李存玉， 支興蕾， 李賀敏， 李紅陽， 鄭云楓， 彭國平*

(1. 南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，江蘇 南京210023;2. 江蘇省中藥資源產(chǎn)業(yè)化過程協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 南京210023)

中藥注射劑的出現(xiàn)給中藥制劑的發(fā)展帶來了新的機(jī)遇，但是由于直接進(jìn)入血液，因此易引起不良反應(yīng)［1-2］，從而導(dǎo)致了安全性出現(xiàn)質(zhì)疑的后果。而在注射劑臨床使用過程中出現(xiàn)的熱原反應(yīng)，多是由于在注射劑生產(chǎn)、儲存、運輸、配液使用過程中的細(xì)菌污染所導(dǎo)致的，其中以生產(chǎn)過程最易引入污染［3］，而目前對注射劑中內(nèi)毒素檢測僅對終產(chǎn)品檢驗作為產(chǎn)品質(zhì)量優(yōu)劣的評判，與藥品生產(chǎn)過程實施過程分析監(jiān)控的理念相悖［4］。

熱原反應(yīng)為最常見的中藥注射劑不良反應(yīng)，主要物質(zhì)是內(nèi)毒素，當(dāng)進(jìn)入體內(nèi)的內(nèi)毒素積量超過人體的耐受量時，便發(fā)生熱原反應(yīng)，臨床表現(xiàn)為體溫升高甚至高熱，伴以發(fā)冷、出汗、惡心等，嚴(yán)重者甚至導(dǎo)致休克、死亡［5-6］。目前注射劑生產(chǎn)廠家對熱原的檢測主要采用家兔法和鱟試劑法［7］，而家兔法在清熱解毒類中藥注射劑的熱原檢查時，由于藥物的清熱藥效作用往往會產(chǎn)生假陰性結(jié)果［8］。為了降低成分對內(nèi)毒素檢測的干擾，本實驗選用鱟試劑法進(jìn)行內(nèi)毒素定量測定。

為了體現(xiàn)過程監(jiān)控的必要性，選擇臨床中用量較大的中藥注射劑丹參滴注液作為研究對象，根據(jù)生產(chǎn)工藝中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)進(jìn)行取樣，采用鱟試劑動態(tài)濁度法進(jìn)行內(nèi)毒素含量測定，分析生產(chǎn)中的易引入內(nèi)毒素污染的重點環(huán)節(jié)，并對注射劑生產(chǎn)中的內(nèi)毒素過程監(jiān)控的重要性進(jìn)行分析。

1 材料與方法

1.1 材料 定量檢測用鱟試劑(批號1303270，最低檢測限0.03 EU/mL，規(guī)格0.6 mL/Amp，湛江博康海洋生物有限公司)，細(xì)菌內(nèi)毒素工作對照品(批號201176，規(guī)格100 EU/Amp，中國食品藥品檢定研究院)，細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水(批號1303120，規(guī)格5 mL/Amp，湛江博康海洋生物有限公司)。丹參滴注液(批號13042603，生產(chǎn)過程取樣及檢測在上海華源安徽錦輝制藥有限公司完成)。

1.2 儀器 BET-72M 細(xì)菌內(nèi)毒素測定儀(天津市天大天發(fā)科技有限公司);渦旋混合器(天津市天大天發(fā)科技有限公司);高溫烘箱(HJ101-2，常州昊江電熱器材制造有限公司);玻璃試管及玻璃槍頭(250 ℃烘烤除內(nèi)毒素2 h)。

1.3 方法

1.3.1 丹參滴注液的生產(chǎn)工藝 丹參藥材，加純化水煎煮3 次，煎煮液濾過，濃縮，醇沉2 次至含醇量分別為75%和85%，回收乙醇，加注射用水稀釋，調(diào)節(jié)pH 至3.0，冷藏，過濾，加針用活性炭，攪拌并煮沸15 min 以上，進(jìn)行脫炭過濾。取葡萄糖加入針用活性炭，攪拌并煮沸15 min以上，進(jìn)行脫炭過濾，濾液與煮沸后的丹參提取液合并，調(diào)pH 為3.8 ～4.2，加注射用水及適量亞硫酸氫鈉，加針用活性炭，攪拌并煮沸15 min 以上，經(jīng)鈦棒過濾器循環(huán)過濾，再經(jīng)0.45 μm、0.22 μm 過濾器循環(huán)過濾，超濾，灌封，滅菌。

