蒙蘭青，陸婉杏，黃建敏，黃曉華，黃清，袁勝山

（右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，廣西 百色 533000 E－mail：menglanqing＠sina.com）

2008年中國(guó)第三次死因回顧抽樣調(diào)查資料表明，腦卒中已上升為中國(guó)的首位死因，幸存者中殘疾率高達(dá)75%［1］。腦卒中中缺血性卒中占60%～80%，缺血性腦損傷機(jī)制繁多復(fù)雜又相互聯(lián)系，腦缺血不僅導(dǎo)致腦神經(jīng)元損傷，而且還損傷膠質(zhì)細(xì)胞和作為供給膠質(zhì)細(xì)胞、神經(jīng)元氧和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的微血管，即神經(jīng)血管單元 （neurovascular unit，NVU）的均受損［2］。我們前期研究和目前的研究已發(fā)現(xiàn)三七總皂苷具有抑制腦卒中后的細(xì)胞凋亡、腦水腫和炎癥反應(yīng)等多種作用。但是三七總皂苷對(duì)腦缺血后NVU 的影響目前報(bào)道較少。因此，我們基于NVU 整體概念，觀察三七總皂苷對(duì)腦缺血后神經(jīng)元、膠質(zhì)細(xì)胞、微血管的影響，進(jìn)一步探討其在腦缺血中的作用特點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 Wistar大鼠60只，體重 （240±20）g，清潔級(jí)，購(gòu)自右江民族醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.1.2 藥物與試劑 三七總皂苷 （血塞通注射液，昆明興中制藥有限公司，批號(hào)：20051102），小鼠抗大鼠NeuN 單克隆抗體和兔抗鼠GFAP 多克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Millipore公司，兔抗鼠Laminin多克隆抗體購(gòu)自英國(guó)Abcam 公司。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物分組與造模 所有大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組 （20只），假手術(shù)組 （20只）和三七總皂苷組 （20只），每個(gè)組又按手術(shù)后24h、7d分為2個(gè)亞組，每個(gè)亞組大鼠10只。參照Longa等［3］大鼠大腦中動(dòng)脈缺血模型的造模方法。大鼠以10%水合氯醛 （350mg／kg）腹腔注射麻醉，頸正中切開逐層分離暴露右頸總動(dòng)脈大、頸外動(dòng)脈，線栓沿頸總動(dòng)脈經(jīng)頸內(nèi)動(dòng)脈入顱阻斷大腦中動(dòng)脈，遇到阻力即停止，從頸總動(dòng)脈分叉處計(jì)算插入深度 （18±2）mm，假手術(shù)組插入深度小于10 mm。阻斷2h后拔出線栓造成再灌注。手術(shù)后2h采用Longa等［3］神經(jīng)功能缺損評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)對(duì)造模情況進(jìn)行評(píng)價(jià) （具體見下的評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)），1～3分為造模成功，及時(shí)差額補(bǔ)充保證每組的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物例數(shù)。

1.2.2 造模后的干預(yù)措施 大鼠成功造模后，立即給三七總皂苷組大鼠腹腔注射三七總皂苷 （血塞通注射液，昆明興中制藥有限公司，批號(hào)：20051102）30mg·kg－1，以后每日一次直至相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)。對(duì)照組在相同時(shí)間內(nèi)腹腔注射同體積的生理鹽水。假手術(shù)組未做任何干預(yù)。

1.2.3 指標(biāo)檢測(cè)

1.2.3.1 神經(jīng)功能缺損評(píng)定 在再灌注后2h、24h和7 d采用Longa等［3］的神經(jīng)功能缺損評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行肢體功能評(píng)估，即0分，無神經(jīng)功能缺損癥狀；1分，大鼠提尾倒掛時(shí)，病灶左側(cè)前肢呈屈曲、不能伸展；2 分，向左側(cè)轉(zhuǎn)圈；3 分，向左側(cè)跌倒的征象，即行走困難并向右側(cè)傾倒；4分，不能自發(fā)行走，意識(shí)水平呈下降狀態(tài)。

