牟英迪， 黃寶群， 蓋 成， 林吉茂

(1. 濟(jì)南市食品藥品檢驗(yàn)檢測中心，山東 濟(jì)南250001;2. 山東電力中心醫(yī)院，山東 濟(jì)南250001;3. 山東大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院，山東濟(jì)南250100)

有效成分的定量分析是現(xiàn)代藥學(xué)研究和藥物質(zhì)量控制領(lǐng)域的重要研究方向之一，定量分析結(jié)果的可靠性直接決定了藥物的安全性和有效性［1］。測量不確定度是與測量結(jié)果相關(guān)聯(lián)的一個(gè)參數(shù)，用以表征合理地賦予被測量之值的分散性［2］。測量不確定度在分析化學(xué)包括藥物檢測領(lǐng)域得到了深入的研究和廣泛的應(yīng)用［3-8］。一份完整的檢測報(bào)告中，應(yīng)該包含不確定度的評定報(bào)告，通過有限次數(shù)測量，以及經(jīng)驗(yàn)、資料等信息實(shí)現(xiàn)可操作性，是經(jīng)典誤差理論的發(fā)展和完善［9］。

羚羊感冒片收載于《中國藥典》2010 年版一部［10］，由羚羊角、牛蒡子、淡豆豉、金銀花、荊芥、連翹、淡竹葉、桔梗、薄荷油、甘草組方，具有清熱解表的功效，用于流行性感冒、發(fā)熱惡風(fēng)、頭痛頭暈、咳嗽、胸悶、咽喉腫痛等癥。檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)中在含量測定限下僅對牛蒡苷進(jìn)行測定。本實(shí)驗(yàn)采用程序可變波長HPLC 法，對羚羊感冒片中牛蒡苷、綠原酸、連翹苷與甘草酸銨的量進(jìn)行測定，并根據(jù)國家質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局發(fā)布的《測量不確定度評定和表示》 (JJF1059-1999)［11］和《Quantifying Uncertainty in Analytical Measurement》［12］，對檢測結(jié)果的可靠性進(jìn)行評估，為評價(jià)分析方法、評定試驗(yàn)室及分析測試人員的技術(shù)水平和準(zhǔn)確判斷羚羊感冒片質(zhì)量提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Agilent1200 高效液相色譜儀;UV-2550型紫外-可見分光光度計(jì)(日本島津公司);梅特勒AE-240 型電子分析天平(十萬分之一);梅特勒AE-100 型電子分析天平(萬分之一);SK2200LH 超聲波清洗器(上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司)。

1.2 試藥 甲醇、乙腈(天津四友生物醫(yī)學(xué)技術(shù)開發(fā)公司，色譜純);水為重蒸餾水;其余試劑均為分析純;牛蒡苷(批號110819-201007，純度為95.4%);綠原酸(批號110753-200413);連翹苷(批號110821-200610);甘草酸銨(批號1107317-200513)對照品均購自中國藥品生物制品檢定所;羚羊感冒片(北京同仁堂科技發(fā)展股份有限公司制藥廠，批號1120665)。

2 方法學(xué)考察

2.1 色譜條件 XDB-C18色譜柱 (250 mm ×4.6 mm，5 μm);流動(dòng)相為乙腈(A)-0.05 mol/L磷酸二氫鉀溶液(B)按表1 程序進(jìn)行梯度洗脫。體積流量0.85 mL/min，柱溫25 ℃，進(jìn)樣量10 μL。在該色譜條件下，4 種待測組分與其他組分達(dá)到基線分離，各待測組分的理論板數(shù)均不低于2 000。

表1 梯度洗脫程序Tab.1 Mode of gradient elution

2.2 混合對照品溶液的制備 分別精密稱取牛蒡苷、綠原酸、連翹苷、甘草酸銨對照品13.97、10.50、8.70、2.53 mg 置100 mL 量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，制成各對照品單標(biāo)溶液。精密移取各單標(biāo)溶液10 mL 置50 mL 量瓶中，加50%甲醇稀釋至刻度，作為混合對照品貯備液，備用。

2.3 供試品溶液的制備 取本品20 片，研成細(xì)粉，取1.27 g，精密稱定，置100 mL 量瓶中，加50%甲醇溶解并稀釋至刻度，濾過，取續(xù)濾液10 mL置50 mL 量瓶中，加50%甲醇稀釋至刻度，作為供試品溶液。

2.4 陰性對照溶液的制備 按處方比例制備不含牛蒡苷、綠原酸、連翹苷與甘草酸銨的樣品，再按“2.3”項(xiàng)下方法制備得到陰性對照溶液。

2.5 專屬性試驗(yàn) 分別量取10 μL 混合對照品溶液、供試品溶液、陰性對照溶液注入液相色譜儀，按“2.1”項(xiàng)下的色譜條件分別測定，得到混合對照品、供試品溶液和陰性溶液的HPLC 圖，見圖1。結(jié)果顯示陰性樣品對羚羊感冒片樣品測定無干擾。