1.3.2 丹參滴注液的生產(chǎn)工藝中的取樣環(huán)節(jié) 根據(jù)丹參滴注液生產(chǎn)工藝中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，確定了取樣點，具體見表1。

表1 取樣點及工藝步驟

1.3.3 動態(tài)濁度法檢測細(xì)菌內(nèi)毒素［7，9-11］

1.3.3.1 丹參滴注液內(nèi)毒素限值 根據(jù)2010 年版《中國藥典》附錄ⅩⅢD 細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法項下的規(guī)定，藥品的細(xì)菌內(nèi)毒素限值(L)按照下式計算:

式中，L 為供試品的細(xì)菌內(nèi)毒素限值，單位為EU/mL;K為人每千克體質(zhì)量每小時最大可接受的內(nèi)毒素劑量，注射劑K=5.0 EU/(kg·h)，M 為人用每千克體質(zhì)量每小時的最大供試品劑量，以mL/(kg· h)表示，人均體質(zhì)量按60 kg 計算。

丹參滴注液成人每小時最大給藥劑量是500 mL，則內(nèi)毒素最小限值為L =［5.0 EU/(kg·h)×1 h ×60 kg］/500 mL=0.6 EU/mL。

1.3.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的可靠性試驗 取細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品，檢查用水1 mL 溶解得100 EU/mL 的內(nèi)毒素母液，3 000 r/min 渦旋混勻15 min，按照稀釋梯度為4 倍，配制成濃度為2.0、0.5、0.125、0.031 25 EU/mL 的內(nèi)毒素溶液，各取0.1 mL 分別加到預(yù)先加有0.1 mL 鱟試劑溶液的玻璃管內(nèi)，渦旋混勻，插入BET-72M 細(xì)菌內(nèi)毒素定量檢測儀內(nèi)進(jìn)行檢測，其中每一濃度重復(fù)3 管，并同時做未加細(xì)菌內(nèi)毒素的陰性對照3 管。按最小二乘法進(jìn)行回歸運算，則標(biāo)準(zhǔn)曲線為:lgT = 3.024 16 - 0.396 16lgC，r =-0.993 0。其中T 為反應(yīng)時間，單位為s;C 為內(nèi)毒素濃度，單位為EU/mL。反應(yīng)時間在1 104 ～4 044 s 之間，內(nèi)毒素濃度在2.0 ～0.031 25 EU/mL 時，陰性對照管反應(yīng)時間大于標(biāo)準(zhǔn)曲線最低濃度的反應(yīng)時間，且相關(guān)系數(shù)(r)的絕對值大于0.980，故標(biāo)準(zhǔn)曲線成立。

1.3.3.3 最大有效稀釋倍數(shù) 最大有效稀釋倍數(shù)是指在試驗中供試品溶液被允許達(dá)到稀釋的最大倍數(shù)(MVD)，在不超過此稀釋倍數(shù)的濃度下進(jìn)行內(nèi)毒素限值的檢測，其計算公式為:

L 為丹參滴注液內(nèi)毒素限值0.6 EU/mL，C 為藥液質(zhì)量濃度為1.0 g/mL，λ1為0.031 25 EU/mL，因此，丹參滴注液的最大有效稀釋倍數(shù)為19.2 倍。

1.3.3.4 干擾試驗 根據(jù)《中國藥典》2010 年版附錄ⅩⅢD 細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法中光度法的干擾試驗要求，本試驗中細(xì)菌內(nèi)毒素的回收率在50% ～200%之間，則認(rèn)為在此試驗條件下丹參滴注液不存在干擾作用。

