徐保利， 李先寬， 王 冰

(遼寧中醫(yī)藥大學(xué)，遼寧 大連116600)

錦燈籠為茄科植物酸漿Physalis alkekengi L.var. franchetii (Mast.)Makino 的干燥宿萼或帶果實(shí)的宿萼。秋季果實(shí)成熟、宿萼呈紅色或橙紅色時(shí)采收，干燥，具有解熱鎮(zhèn)痛、抗菌、強(qiáng)心、利尿及抗癌等作用［1］，其中黃酮類和酸漿苦素類成分在現(xiàn)在藥理研究中已被證明具有抗炎活性［2-3］?！吨袊?guó)藥典》2010 年版對(duì)錦燈籠藥材的質(zhì)量規(guī)定為本品按干燥品計(jì)算，含木犀草苷不得少于0.10%［4］。

近些年對(duì)錦燈籠的化學(xué)成分及質(zhì)量研究主要在錦燈籠的宿萼部分［5-7］，對(duì)其果實(shí)的研究較少［8］。中藥材化學(xué)成分復(fù)雜，目前對(duì)單一化學(xué)成分的測(cè)定并不能全面評(píng)價(jià)藥材質(zhì)量，對(duì)多種成分的同時(shí)測(cè)定可以較全面的評(píng)價(jià)中藥質(zhì)量［9-11］。因此本實(shí)驗(yàn)利用高效液相色譜法對(duì)錦燈籠果實(shí)中的5 種成分進(jìn)行了測(cè)定方法的研究，并對(duì)不同產(chǎn)地的錦燈籠果實(shí)進(jìn)行了測(cè)定，同時(shí)對(duì)所得結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，為今后錦燈籠的藥材的應(yīng)用，尤其是果實(shí)部位的應(yīng)用和質(zhì)量評(píng)價(jià)提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Agilent1100 HPLC (美國(guó)Agilent 公司);KQ3200B 型超聲清洗器(江蘇昆山)。

1.2 試劑 甲醇 (分析純，天津星月，批號(hào)20101126);甲醇 (HPLC 級(jí)，天津大茂，批號(hào)20101214);乙腈 (HPLC 級(jí)，天津大茂，批號(hào)20100326);磷酸(HPLC 級(jí)，天津科密歐，批號(hào)20100328);水為超純水。

1.3 對(duì)照品 木犀草苷(貴州迪大科技有限公司，批號(hào)20090928);木犀草素(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)111520-200504);酸漿苦素A、O由遼寧中醫(yī)藥大學(xué)許枬老師自制，酸漿苦素P 由遼寧中醫(yī)藥大學(xué)許亮老師自制，經(jīng)歸一化法檢測(cè)純度均大于98%。

1.4 藥材 采集及購(gòu)買于黑龍江、吉林、遼寧、山西、山東及安徽6 省共60 份，均經(jīng)遼寧中醫(yī)藥大學(xué)藥用植物教研室王冰教授鑒定為茄科酸漿屬植物酸漿的果實(shí)。

2 方法與結(jié)果

2.1 對(duì)照品溶液的制備 分別精密稱取對(duì)照品木樨草苷3.25 mg，木犀草素2.50 mg，酸漿苦素A 3.00 mg，酸漿苦素P 2.50 mg 和酸漿苦素O 4.50 mg，置于25 mL 量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，配成質(zhì)量濃度分別為130 、100、120 、100、180 μg/mL 的單一對(duì)照品貯備液。精密吸取上述對(duì)照品貯備液各1.0、1.0、1.0、1.0和5.0 mL，置10 mL 量瓶中，加甲醇稀釋至刻度搖勻，制成混合對(duì)照品溶液。

2.2 樣品制備 將干燥的錦燈籠果實(shí)粉碎成粉末過(guò)50 目篩，稱取1 g，精密稱定，置于50 mL 具塞錐形瓶中，加25 mL 甲醇，超聲1 h，濃縮定容至15 mL 量瓶中，備用。

