張小慧， 韓向暉 ， 劉 勝， 郭保鳳， 王春麗， 韓 偉

(1. 華東理工大學(xué)中藥現(xiàn)代化工程中心，上海200237;2. 上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院中醫(yī)外科研究所，上海200032)

骨是乳腺癌常見(jiàn)的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移部位，超過(guò)70%的乳腺癌病人可發(fā)生骨轉(zhuǎn)移。乳腺癌骨轉(zhuǎn)移的發(fā)病率和死亡率很高，中位生存期僅為2 年［1］。防治骨轉(zhuǎn)移仍是乳腺癌治療的重點(diǎn)和難點(diǎn)。盡管常規(guī)的放、化療、內(nèi)分泌治療和雙磷酸鹽療法取得了一定的療效，但都沒(méi)有從根本上解決乳腺癌骨轉(zhuǎn)移問(wèn)題［2］。骨髓微環(huán)境中間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow stem cells，BMSCs)與乳腺癌細(xì)胞之間的相互作用是乳腺癌細(xì)胞進(jìn)入并整合到骨髓的重要因素，前速激肽原1 (Preprotachykinin-1，Tac-1)/神 經(jīng) 激 肽1 受 體 (Neurokinin1 receptor，NK1R)通路是調(diào)節(jié)這種相互作用的關(guān)鍵途徑［3］。臨床研究表明，溫腎壯骨方配伍經(jīng)驗(yàn)協(xié)定方—乳癌術(shù)后方能顯著改善患者骨痛癥狀，減少骨相關(guān)事件發(fā)生率、延緩溶骨性病變，穩(wěn)定其生活質(zhì)量。實(shí)驗(yàn)研究也證實(shí)溫腎壯骨方可以抑制乳腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)、遷移，調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞與成骨細(xì)胞間分化平衡，阻止骨轉(zhuǎn)移的發(fā)展。

本研究通過(guò)進(jìn)一步觀察溫腎壯骨方對(duì)乳腺癌骨轉(zhuǎn)移裸鼠Tac1/NK1R 通路相關(guān)分子Tac-1、NK1R、stromal cell derived factor-1α (SDF-1α)、CXCR4 蛋白表達(dá)的影響，以期揭示該方干預(yù)乳腺癌骨轉(zhuǎn)移的的機(jī)制，為中醫(yī)藥防治乳腺癌骨轉(zhuǎn)移提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物及細(xì)胞株 免疫缺陷BALB/c 裸鼠50只，雌性，體質(zhì)量18 ～24 g，由上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，動(dòng)物許可證號(hào):SCXK(滬)2008-0016。

人乳腺癌骨高轉(zhuǎn)移細(xì)胞株MDA-MB-231BO 由美國(guó)德克薩斯州立大學(xué)醫(yī)學(xué)系內(nèi)分泌所Toshiyuki Yoneda 博士惠贈(zèng)，在含10 %胎牛血清，50 kU/L青霉素及50 mg/L 鏈霉素的DMEM 高糖培養(yǎng)基中，37 ℃，5%CO2環(huán)境下培養(yǎng)。

1.1.2 藥物及試劑 溫腎壯骨方，由補(bǔ)骨脂，蛇床子，制附子組成(原方比例為5 ∶5 ∶3)，由龍華醫(yī)院藥劑科制備。所有藥材按比例混合，常規(guī)方法浸泡4 h，煎煮兩次，每次1.5 h ，過(guò)濾、濃縮制備成含生藥量7.1 g/g 的流浸膏(含補(bǔ)骨脂素9.18 mg/g 浸膏，蛇床子素6.05 mg/g 浸膏)，批號(hào)120710。羊抗人Tac-1 和NK1R 多克隆抗體，兔抗人SDF-1α 和CXCR4 多克隆抗體(美國(guó)Santa Cruz公司)，其余試劑均為分析純。

