陳啟乾， 李 艷

(1. 貴陽中醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院藥劑科，貴州 貴陽550001;2. 貴州中醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院藥劑科，貴州貴陽550001)

華佗再造丸收載于《中國藥典》2010 年版一部［1］，由吳茱萸、川芎、冰片等藥味經(jīng)加工制成的濃縮水蜜丸，具有活血化癖、化痰通絡(luò)、行氣止痛之功效，用于痰瘀阻絡(luò)之中風(fēng)恢復(fù)期和后遺癥，癥見半身不遂、拘攣麻木、口眼歪斜、言語不清，臨床應(yīng)用廣泛，療效確切［2］。 《中國藥典》2010 年版僅收載有華佗再造丸的薄層鑒別和檢查項(xiàng)目，缺乏對(duì)處方主藥的含量測定項(xiàng)目［1］，未達(dá)到真正對(duì)華佗再造丸內(nèi)在質(zhì)量進(jìn)行全面控制的要求。通過查閱文獻(xiàn)［3-4］，目前也僅有采用高效液相色譜法測定華佗再造丸中阿魏酸、吳茱萸堿等單一成分的報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)采用UPLCMS/MS 建立了同時(shí)快速、高靈敏測定華佗再造丸中阿魏酸和吳茱萸堿的新方法，國內(nèi)外未見相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，為進(jìn)一步完善華佗再造丸的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

ACQUITYTM系統(tǒng)超高液相色譜-三重四級(jí)桿串聯(lián)質(zhì)譜儀(美國Waters 公司，包括二元梯度泵、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱、三重四級(jí)桿質(zhì)量分析器和Masslynx4.1 質(zhì)譜工作站);阿魏酸(批號(hào)110773-9910)和吳茱萸堿(批號(hào)110802-200504)對(duì)照品均購自中國藥品生物制品檢定所;華佗再造丸(市售品，廣州奇星藥業(yè)有限公司，規(guī)格80 g/瓶，批號(hào)見表2)。乙腈、甲酸為色譜純;水為純凈水;其他試劑均為分析純。陰性樣品自制。

2 方法與結(jié)果

2.1 分析條件 色譜條件 WATERS ACQUITY BEH Cl8色譜柱(2.1 mm×150 mm，1.7 μm);流動(dòng)相A 為乙腈，B為5 mmol/L 甲酸銨水溶液，梯度洗脫，0 ～6 min，流動(dòng)相A 5% ～35%;6 ～10 min，流動(dòng)相A 35% ～95%;體積流量為0.4 mL/min;柱溫為45 ℃;進(jìn)樣量為2 μL。

質(zhì)譜條件 電噴霧離子源(ESI);毛細(xì)管電壓4 KV，離子源溫度125 ℃，干燥氣溫度360 ℃，干燥氣體積流量900 L/h;停留時(shí)間(Dwell)0.2 s;CV:30 (阿魏酸)、26 (吳茱萸堿);Ce:25 (阿魏酸)、30 (吳茱萸堿);用于定量分析的離子對(duì)為m/z (-)193.2 →134.3 (阿魏酸)、m/z (+)304.1→287.9 (吳茱萸堿)。

2.2 供試品溶液及陰性對(duì)照溶液的制備 稱取本品10 g，粉碎，過二號(hào)篩，混勻，取1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25 mL，密塞，稱定質(zhì)量，超聲處理(功率250 W，頻率40 kHz)60 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，離心，取上清液用0.22 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。同法，制得缺川芎、吳茱萸的陰性對(duì)照溶液。

2.3 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取阿魏酸對(duì)照品10.2 mg和吳茱萸堿對(duì)照品12.5 mg，分別置于100 mL 量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，精密吸取上述對(duì)照品溶液各5 mL 置同一25 mL 量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，制成阿魏酸和吳茱萸堿質(zhì)量濃度分別為20.4 μg/mL 和25.0 μg/mL 的混合對(duì)照品溶液。

2.4 專屬性試驗(yàn) 取混合對(duì)照品溶液、陰性對(duì)照品溶液和供試品溶液，在上述分析條件下分別進(jìn)樣測定，結(jié)果見圖1 ～2。由圖可知，供試品溶液中被測定化合物與2 個(gè)對(duì)照品的保留時(shí)間相同。比較被測定成分和對(duì)照品的母離子、子離子質(zhì)譜圖，兩者一致，且陰性樣品對(duì)阿魏酸和吳茱萸堿的測定無干擾，樣品檢測介質(zhì)效應(yīng)考察結(jié)果不影響測定，表明本法專屬性良好。