2.3 色譜條件 Agilent TC-18 (4.6 mm×150 mm，5 μm);UV 檢測(cè)器;柱溫30 ℃;體積流量1.0 mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng)為350 nm (0 ～24 min)，220 nm (24 ～37 min);進(jìn)樣量20 μL;流動(dòng)相為0.2%磷酸 (A)-乙腈 (B)，梯度洗脫 (0 ～13 min，20%→23%B;13 ～37 min，23%→31%B)。色譜圖見圖1。

圖1 混合對(duì)照品(A)及供試品(B)HPLC 圖譜Fig.1 HPLC chromatograms of reference substances (A)and samples (B)

2.4 線性關(guān)系考察 分別將木犀草苷、木犀草素、酸漿苦素A、P 和O 用甲醇配置成一定濃度的對(duì)照品溶液，見表1。分別精密吸取4、8、12、16、20 μL按“2.2”項(xiàng)色譜條件檢測(cè)，記錄峰面積，以對(duì)照品量為橫坐標(biāo) (X)，峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程見表1。

表1 線性關(guān)系考察結(jié)果Tab.1 Calibration curve and linear range

2.5 精密度考察 精密量取木犀草苷、木犀草素、酸漿苦素A、P 和O 的混合對(duì)照品溶液20 μL，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件重復(fù)進(jìn)樣6 次，記錄峰面積，RSD 分別為0.9%、1.2%、0.8%、0.8%、1.1%。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn) 取干燥錦燈籠果實(shí)樣品1.0 g，共6 份，精密稱定，按“2.1”項(xiàng)下制備方法進(jìn)行制備，按上述色譜條件進(jìn)行HPLC 分析。根據(jù)所得5 種成分的峰面積計(jì)算其在樣品中的量。結(jié)果果實(shí)中木犀草苷、木犀草素、酸漿苦素A、P 和O 的RSD 值分別為1.3%、1.1%、1.0%、1.2% 和0.9%。試驗(yàn)表明，該方法重復(fù)性良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液，分別在0、2、4、6、8、10 h 進(jìn)樣20 μL，記錄峰面積，測(cè)得樣品中木犀草苷、木犀草素、酸漿苦素A、P 和O的RSD 值分別為1.1%、1.0%、1.3%、1.0%和1.3%。試驗(yàn)表明，樣品中木犀草苷、木犀草素、酸漿苦素A、P 和O 在10 h 內(nèi)穩(wěn)定。

2.8 加樣回收率考察 稱取遼寧省鐵嶺市西豐縣尚文村柳河屯樣品1 g，精密稱定，平行6 份，每份分別精密加入木犀草苷1.40 μg/mL、木犀草素10 μg/mL、酸漿苦素A 50 μg/mL、酸漿苦素P 5 μg/mL、酸漿苦素O 18 μg/mL 各1 mL，按“2.1”項(xiàng)下制備方法進(jìn)行制備，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，分別測(cè)定，結(jié)果見表2。

表2 回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=6)Tab.2 Results of recovery tests (n=6)

2.9 統(tǒng)計(jì)分析 利用SPSS 18.0 軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行K-均值聚類分析，K-均值聚類分析算法首先隨機(jī)從數(shù)據(jù)集中選取K 個(gè)點(diǎn)作為初始聚類中心，然后計(jì)算各個(gè)樣本到聚類中的距離，把樣本歸到離它最近的那個(gè)聚類中心所在的類。計(jì)算新形成的每一個(gè)聚類的數(shù)據(jù)對(duì)象的平均值來(lái)得到新的聚類中心，如果相鄰兩次的聚類中心沒有任何變化，說(shuō)明樣本調(diào)整結(jié)束，聚類準(zhǔn)則函數(shù)已經(jīng)收斂。

2.10 結(jié)果 按照“2.1”項(xiàng)下對(duì)不同產(chǎn)地及來(lái)源地的錦燈籠果實(shí)進(jìn)行制備，并按照“2.2”項(xiàng)下進(jìn)行檢測(cè)，其結(jié)果見表3。