1.1.3 主要儀器 TP1020 全自動(dòng)組織脫水機(jī)(德國(guó)Leica 公司);EG1160 石蠟包埋機(jī)(德國(guó)Leica公司);RM2265 輪轉(zhuǎn)式切片機(jī) (德國(guó)Leica 公司);IX71 熒光倒置顯微鏡 (日本OLYMPUS 公司);JVC TK-C1481BEC 彩色攝像機(jī)，CX31 生物顯微鏡(日本OLYMPUS 公司)等。

1.2 方法

1.2.1 分組、造模與給藥 參照課題組前期方法，建立和臨床接近的乳腺癌骨轉(zhuǎn)移動(dòng)物模型。選用6 ～8 周齡雌性裸鼠每只左心室接種親骨性乳腺癌高轉(zhuǎn)移細(xì)胞株MDA-MB-231BO 細(xì)胞懸液 (107個(gè)/mL)造模，每只0.1 mL。裸鼠接種24 h 后稱(chēng)定質(zhì)量，按體質(zhì)量分層隨機(jī)分為:模型對(duì)照組(移植瘤，灌胃生理鹽水)，溫腎壯骨方高、中、低劑量組(移植瘤，給藥劑量分別為3.75，7.5，15 g/(kg · d)，唑來(lái)磷酸組 (移植瘤，100 μg/kg)，每組10 只。造模后1 周開(kāi)始給藥，中藥組灌胃給藥，每日1 次，唑來(lái)磷酸組腹腔注射，每周1 次，連續(xù)6 周。末次給藥后1 h 處死小鼠，無(wú)菌條件下選取各組腫瘤骨轉(zhuǎn)移灶，4%多聚甲醛中固定24 h，10% EDTA 溶液進(jìn)行骨組織脫鈣10 d后，待骨質(zhì)變松后，石蠟包埋、切片，行常規(guī)HE染色，光鏡下觀察轉(zhuǎn)移組織的形態(tài)學(xué)變化。

1.2.2 免疫組化法檢測(cè)骨轉(zhuǎn)移組織中Tac-1、NK1R、SDF-1α、CXCR4 蛋白的表達(dá) 骨轉(zhuǎn)移病灶組織在4%多聚甲醛中固定16 h，石蠟包埋、切片，58 ℃烤24 h;石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，PBS洗3 ×3 min;用0.01 mol/L 枸櫞酸鹽緩沖液(pH 6.0)中加熱至96 ～100 ℃，持續(xù)20 min，室溫自然冷卻，PBS 洗3 ×3 min;滴加EDTA 抗原修復(fù)液，95 ℃置10 min，PBS 洗2 min ×3 次;室溫加入0.3%H2O2抑制內(nèi)源性過(guò)氧化物酶20 min，PBS洗3 × 3min;滴加20% 正常羊血清室溫封閉30 min;滴加羊抗人Tac-1 和NK1R 多克隆抗體，兔抗人SDF-1α 和CXCR4 多克隆抗體，37 ℃孵育2 h，PBS 洗3 ×3 min;滴加EnVision 試劑(HRP/R)37 ℃孵育30 min，PBS 洗3 ×3 min;DAB 顯色8 ～12 min;蘇木素襯染色，熱水藍(lán)化;吹干后，樹(shù)脂封片;鏡下觀察，核紫藍(lán)色，陽(yáng)性呈棕黃色，胞漿內(nèi)陽(yáng)性。所有切片均在同一條件的光學(xué)顯微鏡下觀察，每張切片選取5 個(gè)視野，應(yīng)用Image-Pro Plus 6.0 醫(yī)學(xué)圖像定量分析系統(tǒng)測(cè)定陽(yáng)性部位總吸光度值和總面積值，計(jì)算二者比值即陽(yáng)性表達(dá)部位的平均光密度值。

