任曉峰，鄒昊，孫雪嬌

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，哈爾濱 150030）

豬傳染性胃腸炎病毒M蛋白的表達(dá)與抗體制備

任曉峰，鄒昊，孫雪嬌

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，哈爾濱 150030）

文章表達(dá)豬傳染性胃腸炎病毒TGEV M基因，制備抗M蛋白多克隆抗體。擴(kuò)增的M基因經(jīng)Bam H I和Eco R I雙酶切后克隆到原核表達(dá)載體PGEX-6P-1上，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒PGEX-6P-1-TGEV-M，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，獲得以包含體形式表達(dá)的重組蛋白。將重組蛋白作為免疫原免疫大白兔制備兔抗TGEV-M抗體，進(jìn)行效價(jià)測定及生物活性檢測。結(jié)果表明，多抗效價(jià)達(dá)1:262 144；間接ELISA和間接免疫熒光試驗(yàn)說明，此多抗可與TGEV-M重組蛋白及TGEV發(fā)生抗原抗體反應(yīng)。此多抗可作為鑒別診斷試劑將TGEV從眾多豬源病毒中區(qū)分出來。

豬傳染性胃腸炎病毒；原核表達(dá)；抗體制備；鑒別診斷

豬傳染性胃腸炎（Porcine transmissible gastro?enteritis）是一種豬高度接觸性傳染性疾病，可導(dǎo)致哺乳仔豬100%致死率[1]。臨床癥狀包括急性腹瀉、嘔吐和脫水[2]。雖然不同年齡和不同品種豬對本病都易感，但豬5周齡以上很少死亡，多成僵豬，飼料報(bào)酬低[3]。病毒包含四個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白：刺突蛋白（S）、小囊膜蛋白（SM/E）、膜蛋白（M）、和核衣殼蛋白（N）[4]。其中S蛋白是一種大的貫穿細(xì)胞膜表面糖蛋白，對誘導(dǎo)病毒中和抗體起重要作用。N蛋白與基因組RNA一起形成病毒核衣殼。SM蛋白調(diào)節(jié)病毒粒子的組裝和釋放[5]。M蛋白是冠狀病毒中含量最豐富的成分[6]，在病毒顆粒構(gòu)建中起重要作用，在病毒裝配期間將核衣殼連接到囊膜上，影響病毒變異。M蛋白在誘導(dǎo)先天性免疫以及產(chǎn)生干擾素方面起到關(guān)鍵性作用[7]。國內(nèi)外專家已對TGEV的M蛋白做過較多研究，喬薪瑗等制備過M蛋白單抗[8]，可成功應(yīng)用在TGEV鑒別診斷試驗(yàn)中。張小波等也針對TGEV M蛋白制備過多克隆抗體[9]。但由于本試驗(yàn)所用毒株是已分離成功毒株，對M基因測序后，發(fā)現(xiàn)其與已發(fā)表的基因序列有一定差異，因此研究此M蛋白制備的多抗免疫反應(yīng)及識(shí)別特性。文章將已有的PGEX-6P-1-TGEV-M陽性質(zhì)粒誘導(dǎo)表達(dá)成蛋白，質(zhì)粒中M片段來自之前分離的毒株，將蛋白作為抗原免疫大白兔，制備抗TGEV-M多克隆抗體，并將此多克隆抗體作為鑒別診斷試劑，將TGEV從七種豬源病毒中區(qū)分出來。

1 材料與方法

1.1 材料

豬傳染性胃腸炎病毒（TGEV）（PUR46-MAD毒株），豬睪丸細(xì)胞（ST），東北農(nóng)業(yè)大學(xué)分子病原學(xué)與公共衛(wèi)生實(shí)驗(yàn)室保存PGEX-6p-1-TGEV-M陽性質(zhì)粒，其中M基因大小從52～789 bp，E.coli rossta感受態(tài)細(xì)胞，IPTG誘導(dǎo)劑，山羊抗兔HRP-IgG，購自Solarbio公司；新西蘭大白兔，體重2 kg，雌性，購自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。