3 結(jié)論

3.1 在190 ～400 nm 波長(zhǎng)范圍內(nèi)，對(duì)木犀草苷、木犀草素、酸漿苦素A、P 和O 單獨(dú)對(duì)照液和混合對(duì)照液進(jìn)行波長(zhǎng)掃描，發(fā)現(xiàn)木犀草苷、木犀草素在220 nm 和350 nm 處有較好吸收，而酸漿苦素A、P 和O 在220 nm 處有較好吸收，但木犀草苷和木犀草素在220 nm 處的干擾峰較多，因此本研究采用切換波長(zhǎng)的方法對(duì)錦燈籠藥材的5 種成分進(jìn)行檢測(cè)。本研究采用了多種流動(dòng)相，最終確定以0.2%磷酸水-乙腈為流動(dòng)相，加入磷酸水使基線平穩(wěn)，樣品峰與其他峰能達(dá)到基線分離。

3.2 錦燈籠果實(shí)中的木犀草素、酸漿苦素P 和O的量過(guò)低，在絕大多數(shù)樣品中無(wú)法檢測(cè)，因此在做方法學(xué)考察時(shí)，利用其對(duì)照品的混合溶液進(jìn)行，并對(duì)錦燈籠果實(shí)樣品中的木犀草苷和酸漿苦素A 進(jìn)行考察。

表3 不同產(chǎn)地錦燈籠果實(shí)化學(xué)成分測(cè)定及分級(jí)結(jié)果(μg/g)Tab.3 Results of chemical composition determination and classification for Physalis calyx seu Fructus from different growing areas (μg/g)

續(xù)表3

3.3 借鑒前期對(duì)錦燈籠宿萼有效成分測(cè)定的結(jié)果［12］，錦燈籠果實(shí)中木犀草苷、木犀草素、酸漿苦素A、O 和P 的量要遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于錦燈籠宿萼中的量，而《中國(guó)藥典》2010 年版規(guī)定錦燈籠藥材為酸漿成熟的宿萼或帶果實(shí)的宿萼，由于其果實(shí)為漿果且富含糖類，易招蟲蛀，不宜干燥，因此不建議將錦燈籠的藥用部位定位為果實(shí)，僅保留宿萼部分。

3.4 錦燈籠果實(shí)在實(shí)際應(yīng)用中并無(wú)分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，因此本實(shí)驗(yàn)利用不同產(chǎn)地錦燈籠果實(shí)HPLC 檢測(cè)所得的結(jié)果對(duì)錦燈籠果實(shí)進(jìn)行質(zhì)量分級(jí)處理。因?yàn)殄\燈籠果實(shí)中的木犀草素、酸漿苦素P 和O 含有量過(guò)低，在絕大多數(shù)樣品中無(wú)法檢測(cè)，所以將木犀草苷、酸漿苦素A 及木犀草苷、木犀草素、酸漿苦素A、P 和O 總量定為錦燈籠果實(shí)的分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，利用SPSS 18.0 統(tǒng)計(jì)軟件采用K-均值聚類分析方法，暫定為3 級(jí)，見表4 和表5。由表6 的方差分析結(jié)果可以看出木犀草苷、酸漿苦素A 及總量均達(dá)到了極顯著水平，因此三者均可作為錦燈籠果實(shí)分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)的指標(biāo)。以酸漿苦素A 作為分級(jí)指標(biāo)，對(duì)所有樣品進(jìn)行分級(jí)處理，結(jié)果見表3，以酸漿苦素A作為分級(jí)指標(biāo)，其對(duì)于錦燈籠果實(shí)的專屬性更強(qiáng)，更能從藥材基源及質(zhì)量方面反映錦燈籠果實(shí)的藥材質(zhì)量。

表4 K-均值聚類分析的最終類中心值(μg/g)Tab.4 Final center value for K-means clustering analysis(μg/g)

表5 錦燈籠果實(shí)分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)(μg/g)Tab.5 Physalis calyx seu Fructus classification standard(μg/g)

表6 錦燈籠果實(shí)分級(jí)指標(biāo)的方差分析結(jié)果Tab.6 Results of index variance for the Physalis calyx seu Fructus grading

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