2 結(jié)果

2.1 骨組織病理形態(tài)學(xué)觀察 造模10 周后，模型對(duì)照組動(dòng)物多部位出現(xiàn)骨轉(zhuǎn)移灶，而溫腎壯骨方組及陽(yáng)性對(duì)照組骨轉(zhuǎn)移灶部位數(shù)明顯減少，見(jiàn)圖1。各組骨轉(zhuǎn)移灶病理學(xué)檢查顯示，模型對(duì)照組骨髓腔出現(xiàn)明顯異型性腫瘤細(xì)胞彌漫性浸潤(rùn)，原正常骨組織結(jié)構(gòu)發(fā)生破壞，呈現(xiàn)溶骨性病變。溫腎壯骨方組及陽(yáng)性對(duì)照組骨髓腔中腫瘤細(xì)胞浸潤(rùn)減輕，骨組織損傷情況明顯緩解，骨基質(zhì)邊緣及骨小梁周邊成骨細(xì)胞數(shù)目較模型對(duì)照明顯增多(見(jiàn)圖2)。提示溫腎壯骨方對(duì)裸鼠乳腺癌骨轉(zhuǎn)移具有一定的治療作用。

圖1 裸鼠骨轉(zhuǎn)移灶部位數(shù)Fig.1 Number of metastatic bone

圖2 乳腺癌骨轉(zhuǎn)移組織的病理形態(tài)學(xué)觀察Fig.2 Morphological changes in bone metastasis tissues of breast cancer

2.2 免疫組化檢測(cè)骨轉(zhuǎn)移灶中Tac1/NK1R 通路相關(guān)蛋白Tac-1、NK1R、SDF-1α、CXCR4 的表達(dá)Tac-1、NK1R、SDF-1α、CXCR4 蛋白陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞以胞質(zhì)呈棕黃色或棕褐色為主，胞核也有少量表達(dá)。與模型對(duì)照組比較，溫腎壯骨方各劑量組骨轉(zhuǎn)移灶中的SDF-1α、CXCR4 蛋白表達(dá)明顯降低(P ＜0.05 或P ＜0.01)，溫腎壯骨方組高、中劑量組骨轉(zhuǎn)移灶中的Tac-1、NK1R 的蛋白表達(dá)較模型對(duì)照組明顯降低(P ＜0.05 或P ＜0.01);與模型對(duì)照組比較，唑來(lái)膦酸組骨轉(zhuǎn)移灶中的Tac-1、CXCR4 的蛋白表達(dá)明顯降低(P ＜0.05 或P ＜0.01)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，溫腎壯骨方可能通過(guò)下調(diào)Tac-1、NK1R、SDF-1α、CXCR 蛋白的表達(dá)抑制乳腺癌骨轉(zhuǎn)移(見(jiàn)圖3 ～4)。

3 討論

存在于骨髓微環(huán)境中具有多向分化潛能的BMSCs 與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。BMMSCs 和乳腺癌細(xì)胞能通過(guò)Tac1/NK1R 信號(hào)通路，啟動(dòng)G 蛋白耦聯(lián)受體信號(hào)通路，調(diào)控SDF-1α-CXCR4 生物軸，最終誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞的骨侵襲和轉(zhuǎn)移。在Tac1/NK1R 信號(hào)通路中Tac-1 基因被認(rèn)為是調(diào)控乳腺癌早期階段癌細(xì)胞向骨髓侵襲、轉(zhuǎn)移的啟動(dòng)基因，并且在乳腺癌細(xì)胞和間充質(zhì)干細(xì)胞間的相互作用中起著整合的作用。它不僅能通過(guò)其編碼產(chǎn)物調(diào)控BMSCs 和乳腺癌細(xì)胞中SDF-1α 和CXCR4 的表達(dá)，影響兩種細(xì)胞的結(jié)合、黏附及轉(zhuǎn)移，而且能介導(dǎo)骨內(nèi)膜區(qū)的癌細(xì)胞過(guò)渡到靜止亞型，后者更容易生存在骨髓的微環(huán)境中并且對(duì)化療耐受［4-5］。SP 是Tac-1 基因最主要的編碼產(chǎn)物，它能通過(guò)旁分泌方式上調(diào)并激活細(xì)胞膜上的速激肽受體(如NK1 受體)刺激乳癌細(xì)胞的增殖，傳遞抗輻射性、減少乳腺癌細(xì)胞凋亡、誘導(dǎo)生長(zhǎng)因子和促血管生成因子分泌及促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞向骨的轉(zhuǎn)移［6-7］。

