程 清， 陳 丹 ， 黃慶德， 曾令軍， 鄭 利， 連赟芳

(福建中醫(yī)藥大學藥學院，福建 福州350122)

玳玳別名代代Citrus Aurantium L. var daidai 是蕓香科柑桔亞屬植物，并且是酸橙的一個變種［1］。實驗證實，由玳玳果分離的玳玳果總黃酮主要含新橙皮苷、柚皮苷、橙皮苷等，藥理實驗證明玳玳果總黃酮提取物能夠顯著降低血脂，但該提取物僅微溶于水，口服生物利用度低。針對這些問題，以溶解度和微乳粒徑為指標，通過繪制自微乳處方三元相圖，篩選最優(yōu)處方組合及各成分用量范圍，最后采用單純型網(wǎng)格法優(yōu)選含藥自微乳化給藥系統(tǒng);接下來采用旋轉(zhuǎn)模壓法，以優(yōu)選的玳玳果總黃酮自微乳化給藥系統(tǒng)以及囊殼材料制備玳玳果總黃酮自微乳化軟膠囊;體外評價表明在37℃條件下經(jīng)過攪拌可以迅速自微乳化形成微乳(粒徑為85.8 nm)。經(jīng)體外溶出實驗證實，玳玳果總黃酮自微乳比玳玳果總黃酮提取物累計溶出百分率和溶出速率都有明顯提高。本實驗在前期研究的基礎(chǔ)上［2-9］，選擇玳玳果總黃酮主要藥效成分柚皮苷和新橙皮苷為評價指標，采用HPLC-MS 聯(lián)用色譜法［10-12］，用外翻腸囊模型比較玳玳果總黃酮自微乳(玳玳果總黃酮自微乳化軟膠囊內(nèi)容物)特征藥效成分柚皮苷與新橙皮苷在大鼠回腸、空腸和十二指腸的吸收，測定不同質(zhì)量濃度玳玳果總黃酮自微乳K-R 營養(yǎng)液在大鼠空腸的吸收，考察玳玳果總黃酮自微乳的大鼠腸吸收特性，對合理確定藥物的口服制劑處方和劑量，控制釋藥部位，提高生物利用度具有指導意義。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Waters HPLC TQD 高效液相色譜三重四級桿質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國Waters 公司);Masslynx 4.1 工作站控制系統(tǒng);AR2140 萬分之一電子天平(梅特勒-托利多儀器上海有限公司);XS 205 十萬分之一電子天平(梅特勒-托利多儀器上海有限公司);DKZ 系列電熱恒溫振蕩水槽(上海-恒科學儀器有限公司);Milli-Q 純水器(美國)。

1.2 試藥 玳玳果總黃酮提取物(自制，總黃酮為78%);玳玳果總黃酮自微乳化軟膠囊(自制，批號20111102，每粒0.5 g，含總黃酮45.8 mg/g，新橙皮苷20.2 mg/g，柚皮苷16.6 mg/g);柚皮苷對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號110722-200610);新橙皮苷對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號111857-201001);甲醇、乙腈為色譜純;氯化鈉、氯化鉀、無水氯化鈣、碳酸氫鈉、磷酸二氫鈉、六水氯化鎂、葡萄糖。

1.3 實驗動物 SD 健康大鼠(360 ±20)g，雄性，SPF 級，由福建中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供。

2 方法和結(jié)果

2.1 對照品貯備液的制備 精密稱取新橙皮苷對照品6.97 mg、柚皮苷對照品5.08 mg 置50 mL 量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，即得混合對照品貯備液，4 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。臨用前用甲醇稀釋至所需濃度。

2.2 Krebs-Ringer's 液(K-R 營養(yǎng)液)的制備［13］K-R 營養(yǎng)液 NaCl 7.8 g，KCl 0.35 g，CaCl20.37 g，NaHCO31.37 g，NaH2PO40.32 g，MgCl2·6H2O 0.043 g，D-Glucose 1.4 g，加蒸餾水稀釋至1 000 mL。