1.2 重組TGEV-M蛋白表達(dá)與純化

將PGEX-6P-1-TGEV-M轉(zhuǎn)化E.coli rossta感受態(tài)細(xì)胞，并涂抹于LB板上，待形成菌落后，挑取單克隆菌落進(jìn)行活化，加入終濃度為0.5 mmol·mL-1IPTG在37℃條件下誘導(dǎo)表達(dá)。每隔1 h取1 mL誘導(dǎo)菌液，共6 h。將收集的菌液在4℃、12 000 r·min-1條件下離心5 min收集沉淀。沉淀用30 μL PBS懸起后加入等量的2×SDS凝膠上樣緩沖液，煮沸10 min，用于SDS-PAGE電泳分析。將誘導(dǎo)表達(dá)5 h的菌液超聲破碎處理后對包涵體形式表達(dá)的重組蛋白進(jìn)行切膠純化。以NANODROP 2000儀器測定蛋白含量。對純化的蛋白進(jìn)行復(fù)性，復(fù)性過程采用透析方法進(jìn)行，具體操作步驟參照文獻(xiàn)[8]。

1.3 重組蛋白Western Blot鑒定分析

將誘導(dǎo)5 h的重組TGEV-M蛋白和未誘導(dǎo)的蛋白以及PGEX-6P-1空載體進(jìn)行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜上，用5%脫脂乳37℃封閉3 h，以兔抗TGEV全病毒多抗（1∶300稀釋）為一抗，室溫孵育1 h，以HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG（1∶1 000稀釋）為二抗，室溫孵育50 min，DAB避光顯色。

1.4 兔抗重組TGEV-M蛋白多克隆抗體的制備

取復(fù)性后的重組TGEV-M蛋白作為免疫原，調(diào)整蛋白濃度為2 mg·mL-1[9]。取1 mL蛋白與等量弗氏完全佐劑充分乳化，對大白兔背部皮下進(jìn)行多點(diǎn)注射免疫。2周后，調(diào)整蛋白濃度為1 mg·mL-1，取1 mL蛋白與等量弗氏不完全佐劑充分乳化經(jīng)皮下多點(diǎn)注射進(jìn)行加強(qiáng)免疫，以后每隔7 d加強(qiáng)免疫一次，共4次[10-12]。最后一次免疫后5 d，頸動(dòng)脈無菌取血，血液置于37℃溫箱放置2 h后，置于4℃過夜，次日無菌收集血清，分裝保存。

1.5 ELISA試驗(yàn)測定多抗效價(jià)

將純化重組TGEV-M蛋白作為抗原包被ELISA板，5%脫脂乳封閉后加入2倍倍比稀釋的兔抗血清，洗滌后加入HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG，同時(shí)設(shè)有陰性血清對照組，OPD顯色，測定OD490nm處讀數(shù)。

1.6 間接免疫熒光試驗(yàn)和Western Blot試驗(yàn)檢測多抗特異性

將ST細(xì)胞接種于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，試驗(yàn)組孵育100 TCID50的TGEV 37℃48 h，同時(shí)設(shè)定細(xì)胞對照組。加入1∶300待檢多抗孵育1 h，洗滌后再加入1∶500 FITC標(biāo)記的山羊抗兔二抗孵育50 min，在熒光顯微鏡下觀察。

將純化后M蛋白與空載體標(biāo)簽蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜上，進(jìn)行Western Blot，方法同1.3。

1.7 多克隆抗體鑒別診斷試驗(yàn)

將豬傳染性胃腸炎病毒[TGEV（1）、TGEV（2）]、其中TGEV（1）的M基因序列與已發(fā)表的序列同源性很高、而TGEV（2）的M基因序列與已發(fā)表的序列有一定差異性。豬流行性腹瀉病毒（PEDV）、豬呼吸與繁殖障礙綜合征病毒（PRRSV）、豬細(xì)小病毒（PPV）、豬圓環(huán)病毒（PCV）、豬輪狀病毒（PRV）和豬偽狂犬病病毒（PrV）作為抗原包被ELSIA板子，每孔5 μg，4℃過夜，棄去上清后用5%脫脂乳封閉37℃封閉2 h，清洗過后孵育1∶300稀釋的多克隆抗體，37℃1 h，清洗后孵育1∶1 000稀釋的HRP山羊抗兔二抗，37℃50 min，OD490nm顯色。同時(shí)用兔陰性血清作為陰性對照組。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組質(zhì)粒誘導(dǎo)表達(dá)

