm-2，與對(duì)照相比增產(chǎn)6.1%；追施氮肥尿素平均產(chǎn)量3 350 kg·hm-2，與對(duì)照相比增產(chǎn)9.0%。說(shuō)明接種HDD12在3個(gè)品種中具有普遍的增產(chǎn)作用，效果好于施肥處理，具有一定推廣價(jià)值。因此，要繼續(xù)對(duì)該菌株的接種效果進(jìn)行觀測(cè)，如果增產(chǎn)效果穩(wěn)定，可以考慮推廣應(yīng)用。

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Screen of the high nitrogen fixation activity rhizobium with soybean

WANG Hao,WANG Shaodong,LI Yuanming,JIANG Yan,LIU Wei,YU Jia(National Research Center for Soybean Engineering and Technology,Northeast Agricultural University,Harbin 150028, China)

By using the vermiculite pot culture and plot experiment to screen the high nitrogen fixation activity rhizobium with three popular soybean cultivars of Heilongjiang Province that are Heinong35,Hefeng40 and Suinong14.The slow growing soybean rhizobium HDD12(Bradyrhizobium japonicum)and fast growing soybean rhizobium HDD5(Sinorhizobim fredii)were performed well. HDD12 could increase the production of Hefeng40 and Heinong35 than the treatments of fertilizer treatment and blank control.HDD5 could increase the production of Suinong14,but less than the treatment of fertilizer.By analyzing the yield component,we found that pot number was the major factor of production increase.

soybean;rhizobium;high nitrogen fixation;screen

S565.1；Q939.11+4

A

1005-9369（2014）03-0015-05

時(shí)間2014-3-21 9:10:00 [URL]http://www.cnki.net/kcms/detail/23.1391.S.20140321.0910.007.html

王浩,王紹東,李遠(yuǎn)明,等.高效固氮大豆根瘤菌株的篩選研究[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2014,45(3):15-19.

Wang Hao,Wang Shaodong,Li Yuanming,et al.Screen of the high nitrogen fixation activity rhizobium with soybean[J]. Journal of Northeast Agricultural University,2014,45(3):15-19.(in Chinese with English abstract)

2013-11-29

黑龍江省青年科學(xué)基金項(xiàng)目（QC2013C013）；哈爾濱市科技局青年科技創(chuàng)新人才項(xiàng)目（2013RFQQJ173）；東北農(nóng)業(yè)大學(xué)博士啟動(dòng)基金項(xiàng)目（2010RCB72）；東北農(nóng)業(yè)大學(xué)大豆生物學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開(kāi)放基金項(xiàng)目（SB12B03）

王浩（1980-），女，助理研究員，博士，研究方向?yàn)樯锕痰巴寥牢⑸飳W(xué)。E-mail:21066849@qq.com

*通訊作者：王紹東，副研究員，研究方向?yàn)榇蠖褂N及品質(zhì)改良。E-mail:wsdhlj@aliyun.com