2.3 藥液的制備

2.3.1 空白自微乳藥液的制備 精密稱取缺玳玳果總黃酮的自微乳化軟膠囊內(nèi)容物約1.0 g，加入K-R 營養(yǎng)液100 mL，在37℃恒溫磁力攪拌器下溫和攪拌5 min，即得。

2.3.2 不同給藥劑量玳玳果總黃酮自微乳藥液的制備 稱取玳玳果總黃酮自微乳化軟膠囊10 粒，分取內(nèi)容物，混合均勻，分別取內(nèi)容物約300、700、1 000 mg，分別加入K-R 營養(yǎng)液100 mL，在37 ℃恒溫磁力攪拌器下溫和攪拌5 min，即得3.0、7.0、10.0 mg/mL 的玳玳果總黃酮自微乳化軟膠囊供試品溶液。

2.3.3 玳玳果總黃酮提取物藥液的制備 精密稱取玳玳果總黃酮提取物適量(約相當于玳玳果總黃酮自微乳化軟膠囊內(nèi)容物700 mg 含藥量)，加入K-R 營養(yǎng)液100 mL，在37℃恒溫磁力攪拌器下溫和攪拌10 min，即得。

2.4 色譜條件 ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱(2.1 mm × 100 mm，1.7 μm)，流動相為乙腈-0.1%甲酸水(30 ∶70)，體積流量0.3 mL/min，柱溫30 ℃，進樣量2 μL。

2.5 質(zhì)譜條件 掃描方式負離子掃描(ESI-)，毛細管電壓3 KV，錐孔電壓(柚皮苷40 V，新橙皮苷45 V)，離子源溫度110℃，脫溶劑氣體溫度350℃，脫溶劑氣體體積流量700 L/h，錐孔氣體體積流量50 L/h，質(zhì)量分析采用選擇離監(jiān)測模式(SIR)，柚皮苷m/z 579.1，新橙皮苷m/z 609.1。

2.6 外翻腸囊模型的建立與供試品溶液的制備取健康雄性SD 大鼠，實驗前禁食不禁水12 h，用4%烏拉坦腹腔注射麻醉(2.0 mL/kg)。沿腹中線打開腹腔后，剪取實驗所需腸段10 cm，置于37℃的K-R 營養(yǎng)液中，將腸囊翻轉(zhuǎn)同時用營養(yǎng)液沖洗小腸內(nèi)外表面。洗凈之后，將腸囊的一端用手術(shù)線結(jié)扎，另一端插入塑料管，并用手術(shù)線結(jié)扎固定。將腸囊置于盛有100 mL 玳玳果總黃酮自微乳K-R營養(yǎng)液的燒杯中，37 ℃條件下保溫同時保證持續(xù)通入空氣。向腸囊內(nèi)加入1.5 mL K-R 營養(yǎng)液，使腸囊內(nèi)的液面高于腸囊外的液面。分別于15、30、45、60、90 min 取樣100 μL，并立即補液。取出的供試品溶液置于1.5 mL 尖頭EP 管中，于-20 ℃冰箱冷凍保存，待測。各腸段區(qū)間:十二指腸段 自幽門下2 ～12 cm，空腸段 自幽門下15 cm開始至下行10 cm 處，回腸段 離盲腸上行20 cm開始至下行10 cm 處。

2.7 空白供試品溶液的制備 按“2.6”項下同法操作，燒杯中為空白自微乳K-R 營養(yǎng)液，外翻腸囊在37 ℃水浴中共育90 min 后，取出腸內(nèi)營養(yǎng)液，即為空白供試品溶液，置于1.5 mL 尖頭EP管中，于-20 ℃冰箱冷凍保存，待測。

2.8 樣品處理 精密移取供試品溶液100 μL 置于EP 管中，同時精密移取并加入甲醇300 μL，渦旋混合，17 000 r/min 離心5 min，取上清液進樣分析。

2.9 方法學考察

2.9.1 專屬性試驗 精密吸取空白腸內(nèi)液、柚皮苷和新橙皮苷混合對照品溶液及玳玳果總黃酮自微乳腸吸收液，分別注入液質(zhì)聯(lián)用儀，記錄液質(zhì)譜圖。實驗結(jié)果表明，空白腸內(nèi)液對新橙皮苷和柚皮苷的測定沒有干擾。結(jié)果見圖1。