將重組的PGEX-6P-1-TGEV-M菌液在37℃條件下經(jīng)0.5 mmol·mL-1的IPTG誘導(dǎo)，每小時(shí)取1 mL菌液作為樣本，結(jié)果顯示在誘導(dǎo)5 h時(shí)，蛋白表達(dá)量達(dá)到最大，所以將誘導(dǎo)5 h的菌液進(jìn)行超生破碎，離心后取沉淀，用PBS懸起后加入等量的2× SDS混合后煮沸。經(jīng)SDS-PAGE分析證明重組TGEV-M蛋白獲得表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物大小為55 ku（見圖1～2），與預(yù)期的目的蛋白大小一致。Western Blot證實(shí)該蛋白可與抗TGEV全病毒多抗血清發(fā)生特異性反應(yīng)（見圖3）。

2.2 測定多抗血清效價(jià)及特異性鑒定

用重組TGEV-M蛋白檢測多抗血清效價(jià)，以健康未進(jìn)行任何免疫的大白兔血清為陰性對照。以陽性值/陰性值＞2作為判斷標(biāo)準(zhǔn)，ELISA數(shù)據(jù)（OD490nm）顯示，抗體效價(jià)達(dá)1∶262 144（見圖4）。表明重組TGEV-M蛋白具有良好的免疫學(xué)活性。間接免疫熒光試驗(yàn)和Western Blot試驗(yàn)證明此多抗能夠特異性結(jié)合TGEV而與細(xì)胞對照無反應(yīng)（見圖5～6）。

圖1 原核表達(dá)TGEV-M蛋白SDS-PAGE的結(jié)果Fig.1 Result of prokaryotic expression of TGEV-M protein

圖2 蛋白純化前后的SDS-PAGEFig.2 Result of M protein before and after purification

圖3 Western-Blot檢測重組蛋白與TGEV全病毒多抗的特異性反應(yīng)Fig.3 Western-Blot analysis the specific reaction between rTGEV-M protein and whole virus antibody

圖4 抗TGEV-M蛋白抗體效價(jià)分析Fig.4 Antibody titer of antibody against rTGEV-M

圖5 間接免疫熒光試驗(yàn)檢測多抗對病毒的特異性Fig.5 Indirect immunofluorescence assay detect specific interactions between polyclonal antibody and virus

圖6 Western Blot檢測抗體的特異性Fig.6 Detecting the specificity of the antibody by Western Blot

2.3 多抗的鑒別診斷結(jié)果

1∶300的TGEV M多抗可以與TGEV（1）和TGEV（2）特異性結(jié)合，而與其他豬源病毒沒有結(jié)合活性，以陽性值/陰性值大于2作為判斷標(biāo)準(zhǔn)。結(jié)果見圖7。

圖7 多抗的鑒別診斷結(jié)果Fig.7 Result of differential diagnosis of polyclonal antibody

3 討論與結(jié)論

TGEV屬于冠狀病毒科冠狀病毒屬，基因組為不分節(jié)段的單股正鏈RNA，大小為28.6 kb，5′有帽子結(jié)構(gòu)，3′有poly A結(jié)構(gòu)[5]。M蛋白的分子質(zhì)量為28～31 ku，M基因全長789 bp，約含262個(gè)氨基酸，其羧基端暴露在病毒粒子的表面，是病毒的免疫顯性區(qū)，針對此區(qū)域的抗體可中和TGEV和介導(dǎo)TGEV感染的細(xì)胞發(fā)生補(bǔ)體溶解反應(yīng)[13]。M蛋白的氨基端6～22殘基區(qū)存在一干擾素基因決定簇，可在體內(nèi)外誘導(dǎo)α-干擾素的產(chǎn)生[14]。由于M基因上非常保守，為M基因作為豬傳染性胃腸炎病毒分子生物學(xué)診斷侯選基因提供理論依據(jù)。本試驗(yàn)所用的M基因雖然與已發(fā)表基因序列有一定差異，但并未影響M蛋白免疫反應(yīng)性，而且制備多抗仍具有鑒別診斷能力，能夠?qū)⑼葱杂胁町怲GEV從眾多豬源病毒中區(qū)分出來。由于大腸埃希氏菌表達(dá)系統(tǒng)具有生長周期短、外源蛋白表達(dá)量高、價(jià)格低廉等特點(diǎn)[15]，本文采用pGEX-6P-1實(shí)現(xiàn)TGEV M蛋白基因的高效表達(dá)。PGEX-6P-1為大腸埃希氏菌融合表達(dá)載體，帶有強(qiáng)tac啟動(dòng)子，是表達(dá)谷胱苷肽巰基轉(zhuǎn)移酶（GST）高效表達(dá)載體，GST有助于表達(dá)蛋白正確立體構(gòu)象，有助于可溶性蛋白表達(dá)，TGEV的M基因連接在GST下游，目的蛋白得到高效表達(dá)，表達(dá)量占菌體總蛋白21.6%[16]。原核表達(dá)系統(tǒng)沒有翻譯后的糖基化修飾過程，TGEV M蛋白是糖基化的膜蛋白，為驗(yàn)證M蛋白未糖基化是否影響其生物學(xué)活性，進(jìn)行Western Blot分析。結(jié)果表明，表達(dá)融合蛋白能與TGEV全病毒多抗發(fā)生特異性反應(yīng)，TGEV的M蛋白未糖基化不影響其免疫原性，表達(dá)融合蛋白具有與天然M蛋白一樣的生物學(xué)活性。