圖1 對(duì)照品溶液(A)樣品溶液(B)陰性樣品溶液(C)色譜圖

圖2 被測成分阿魏酸(A)和吳茱萸堿(B)質(zhì)譜圖

2.5 線性關(guān)系考察 分別精密吸取上述混合對(duì)照品溶液，依次用甲醇逐級(jí)稀釋，制得6 個(gè)系列質(zhì)量濃度線性工作液，分別進(jìn)樣測定。以色譜峰峰面積(Y)為縱坐標(biāo)，以對(duì)照品質(zhì)量濃度(X)為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，阿魏酸和吳茱萸堿的線性回歸方程分別為:Y =4 934 909X -7 794，r =0.999 9;Y=7 287 380X-11 541，r=0.999 6;結(jié)果表明阿魏酸和吳茱萸堿質(zhì)量濃度分別在0.64 ～10.20 μg/mL 和0.79 ～25.00 μg/mL 范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.6 精密度試驗(yàn) 取混合對(duì)照品溶液重復(fù)進(jìn)樣6 次，測定峰面積。阿魏酸和吳茱萸堿峰面積的RSD (n = 6)為1.2%，0.8%。結(jié)果表明，儀器精密度良好。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取同一批華佗再造丸樣品(批號(hào)1125)，共6 份，按“供試品溶液”項(xiàng)下方法操作，在上述色譜條件下進(jìn)樣，阿魏酸和吳茱萸堿的平均含量(n =6)分別為0.083 mg/g 和0.152 mg/g;RSD (n =6)分別為1.7%和2.5%。結(jié)果表明，重復(fù)性良好。

2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一華佗再造丸供試品溶液，分別在0、1、2、4、8、12 h 進(jìn)樣分析，測得阿魏酸和吳茱萸堿峰面積的RSD (n=6)分別為2.2%和1.6%。結(jié)果表明供試品溶液在12 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.9 回收率試驗(yàn) 精密稱取6 份已知含有量的華佗再造丸樣品(批號(hào)1125)約0.5 g，分別精密加入8.64 μg/mL 阿魏酸和14.32 μg/mL 吳茱萸堿混合對(duì)照品溶液5 mL，按供試品溶液的制備方法制得供試品溶液，分別進(jìn)樣測定，計(jì)算回收率及RSD，結(jié)果見表1。

表1 回收率測定結(jié)果(n=6)

2.10 樣品測定 取3 批華佗再造丸，按照“2.2”項(xiàng)下處理后，精密吸取對(duì)照品溶液及供試品溶液各1 μL，依上述色譜質(zhì)譜條件測定，測定結(jié)果見表2。

表2 樣品測定結(jié)果(mg/丸)

3 討論

川芎是華佗再造丸方中主藥，阿魏酸為川芎的活性成分之一，具有抗血小板聚集，抑制血小板5-羥色胺釋放，鎮(zhèn)痛，緩解血管痙攣等作用［5］。吳茱萸堿是華佗再造丸處方中吳茱萸中的一種重要生物堿成分，具有舒張血管、鎮(zhèn)痛、利尿、抗菌、抗腫瘤等作用［6］。因此，本實(shí)驗(yàn)結(jié)合華佗再造丸處方主藥的化學(xué)成分及其藥理作用，選擇阿魏酸和吳茱萸堿作為其質(zhì)量控制指標(biāo)。

華佗再造丸為中藥復(fù)方制劑，處方藥味較多，成分復(fù)雜，且阿魏酸和吳茱萸堿在制劑中含量較低，在試驗(yàn)過程中曾采用HPLC 對(duì)其定量，結(jié)果不甚理想。液質(zhì)聯(lián)用分析技術(shù)由于專屬性強(qiáng)、靈敏度高，已經(jīng)越來越多的被應(yīng)用于中藥及其制劑的質(zhì)量控制研究中［7-8］。經(jīng)比較研究，本實(shí)驗(yàn)采用UPLC-MS/MS 法對(duì)華佗再造丸中阿魏酸和吳茱萸堿含量進(jìn)行同時(shí)測定，可最大限度地排除其它成分的干擾，簡化操作，提高測定精密度，測定結(jié)果準(zhǔn)確可靠，方法合理可行，可用于華佗再造丸的質(zhì)量控制。

［1］ 國家藥典委員會(huì). 中華人民共和國藥典:2010 年版一部［S］. 北京:中國醫(yī)藥科技出版社，2010:693.

［2］ 張經(jīng)華，郭愛玲. 華佗再造丸治療中風(fēng)病130 例療效觀察［J］. 廣東醫(yī)學(xué)，2009，30(2):296.

［3］ 彭中芳，朱柏華，劉聲波. 高效液相色譜法測定華佗再造丸中阿魏酸的含量［J］. 中藥材，2001，24(5):361-362.

［4］ 葉 鳴. 高效液相色譜法測定華佗再造丸中吳茱萸堿的含量［J］. 海峽藥學(xué)，2006，18(3):66-67.

［5］ 趙東平，楊文鈺，陳興福. 阿魏酸的研究進(jìn)展［J］. 時(shí)珍國醫(yī)國藥，2008，19(8):1839-1840.

［6］ 郭 惠，楊云云，王昌利. 吳茱萸堿藥理研究進(jìn)展［J］. 陜西中醫(yī)，2010，31(12):1685-1686.

［7］ 許玲玲，安 睿，王新宏. 液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)在中藥分析中的應(yīng)用［J］. 中成藥，2006，28(2):239-246.

［8］ 郝曉霞，靳元鵬，軋 霽. HPLC-DAD-MS/MS 用于養(yǎng)血清腦顆粒蒽醌類成分分析［J］. 中成藥，2012，34(1):66-70.