圖1 質(zhì)譜總離子流圖Fig.1 Mass spectrometric total ion chromatograms

2.9.2 標準曲線的制備與線性關(guān)系的考察 精密吸取空白K-R 營養(yǎng)液100 μL，共6 份，分別加入100 μL 一定質(zhì)量濃度的混合對照品溶液和200 μL甲醇，渦旋混合，配制得到一系列不同質(zhì)量濃度的混合對照品溶液，進樣分析。實驗結(jié)果表明，柚皮苷質(zhì)量濃度在0.050 8 ～3.048 μg/mL 和新橙皮苷質(zhì)量濃度在0.069 7 ～4.182 μg/mL 時線性關(guān)系良好，線性回歸方程分別是:A = 5.23 × 104C -1.98 × 103(r = 0.999 3)，A = 6.21 × 104C -3.15 ×103(r=0.999 4)。

2.9.3 精密度和方法回收率試驗 按“2.9.2”項下分別配制3 個質(zhì)量濃度的混合對照品溶液(柚皮苷質(zhì)量濃度分別為0.152、0.508、2.032 μg/mL;新橙皮苷質(zhì)量濃度分別為0.209、0.697、2.788 μg/mL)各5 份，于1 日內(nèi)連續(xù)進樣測定，計算日內(nèi)精密度，連續(xù)測定3 日，計算日間精密度。實測濃度與理論濃度相比計算方法回收率。結(jié)果見表1。

表1 柚皮苷和新橙皮苷的精密度和回收率結(jié)果(n=5，±s)Tab.1 Precision and recovery of naringin and neohesperidin (n=5，±s)

表1 柚皮苷和新橙皮苷的精密度和回收率結(jié)果(n=5，±s)Tab.1 Precision and recovery of naringin and neohesperidin (n=5，±s)

配制質(zhì)量濃度/(μg·mL -1)測得平均質(zhì)量濃度/(μg·mL -1)日內(nèi)精密度RSD/%日間精密度RSD/%方法回收率(平均值)/%方法回收率(RSD)/%0.152 0.147 1.17 1.39 96.64 1.17柚皮苷 0.508 0.485 1.28 1.63 95.41 1.28 2.032 2.049 1.71 1.89 100.84 1.71 0.209 0.210 1.59 1.94 100.54 1.59新橙皮苷 0.697 0.664 1.05 1.70 95.33 1.05 2.788 2.834 1.40 1.64 101.65 1.40

2.9.4 穩(wěn)定性試驗 取柚皮苷質(zhì)量濃度為1.016 μg/mL、新橙皮苷質(zhì)量濃度為1.394 μg/mL 的混合對照品溶液1 份，分別于0、1、2、3、4、5、6 h進樣，測定，考察柚皮苷和新橙皮苷在K-R 營養(yǎng)液中的穩(wěn)定性。實驗結(jié)果表明，樣品溶液在6 h 內(nèi)保持穩(wěn)定。

2.10 玳玳果總黃酮自微乳化軟膠囊吸收部位的考察 取大鼠不同腸段(十二指腸、空腸、回腸)，分別置于7.0 mg/mL 的玳玳果總黃酮自微乳化軟膠囊供試品溶液，按“2.6”項下操作，重復3次，所得腸內(nèi)液按“2.8”項下同法操作，測定柚皮苷和新橙皮苷的累積吸收量，計算90 min 后柚皮苷和新橙皮苷的累積吸收量，比較在腸道不同部位柚皮苷和新橙皮苷的吸收情況。實驗數(shù)據(jù)經(jīng)SPSS 軟件處理，通過方差分析和兩兩比較，結(jié)果表明柚皮苷和新橙皮苷在十二指腸、空腸、回腸的吸收有顯著性差異(P ＜0.05)，均為十二指腸＞空腸＞回腸。結(jié)果見表2。

表2 柚皮苷和新橙皮苷90 min 后的累積吸收量(n=3)Tab.2 Cumulative absorption of naringin and neohespiridin after 90 min (n=3)