本試驗(yàn)利用基因重組技術(shù)，通過PGEX-6P-1原核表達(dá)載體，在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)建立高效表達(dá)重組TGEV-M蛋白原核表達(dá)體系，獲得大量重組TGEV-M蛋白，為TGEV功能研究提供重要試驗(yàn)材料。將經(jīng)過變性，純化，復(fù)性的重組TGEV-M蛋白作為免疫原，皮下多點(diǎn)注射免疫新西蘭大白兔，成功制備兔抗重組TGEV-M抗體血清。檢測抗體效價(jià)可達(dá)1：262 144。Western Blot顯示原核表達(dá)重組蛋白能與TGEV全病毒多抗血清發(fā)生特異性反應(yīng)。說明重組蛋白具有較好生物活性。間接免疫熒光試驗(yàn)證明，此多抗能夠與TGEV有較強(qiáng)特異性反應(yīng)。經(jīng)初步驗(yàn)證其效價(jià)高，特異性好，可為建立新的TGEV檢測方法及深入研究M蛋白功能奠定基礎(chǔ)。

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Expression and polyclonal antibodies preparation of porcine transmis?sible gastroenteritis virus M protein

REN Xiaofeng,ZOU Hao,SUN Xuejiao
(School of Veterinary Medicine,NortheastAgricultural University,Harbin 150030,China)

The aim of this study was to expressMgene of porcine transmissible gastroenteritis virus (TGEV)as well as preparation of its specific polyclonal antibodies.The amplifiedMgene was inserted into theBamH I-EcoR I site of a prokaryotic expression vector PGEX-6P-1,resulting in a recombinant plasmid PGEX-6P-1-TGEV-M followed by expression inE.colirossta.The recombinant protein was expressed in the form of inclusion bodies,which was purified and used as immunogen to generate rabbit anti-M polyclonal antibody.Indirect ELISA analysis showed that the titer of the polyclonal antibody was approximately 1∶262 144.Indect immunofluorescence showed that the polyclonal antibody could specifically bind to TGEV.The antibody could be used as a differential diadnosis reagents,distinguished TGEV from many other pig source virus.

TGEV;prokaryotic expression;antibody perparation;differential diagnosis

S853

A

1005-9369（2014）04-0083-05

2013-03-08

教育部新世紀(jì)優(yōu)秀人才基金資助項(xiàng)目（NCET-10-0144）；教育部科技研究重點(diǎn)項(xiàng)目（212038）；黑龍江省普通高等學(xué)校長江學(xué)者后備支持計(jì)劃；教育部高等學(xué)校博士學(xué)科點(diǎn)專項(xiàng)科研基金（博導(dǎo)類）（20122325110019）；哈爾濱市科技創(chuàng)新人才研究專項(xiàng)資金項(xiàng)目（RC2012XK002003）

任曉峰（1974-），男，教授，博士，博士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)轭A(yù)防獸醫(yī)學(xué)與分子病毒學(xué)。E-mail：rxfemail@yahoo.com.cn

時(shí)間2014-4-21 13:25:02[URL]http://www.cnki.net/kcms/detail/23.1391.S.20140421.1325.030.html

任曉峰,鄒昊,孫雪嬌.豬傳染性胃腸炎病毒M蛋白的表達(dá)與抗體制備[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2014,45(4)∶83-87.

Ren Xiaofeng,Zou Hao,Sun Xuejiao.Expression and polyclonal antibodies preparation of porcine transmissible gastroenteritis virus M protein[J].Journal of Northeast Agricultural University,2014,45(4)∶83-87.(in Chinese with English abstract)