圖1 HPLC 圖譜Fig.1 HPLC chromatograms

2.6 線性關(guān)系考察 精密吸取混合對照品溶液1、2、4、8 mL 置10 mL 量瓶中，將上述混合對照品溶液和對照品貯備液按“2.1”項(xiàng)下的色譜條件測定，記錄保留時(shí)間和峰面積，以質(zhì)量濃度C 與其相應(yīng)的峰面積A 求得回歸方程與相關(guān)系數(shù)。結(jié)果牛蒡苷的線性方程為A =86.082C -14.039，r2=0.999 6，在2.665 ～26.65 μg/mL 范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系;綠原酸的線性方程為A = 93.983C -5.969 6，r2=0.999 7，在2.100 ～21.00 μg/mL 范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系;連翹苷的線性方程為A=100.39C-23.205，r2=0.999 2，在1.740 ～17.40 μg/mL 范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系;甘草酸銨的線性方程為A =109.27C +1.8329，r2=0.999 5，在0.506 0 ～5.060 μg/mL 范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

2.7 精密度試驗(yàn) 精取同一混合對照品溶液，進(jìn)樣量10 μL，重復(fù)進(jìn)樣6 次(n=6)，記錄峰面積。牛蒡苷、綠原酸、連翹苷與甘草酸銨的峰面積RSD 分別為0.5%、0.6%、0.8%與1.0%，表明儀器精密度良好。

2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取本品細(xì)粉1.276 3 g，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別于配制后0、4、8、12、16 h 后進(jìn)樣測定，觀察供試品溶液穩(wěn)定性，樣品中牛蒡苷、綠原酸、連翹苷與甘草酸銨峰的峰面積積分值基本穩(wěn)定不變，RSD 值分別為0.8%、0.9%、0.9% 與1.1%，表明樣品溶液在16 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.9 回收率試驗(yàn) 采用加樣回收率法，取已知含有量的供試品溶液9 份，分別定量加入4 種對照品，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液并進(jìn)行測定，以50 mL 中的絕對含有量計(jì)算加樣回收率。結(jié)果牛蒡苷的回收率為100.2%，RSD 為0.6%;綠原酸為99.8%，RSD 為0.7%;連翹苷為99.7%，RSD 為0.8%;甘草酸銨為100.3%，RSD 為0.9%，表明該方法回收率良好。

3 數(shù)學(xué)模型

在本研究中，羚羊感冒片中牛蒡苷、綠原酸、連翹苷和甘草酸銨4 種指標(biāo)性成分含有量計(jì)算公式:

4 不確定度來源的識別及分析

4.1 不確定度的來源 從檢測過程和數(shù)學(xué)模型分析，樣品中4 種組分含有量的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel來源，主要包括①對照品稱樣與溶液配制過程引入相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度;②供試品稱樣與溶液配制過程引入相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度;③HPLC 測定峰面積響應(yīng)值的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度;④其他因素引入的不確定度分量。

4.2.1 對照品純度的標(biāo)準(zhǔn)不確定度 實(shí)驗(yàn)中所使用的牛蒡苷、綠原酸、連翹苷與甘草酸銨由于尚無法得到相關(guān)的不確定度參考值，故此項(xiàng)忽略不計(jì)。

通過計(jì)算，各對照品在稱量過程所產(chǎn)生的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度分別為urel(M牛) = 1.23 × 10-3;urel(M綠) = 1.55 × 10-3;urel(M連) = 1.87 ×10-3;urel(M綠) =6.44 ×10-3。

4.2.4 平均片重引入的不確定度分量 平均片重由稱定20 片樣品質(zhì)量，計(jì)算平均值得到。其不確定度分析與樣品稱量相同。20 片的片重為10.176 0 g，平均片重為508.8 mg。所以平均片重標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

表2 稀釋過程玻璃量器校準(zhǔn)和溫度變化引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度Tab.2 Uncertainty introduced by glass gauge calibration and temperature variation during dilution

4.2.9 合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度 根據(jù)計(jì)算公式，將以上各相對不確定度分量合成，得到羚羊感冒片中分別以牛蒡苷、綠原酸、連翹苷、甘草酸銨計(jì)算的量(X)相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度:

5 擴(kuò)展不確定度

取置信概率為95%，包含因子K =2，則相對擴(kuò)展 不 確 定 度 為 U (X) = 2 × ux，U(牛)=0.024 mg，U(綠)=0.028 mg，U(連)=0.034 mg，U(甘)=0.022 mg。

6 測量結(jié)果報(bào)告

結(jié)合上述測量結(jié)果及不確定度評定過程，由表3 可以看出，樣品中含牛蒡苷X牛= (1.67 ±0.02)mg/片;X綠= (2.03 ± 0.03) mg/片;X連=(2.34 ± 0.03)mg/片;X甘= (1.07 ± 0.02)mg/片。

表3 樣品測定結(jié)果及不確定度Tab.3 Contents and uncertainty of the samples

7 討論

經(jīng)二極管陣列檢測器全波長掃描，各待測物質(zhì)最大吸收波長分別為綠原酸326 nm，連翹苷280 nm，牛蒡苷280 nm，甘草酸銨234 nm。因此選擇采用程序波長法，在不同的時(shí)間段進(jìn)行波長切換檢測。

由評定過程可知，除去色譜儀本身的不確定度分量外，方法的準(zhǔn)確性、稱量過程、稀釋過程對合成不確定度貢獻(xiàn)較大。因此，在方法的開發(fā)中應(yīng)注意方法的準(zhǔn)確性考察;樣品測量方面，要注意樣品的均勻性和樣品處理過程的一致性;稀釋樣品時(shí)盡可能選用容量相對大的量具并盡可能減少稀釋步驟。

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