圖3 各組骨轉(zhuǎn)移組織中Tac1/NK1R 通路相關(guān)蛋白的表達(dá)(immunohistochemical stain，×200)Fig.3 Expressions of related proteins in bone metastatic tissues of breast cancer after the treatment with WSZG recipe (immunohistochemical stain，×200)

圖4 Tac1/NK1R 通路各蛋白陽(yáng)性表達(dá)的平均光密度值Fig.4 Effect of WSZG recipe on related protein expressions in Tac1/NK1R signaling pathway

骨轉(zhuǎn)移瘤屬中醫(yī)骨痹、骨蝕等范疇［8］。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為腎主骨主髓，關(guān)于腎與骨之間的關(guān)系，古文獻(xiàn)中早有記載，《素問(wèn)·宣明五氣篇》:明確指出“腎主骨”。乳腺癌骨轉(zhuǎn)移發(fā)病機(jī)制為本虛標(biāo)實(shí)，腎陽(yáng)虧虛是發(fā)生骨轉(zhuǎn)移之本，治療當(dāng)以溫腎為主。臨床針對(duì)乳腺癌骨轉(zhuǎn)移的患者，多在祛邪中藥基礎(chǔ)上加用補(bǔ)骨脂、蛇床子、骨碎補(bǔ)等補(bǔ)腎之品，以壯骨通陽(yáng)，并佐以炙乳香、附子、細(xì)辛溫陽(yáng)散寒止痛。本課題組臨床小樣本的回顧性隊(duì)列研究發(fā)現(xiàn)，“乳癌術(shù)后方”配伍“溫腎壯骨方”治療乳腺癌骨轉(zhuǎn)移患者50 例，能顯著改善患者骨痛癥狀，減少骨相關(guān)事件發(fā)生率及延緩溶骨性病變，并對(duì)乳腺癌骨轉(zhuǎn)移顯示出良好的抑制作用［9］。實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，補(bǔ)骨脂-蛇床子溫腎藥對(duì)能夠抑制乳腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)，抑制乳腺癌骨轉(zhuǎn)移造成的溶骨性惡性循環(huán)［10］。不同配伍比例的補(bǔ)骨脂-蛇床子藥對(duì)均能抑制親骨性乳腺癌高轉(zhuǎn)移細(xì)胞MDA-MB-231BO 的遷徙活性，刺激骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞轉(zhuǎn)化，減少破骨細(xì)胞分化，從而阻止了骨轉(zhuǎn)移的發(fā)展［11］。

本研究采用左心室接種親骨性乳腺癌高轉(zhuǎn)移細(xì)胞株MDA-MB-231BO 細(xì)胞懸液建立乳腺癌骨轉(zhuǎn)移裸鼠模型。造模4 周后，模型動(dòng)物即出現(xiàn)多處骨轉(zhuǎn)移病灶，鏡下觀察骨組織結(jié)構(gòu)發(fā)生破壞，骨髓腔中腫瘤細(xì)胞浸潤(rùn)明顯，表明造模成功。經(jīng)過(guò)溫腎壯骨方治療6 周后，高、中劑量組動(dòng)物骨轉(zhuǎn)移損傷情況明顯減輕，且成骨細(xì)胞數(shù)多于模型對(duì)照組。免疫組化結(jié)果顯示，溫腎壯骨方各劑量組能夠不同程度下調(diào)骨轉(zhuǎn)移灶中Tac1/NK1R 通路相關(guān)蛋白的表達(dá)，其中高、中劑量溫腎壯骨方能夠明顯降低Tac-1、NK1R、SDF-1α、CXCR4 4 種蛋白的表達(dá)，作用最強(qiáng)。

以上結(jié)果表明，溫腎壯骨方能減輕裸鼠乳腺癌細(xì)胞骨轉(zhuǎn)移程度，其機(jī)制可能與下調(diào)Tac1/NK1R通路相關(guān)蛋白表達(dá)有關(guān)。這些研究為臨床應(yīng)用該方治療乳腺癌骨轉(zhuǎn)移提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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