李家洲， 盧海嘯 ， 梁 珊

(玉林師范學院，廣西 玉林537000)

海木Trichilia connaroides 有清熱解毒，祛風濕腰腿痛，祛心、胃氣痛等功效［1］。Zhang 等［2］報道，海木三氯甲烷提取物具有止痛和抗炎活性。本課題組在進行海木不同極性部位的藥效初篩中，發(fā)現(xiàn)海木三氯甲烷部位具有顯著的活血化瘀以及降血糖、血脂和血壓的作用［3-5］。關于海木抑菌活性及其作用機理的研究尚未見報道，本實驗以大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、釀酒酵母、黑曲霉、青霉等6 種微生物作為供試菌種，初步研究海木枝葉乙醇、石油醚、三氯甲烷、正丁醇和水5 種不同極性部位的抑菌活性。

1 試驗器材

1.1 供試材料 海木枝葉:采自廣西永?？h壽城，經(jīng)廣西植物研究所劉演研究員鑒定為楝科植物海木Trichilia connaroides。供試菌種:大腸桿菌Escherichia coli、枯草芽孢桿菌Bacillu subtilis、金黃色葡萄球菌Staphylococcuaureus;黑曲霉Aspergillus niger、青霉Penicillium citrinum;啤酒酵母Saccharomyces cerevisiae。上述供試菌種取于玉林師范學院微生物實驗室。

1.2 試劑與藥品 三氯甲烷、石油醚、鹽酸、氫氧化鈉、葡萄糖為國藥化學試劑有限公司生產(chǎn)，氯化鈉為洛陽市化學試劑廠生產(chǎn)，正丁醇為西隴化工股份有限公司生產(chǎn)，無水乙醇為廣東東華化學有限公司生產(chǎn)，消毒酒精為武漢市雪環(huán)醫(yī)用消毒用品有限公司生產(chǎn)，蛋白胨、酵母膏為北京奧博星生物技術有限責任公司生產(chǎn)，牛肉膏為中國醫(yī)藥(集團)上海化學試劑廠生產(chǎn)，瓊脂粉為上海潤捷化學試劑有限公司生產(chǎn)。以上試劑均為分析純。

1.3 主要儀器 隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱、HH. B11.600-S-Ⅱ電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海躍進醫(yī)療器械廠);HZ-9811K 雙層雙速振蕩器(上?？等A生化儀器制造廠);CRDSX-280不銹鋼手提式壓力蒸汽滅菌鍋(上海博訊實業(yè)有限公司);超凈工作臺(蘇凈集團安泰公司)，UV-2102C 型可見分光光度計(天津港東);RE 系列旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海鵬奕儀器有限公司)。

2 試驗方法

2.1 海木提取物的制備 稱取海木干枝葉適量，加入適量的無水乙醇，加熱回流2 h，用四層紗布過濾，得到的上清液提取液，重復提取3 次，合并提取液，減壓回收溶劑，得膏狀物，將此膏狀物用適量乙醇溶解，然后加入3 倍量的蒸餾水，靜置，抽濾，除去沉淀物(葉綠素)，濾液回收溶劑至干，即得粗提(乙醇)部分。將所得粗提物分成5 份，1 份備用，另4 份依次用石油醚、三氯甲烷、正丁醇、水進行固-液萃取并減壓回收溶劑至干，最后得到的膏狀物即是石油醚、三氯甲烷、正丁醇和水極性部位。

取5 個已滅菌的50 mL 小燒杯，加入無菌蒸餾水10 mL，分別放進粗提(乙醇)、石油醚、三氯甲烷、正丁醇和水5 種極性部位的提取物3 g，60 ℃超聲波振蕩4 h，搖勻后即得30 %的海木乙醇提取物、石油醚提取物、三氯甲烷提取物、正丁醇提取物和水提取物溶液。

2.2 培養(yǎng)基平皿的制備 LB 培養(yǎng)基(培養(yǎng)細菌用):牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，瓊脂20 g，蒸餾水1 000 mL，pH 7.0 ～7.2;PDA 培養(yǎng)基(培養(yǎng)真菌用):馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂20 g，水1 000 mL，pH 自然。馬鈴薯去皮，切成小塊，煮沸30 min，雙層紗布過濾三次，再加葡萄糖、瓊脂熔化，補足水至1 000 mL。121 ℃高溫滅菌30 min。選用直徑9 cm 的無菌培養(yǎng)皿，待已滅菌的培養(yǎng)基降溫至70 ℃左右，在酒精燈附近，每皿倒入15 ～20 mL 培養(yǎng)基，冷凝備用［6］。