1.2.3.2 NVU 相關(guān)指標(biāo)檢測(cè) 在時(shí)間點(diǎn)24h和7d對(duì)各亞組大鼠用10%水合氯醛 （350 mg／kg）腹腔注射麻醉后，先后以生理鹽水及4%多聚甲醛磷酸鹽緩沖液經(jīng)心臟灌注固定，斷頭取腦，腦組織置于冰凍切片機(jī)上做冰凍切片，片厚8 μm。每只大鼠取含缺血灶的3張腦片 （假手術(shù)組則為相對(duì)應(yīng)區(qū)域）用于檢測(cè)層黏連蛋白 （Laminin）、膠質(zhì)纖維酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）、神經(jīng)元核抗原 （neuronal nuclei，NeuN）的表達(dá)，免疫組織化學(xué)染色采用SP 法，具體方法按試劑盒說明書進(jìn)行。每張腦片選取5個(gè)不同的高倍視野鏡 （×400），計(jì)算單位面積內(nèi)的陽(yáng)性細(xì)胞 （棕黃色）數(shù)，取其均數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 神經(jīng)功能缺損情況 再灌注后2h，三七總皂苷組和對(duì)照組大鼠神經(jīng)功能評(píng)分差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P ＞0.05），假手術(shù)組不出現(xiàn)神經(jīng)功能缺損。再灌注后24h，三七總皂苷組和對(duì)照組大鼠神經(jīng)功能缺損均比再灌注后2h加重，兩組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P ＞0.05）。再灌后7d，三七總皂苷組和對(duì)照組大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分均有改善，但三七總皂苷組大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分改善比對(duì)照組明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P ＜0.05）。假手術(shù)組大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分均為0。見表1。

表1 三組大鼠再灌注后不同時(shí)間點(diǎn)神經(jīng)功能缺損情況比較 （±s，分）

表1 三組大鼠再灌注后不同時(shí)間點(diǎn)神經(jīng)功能缺損情況比較 （±s，分）

注：與對(duì)照組比較，a：P ＜0.05

組別 n 2h 24h 7d三七總皂苷組 20 1.82±0.23 2.23±0.35 0.84±0.12 a對(duì)照組 20 1.95±0.25 2.17±0.19 1.48±0.19 20 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00假手術(shù)組

2.2 再灌注后不同時(shí)間點(diǎn)NVU 指標(biāo)表達(dá)情況 再灌注后24h，三七總皂苷組和對(duì)照組大鼠腦組織出現(xiàn)NeuN、GFAP和Laminin的蛋白表達(dá)，三七總皂苷組比對(duì)照組稍增多，但兩組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P ＞0.05）。再灌注后7d，對(duì)照組大鼠腦組織NeuN、GFAP和Laminin的蛋白增多；而三七總皂苷組大鼠腦組織NeuN、GFAP和Laminin的蛋白表達(dá)明顯增多，與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P ＜0.05或P ＜0.01）；假手術(shù)組大鼠腦組織NeuN、GFAP和Laminin蛋白表達(dá)無明顯變化。見表2、圖1。

3 討論

近年來隨著對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)微觀結(jié)構(gòu)和功能認(rèn)識(shí)的深入，人們發(fā)現(xiàn)神經(jīng)元、膠質(zhì)細(xì)胞和微血管在腦組織發(fā)育的過程中相互調(diào)節(jié)、相互作用，關(guān)系密切，即血管系統(tǒng)為腦細(xì)胞 （神經(jīng)元、膠質(zhì)細(xì)胞）提供氧氣、葡萄糖和各種激素，并引導(dǎo)細(xì)胞對(duì)局部環(huán)境做出恰當(dāng)?shù)膽?yīng)答，腦細(xì)胞調(diào)節(jié)血管的功能以適應(yīng)局部的需求，膠質(zhì)細(xì)胞參與神經(jīng)元的營(yíng)養(yǎng)、支持及電生理活動(dòng)的調(diào)節(jié)。在病理過程如腦卒中發(fā)生后，這3種成分也互相影響［4－5］。于是，2003年亞裔美國(guó)科學(xué)家Lo提出了NVU的概念，此概念的提出旨在強(qiáng)調(diào)神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞和血管之間相互聯(lián)系及相互作用的重要性。可以認(rèn)為由微血管、微血管周圍的星形細(xì)胞突起及由這些突起所支持的神經(jīng)元以及其軸突共同組成的NVU 是中樞神經(jīng)系統(tǒng)基本結(jié)構(gòu)和功能單位。NeuN 為表達(dá)在神經(jīng)系統(tǒng)大多數(shù)神經(jīng)元胞核和胞漿中的特異性蛋白質(zhì)，是成熟神經(jīng)元的特異性標(biāo)志物［6］。GFAP 為星形膠質(zhì)細(xì)胞合成的重要骨架蛋白，是星形膠質(zhì)細(xì)胞的特征性標(biāo)記物［7］。Laminin與Ⅳ型膠原特定位點(diǎn)結(jié)合形成復(fù)雜立體結(jié)構(gòu)，維持著基底膜正常功能和穩(wěn)定結(jié)構(gòu)，對(duì)維持血腦屏障完整性和功能有重要作用，Laminin是檢測(cè)血管基底膜完整性的敏感指標(biāo)［8］。