2.11 不同質(zhì)量濃度的玳玳果總黃酮自微乳化軟膠囊吸收過程的比較 分別取3.0、7.0、10.0 mg/mL的玳玳果總黃酮自微乳供試品溶液，取大鼠空腸外翻腸囊，按“2.6”項下操作，重復3 次，所得腸內(nèi)液按“2.8”項下同法操作，繪制吸收濃度-時間曲線。以腸囊內(nèi)柚皮苷和新橙皮苷濃度的對數(shù)值lnC 對取樣時間t 作線性回歸，其斜率即為吸收速率常數(shù)Ka。實驗結(jié)果表明，各條回歸方程的相關(guān)系數(shù)r 大于0.99，符合一級動力學過程。通過方差分析和兩兩比較，隨玳玳果總黃酮自微乳質(zhì)量濃度的增加柚皮苷和新橙皮苷的Ka 均增加(P ＜0.05)。結(jié)果見圖2，表3。

圖2 玳玳果總黃酮自微乳溶液在大鼠空腸吸收曲線圖Fig.2 Jejunum absorption of the solution of Daidai flavones self-microemulsion

表3 柚皮苷和新橙皮苷的吸收速率常數(shù)Tab.3 Constant for absorption rate of naringin and neohespiridin

2.12 玳玳果總黃酮自微乳與玳玳果總黃酮提取物腸吸收的比較 分別取玳玳果總黃酮自微乳供試品溶液(7.0 mg/mL)和玳玳果總黃酮提取物供試品溶液，按“2.6”項下操作，重復3 次，所得腸內(nèi)液按“2.8”項下同法操作，分別計算90 min 后腸囊中柚皮苷和新橙皮苷的累積吸收量。結(jié)果軟膠囊和玳玳果總黃酮提取物中柚皮苷的累積吸收量為(11.69 ±0.05)、(8.82 ±0.08)μg，新橙皮苷的累積吸收量為(12.74 ±0.09)、 (9.72 ±0.05)μg，實驗結(jié)果表明，相同劑量下，玳玳果總黃酮自微乳中柚皮苷和新橙皮苷的累積吸收量分別是玳玳果總黃酮提取物的1.33 和1.31 倍，可以得出結(jié)論:利用自微乳技術(shù)進行劑型改造后可顯著提高特征藥效成分柚皮苷和新橙皮苷在大鼠小腸的吸收。

3 討論

3.1 小腸是口服藥物的主要吸收部位，由于人體腸道不同區(qū)段的生理狀況各不相同，所以藥物在不同區(qū)段的吸收情況往往有較大差異，同時不同的給藥量對藥物的腸吸收也有影響。研究藥物腸道吸收特點，探討藥物吸收機制及其影響因素，對合理確定藥物的口服制劑處方和劑量，控制釋藥部位，提高生物利用度具有指導意義［13-14］。

3.2 有研究報道［15-16］，柚皮苷是P-gp 的底物，Pgp 是一種ATP 依賴性藥物外排泵，能利用ATP 水解釋放的能量主動地將疏水親脂性藥物轉(zhuǎn)運至細胞外，在一些特定的細胞如膽管內(nèi)皮細胞、小腸和結(jié)腸上皮細胞有高表達，其中位于腸黏膜的P-gp 主動將血中的藥物轉(zhuǎn)運至腸腔，可能在阻斷或減少藥物從腸腔中的吸收中發(fā)揮作用。實驗中隨著給藥劑量的增加，吸收速率常數(shù)Ka 隨之增大;而高劑量與中劑量相比，吸收速率常數(shù)Ka 略微增大，可能因為玳玳果總黃酮自微乳化口服給藥系統(tǒng)中含有非離子型表面活性劑吐溫-80，在一定程度上抑制P-gp 的活性，其抑制作用隨濃度增加而漸漸趨向于飽和。

3.3 實驗結(jié)果證實，玳玳果總黃酮自微乳化口服給藥系統(tǒng)在胃腸道能夠自發(fā)形成微乳，利用微乳的特性促進藥效成分的吸收，顯著提高特征成分新橙皮苷和柚皮苷的吸收速度和累積吸收量，為玳玳果總黃酮自微乳體內(nèi)生物利用度的研究奠定實驗基礎(chǔ)。

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