2.3 菌懸液的配制及含菌平皿的制備 用接種環(huán)挑取適量經(jīng)活化的各種待測菌體或孢子，以無菌水稀釋，振搖10 min，充分混合，制成相應的初始菌體懸液或孢子懸液，備用。

每種待測菌取無菌平皿9 套，分別標記4、5、6 號各3套。另取6 支盛有4.5 mL 無菌水的試管，分別標為1、2、3、4、5、6 號試管。用1 mL 無菌試管吸取1 mL 已經(jīng)充分混勻的初始菌懸液，精確放0.5 mL 至1 號試管中，此為10倍稀釋。將多余的菌液放回原菌液中。將1 號試管置于振蕩器上振蕩，使菌液充分混勻。另取一支1 mL 吸管從1 號試管中吸取1 mL 菌液，精確放0.5 mL 至2 號試管中，此為100 倍稀釋。其余依此類推。

每種待測菌用3 支1 mL 無菌吸管分別吸取各稀釋菌懸液1 mL 對號放入編好號的相應無菌平皿中，每皿放0.2 mL，馬上向上述盛有不同稀釋度菌液的平皿中倒入溶化后冷卻至45 ℃左右的LB 培養(yǎng)基或PDA 培養(yǎng)基約15 mL，置水平位置迅速旋轉(zhuǎn)平皿，使培養(yǎng)基與菌液混合均勻，待培養(yǎng)基凝固后，放于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。然后取出培養(yǎng)平皿，算出同一稀釋度的3 個平皿中的菌落平均數(shù)，并按下列公式計算:每1 mL 中菌落形成單位(cfu) = 同一稀釋度3 次重復的平均菌落數(shù)×稀釋倍數(shù)×5［7］。

選取菌落形成單位為107～108cfu/mL 的相應稀釋度的菌懸液作為待測試驗菌懸液，標注待測菌種名稱。

分別用無菌吸管吸取各種待測菌懸液0.1 mL 分別加入相應的培養(yǎng)基平皿上，用經(jīng)酒精燈燒過的三角涂布棒涂布均勻，直到培養(yǎng)基的表面基本干燥為止，即制成含菌平皿。

2.4 抑菌圈測定 剪制直徑為6 mm 的小圓形濾紙片，經(jīng)高溫蒸氣滅菌(121 ℃下滅菌30 min)，烘干。分別于各種30%海木提取物溶液和無菌水中，浸泡過夜。在無菌條件下，取出小圓濾紙片，自然瀝干，每皿間隔一定距離分別放置各種濾紙片一片，每菌3 個重復。然后將平皿分別放入相應適宜溫度的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)(細菌37 ℃，培養(yǎng)24 h;真菌28 ℃，培養(yǎng)48 h)。使用游標卡尺測量各抑菌圈的直徑大小，取其平均值作為實驗結(jié)果。

2.5 最低抑菌質(zhì)量濃度( MIC) 的測定 按“2.2”項配方配制LB 培養(yǎng)基和PDA 培養(yǎng)基，121 ℃高溫滅菌30 min。

采用二倍稀釋法測定最低抑菌質(zhì)量濃度［8］:每種待測菌取8 支無菌小試管，第1 管加30%原提取液1 mL，其他7 管各加相應的滅菌培養(yǎng)液1 mL，第2 管加原提取液1 mL，混合均勻后吸取1 mL 于第3 管，混勻后吸取1 mL 于第4 管，依次類推到第7 管，棄去1 mL，第8 管改加1 mL 無菌水后棄去1 mL 作為對照。使各種海木提取物溶液分別稀釋成3/10、3/20、3/40、3/80、3/160、3/320、3/640 g/mL 的不同質(zhì)量濃度。1 ～7 號管中均含有1.0 mL 不同稀釋度的海木提取液，8 號管為無提取物對照，每管加菌懸液0.1 mL，搖勻。然后，置于200 r/min 的振蕩器上培養(yǎng)24 h。結(jié)果判定:培養(yǎng)液清亮透明表示無菌生長，渾濁表示有菌生長，以無菌生長的最小質(zhì)量濃度為最低抑菌質(zhì)量濃度。

2.6 最低殺菌質(zhì)量濃度( MBC) 的測定 從“2.5”項無菌生長的液體培養(yǎng)基中吸出0.1 mL 滴入相應的平板中，涂布均勻。然后將各平皿放入相應適宜的恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)(細菌37 ℃，培養(yǎng)24 h，真菌28 ℃，培養(yǎng)48 h)，觀察是否有菌生長［9］。結(jié)果判定:以無菌生長的最小質(zhì)量濃度為最低殺菌質(zhì)量濃度。