表2 三組大鼠再灌注后不同時(shí)間點(diǎn)NVU 相關(guān)指標(biāo)表達(dá)情況比較 （±s）

表2 三組大鼠再灌注后不同時(shí)間點(diǎn)NVU 相關(guān)指標(biāo)表達(dá)情況比較 （±s）

注：再灌注后7d時(shí)，與對(duì)照組比較，a：P ＜0.05，b：P ＜0.01

組別24h NeuN （個(gè)） GFAP （個(gè)） Laminin （支）7d NeuN （個(gè)） GFAP （個(gè)） Laminin （支）三七總皂苷組 6.12±0.78 18.23±2.35 30.84±3.12 14.45±1.25a40.45±2.53a62.92±2.58 b對(duì)照組 5.65±0.55 16.87±2.19 27.48±2.19 10.91±0.95 31.19±2.25 40.95±2.25.45 37.55±2.15 58.95±3.05假手術(shù)組 10.34±1.59 38.39±1.98 60.25±2.30 11.32±1

圖1 再灌注后7d時(shí)，三七總皂苷組和對(duì)照組大鼠腦組織NeuN、GFAP和Laminin蛋白的表達(dá) （SP法×400）

NVU 與缺血性腦損傷的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切，缺血時(shí)不僅神經(jīng)元，而且膠質(zhì)細(xì)胞、神經(jīng)軸突和微血管均受到損傷，神經(jīng)元，膠質(zhì)細(xì)胞和血管內(nèi)皮之間的損傷存在相互促進(jìn)的關(guān)系，NVU 中任何組分的損傷都會(huì)波及其他組分［4］，這提示腦梗死的治療目標(biāo)應(yīng)從過單一的對(duì)神經(jīng)元保護(hù)，擴(kuò)展為對(duì)神經(jīng)血管單元各組分全面的保護(hù)。藥物治療的靶點(diǎn)也應(yīng)針對(duì)缺血損傷中神經(jīng)血管單元中的各種組成成分，進(jìn)行多途徑、多方位的治療。

研究已證實(shí)一些中成藥多具有多靶點(diǎn)、多途徑的作用特點(diǎn)。中成藥三七總皂苷目前已發(fā)現(xiàn)具有減輕腦梗死后的炎性反應(yīng)、血管內(nèi)皮的保護(hù)作用、促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞的增殖分化等多作用靶點(diǎn)［9－11］。三七總皂苷對(duì)缺血性腦損傷后NVU 影響的研究國(guó)內(nèi)外報(bào)道不多。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)缺血再灌注后24h，不管三七總皂苷組或?qū)φ战M大鼠腦組織均出現(xiàn)NeuN、GFAP和Laminin的蛋白表達(dá)，三七總皂苷組比對(duì)照組增多，但兩組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，對(duì)照組出現(xiàn)NeuN、GFAP和Laminin的蛋白表達(dá)是機(jī)體對(duì)缺血損傷自動(dòng)修復(fù)的表現(xiàn)，由于三七總皂苷對(duì)腦缺血的作用需要一個(gè)過程，故再灌注后24h時(shí)三七總皂苷組大鼠腦組織NeuN、GFAP和Lami－nin的蛋白表達(dá)與對(duì)照組相差不大。腦缺血時(shí)由于NVU 各組分均受損傷，所以再灌注后24h時(shí)，三七總皂苷組或?qū)φ战M大鼠腦組織NeuN、GFAP和Laminin的蛋白染色明顯比假手術(shù)組少。缺血再灌注后7d時(shí)，三七總皂苷組或?qū)φ战M大鼠腦組織NeuN、GFAP和Laminin的蛋白表達(dá)增多，與對(duì)照組比較，三七總皂苷組大鼠腦組織NeuN、GFAP和Laminin的蛋白表達(dá)明顯增多，神經(jīng)功能缺損評(píng)分也比對(duì)照組改善，研究結(jié)果提示三七總皂苷促進(jìn)腦缺血后NVU 組分神經(jīng)元、膠質(zhì)細(xì)胞和微血管的修復(fù)。本研究進(jìn)一步證實(shí)三七總皂苷在腦梗死中具有多靶點(diǎn)、多方位的治療作用，可同時(shí)作用于NVU 中的神經(jīng)元、膠質(zhì)細(xì)胞和微血管，其具體機(jī)制尚有待進(jìn)一步探討。

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