2.7 熱穩(wěn)定性的測定 將提取物分別置于80 ℃、100 ℃水浴和121 ℃濕熱條件下分別處理30 min，用未經(jīng)熱處理的海木相應部位的原液作為對照，測定待測菌株的抑菌性［10］。每菌重復3 次，按“2.4”項方法量取抑菌圈直徑，取其平均值為測定結(jié)果。

3 結(jié)果與分析

3.1 抑菌效果 由表1 可知，海木提取物對大腸桿菌，枯草芽孢桿菌有較強的抑制作用，對金黃色葡萄球菌抑制效果不明顯，對黑曲霉、青霉、啤酒酵母均無抑制作用。對細菌的抑菌順序為:大腸桿菌＞枯草芽孢桿菌＞金黃色葡萄球菌。各提取物的抑菌效果順序為:三氯甲烷提取物＞正丁醇提取物＞水提取物，而乙醇提取物、石油醚提取物的抑制作用甚弱。

表1 海木提取物抑菌圈直徑(mm)

3.2 最低抑菌質(zhì)量濃度( MIC) 根據(jù)表1 的結(jié)果，本實驗只測定3 種提取物對大腸桿菌和枯草芽孢桿菌的最低抑菌質(zhì)量濃度和最低殺菌質(zhì)量濃度。結(jié)果見表2 和表3，三氯甲烷提取物的最低抑菌質(zhì)量濃度(MIC)最小，正丁醇提取物次之，3 者對大腸桿菌的MIC 分別為0.037 5、0.037 5、0.075 g/mL;對枯草芽孢桿菌的MIC 分別為0.037 5、0.075 0、0.15 g/mL。

3.3 最低殺菌質(zhì)量濃度( MBC) 結(jié)果見表4 ～5，三氯甲烷提取物、正丁醇提取物、水提取物對大腸桿菌的最低殺菌質(zhì)量濃度(MBC)分別是0.075 0、0.075 0、0.150 0 g/mL，對枯草桿菌的最低殺菌質(zhì)量濃度(MBC)分別是0.075 0、0.150 0、0.300 0 g/mL。

表2 海木提取物對大腸桿菌的最低抑菌質(zhì)量濃度(MIC)

表3 海木提取物對枯草芽孢桿菌的最低抑菌質(zhì)量濃度(MIC)

表4 海木提取物對大腸桿菌最低殺菌質(zhì)量濃度(MBC)

表5 海木提取物對枯草芽孢桿菌最低殺菌質(zhì)量濃度(MBC)

3.4 熱穩(wěn)定性測定 結(jié)果見表6 ～7。水提部位經(jīng)80 ～121 ℃處理后抑菌圈直徑變化幅度較小，表明水提取物的熱穩(wěn)定性較好。其他2 種提取物經(jīng)過80 ～100 ℃的溫度處理后，抑菌圈直徑數(shù)值變化小，其抑菌活性變化不大，但121 ℃處理后抑菌圈直徑明顯變小，抑菌效果變差，抑菌性能大大降低，但仍表現(xiàn)出一定的抑制作用。

表6 海木提取物熱處理后對大腸桿菌的抑菌圈直徑

表7 海木提取物熱處理后對枯草芽孢桿菌的抑菌圈直徑

4 討論

本實驗結(jié)果顯示，海木各種極性的抑菌效果為:三氯甲烷部位＞正丁醇部位＞水部位;而乙醇部位和石油醚部位的抑制作用較為微弱，表明三氯甲烷部位和正丁醇部位是海木發(fā)揮抑菌作用的主要活性部位;海木提取物對細菌生長具有廣譜抑制作用，其中對革蘭氏陰性菌抑制作用較強，對革蘭氏陽性菌抑制作用較弱，抑菌順序為:大腸桿菌＞枯草芽孢桿菌＞金黃色葡萄球菌;水部位的熱穩(wěn)定性較好，三氯甲烷和正丁醇部位和熱穩(wěn)定性相對較弱，但只要使用低于100 ℃溫度進行提取，其提取物仍具有較強的抑菌活性。

課題組將對海木三氯甲烷部位和正丁醇部位的活性成分做進一步的追蹤，最終分離出其具有生物活性的單體成分，為海木的進一步開發(fā)利用提供實驗基礎。

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