1.3.3.5 丹參滴注液稀釋倍數(shù) 為了提高檢測結(jié)果的準(zhǔn)確度，本實驗選擇在最大有效稀釋倍數(shù)范圍內(nèi)，分別考察稀釋2、4、8、16 倍時，以回收率為指標(biāo)分析丹參滴注液對內(nèi)毒素檢查檢查結(jié)果的干擾程度，結(jié)果見表2。

從表2 中數(shù)據(jù)可以看出，丹參滴注液在稀釋倍數(shù)為8倍時，檢測結(jié)果最為準(zhǔn)確，因此本實驗供試品均是以丹參滴注液成品中濃度折算稀釋后，進(jìn)而采用稀釋8 倍進(jìn)行測定。

表2 稀釋倍數(shù)考察

2 結(jié)果

分析圖1 中內(nèi)毒素濃度的變化趨勢可以看出，丹參滴注液在生產(chǎn)中的內(nèi)毒素污染比較嚴(yán)重，在經(jīng)過醇沉過濾后(樣品1)，內(nèi)毒素的濃度高于100 EU/mL，這主要是由丹參藥材及所用試劑和環(huán)境因素所引起的。

圖1 丹參滴注液生產(chǎn)過程中的內(nèi)毒素水平

丹參提取液在經(jīng)過活性炭處理后(樣品2)內(nèi)毒素濃度有明顯下降，但是從圖1 中可以看出，由于活性炭的飽和吸附，樣品2 中的內(nèi)毒素濃度仍高于20 EU/mL。

丹參滴注液中所用輔料葡萄糖在配液中可以發(fā)現(xiàn)，葡萄糖溶液(樣品3)中內(nèi)毒素濃度較低，約為5 EU/mL 左右，再經(jīng)過活性炭處理后濃度降至0.5 EU/mL，說明在溶液中內(nèi)毒素濃度在一定范圍內(nèi)時，活性炭可以較好的去除內(nèi)毒素，去除效果在90%以上。

但是在丹參提取液(樣品2)和葡萄糖溶液(樣品4)進(jìn)行混合配液時(樣品5)，內(nèi)毒素濃度出現(xiàn)了明顯上升，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于二者的濃度總和，說明在配液過程中不同溶液的合并容易引起內(nèi)毒素的突發(fā)污染。

合并配液后，采用活性炭處理(樣品6)，微孔濾膜過濾(樣品7)，內(nèi)毒素濃度出現(xiàn)明顯下降，但是內(nèi)毒素濃度均在0.6 EU/mL 左右，與其內(nèi)毒素濃度限值接近，但是在超濾處理后(樣品8)，內(nèi)毒素濃度低于0.2 EU/mL，在灌封滅菌后(樣品9)雖然出現(xiàn)小幅的增高，但是仍低于0.2 EU/mL，在其安全限度范圍內(nèi)。

3 討論

目前中藥注射劑中內(nèi)毒素的檢測均是以終產(chǎn)品的作為對象，缺乏生產(chǎn)保險系數(shù)。隨著“藥物是生產(chǎn)出來的，而不是檢驗出來的”概念提出，中藥注射劑在某種程度上應(yīng)當(dāng)借鑒這種理念，從傳統(tǒng)的控制成品質(zhì)量上升至藥品生產(chǎn)過程的有效監(jiān)控的現(xiàn)代質(zhì)量管理模式。

通過對丹參滴注液生產(chǎn)環(huán)節(jié)樣品中的內(nèi)毒素分析，可以發(fā)現(xiàn)內(nèi)毒素濃度的變化水平，并根據(jù)易引起內(nèi)毒素污染的關(guān)鍵環(huán)節(jié)進(jìn)行監(jiān)控，從而有效地控制丹參滴注液的內(nèi)毒素的量。但是目前較靈敏的內(nèi)毒素檢測方法為鱟試劑動態(tài)濁度法，此方法檢測準(zhǔn)確、靈敏，但是樣品的檢測周期較長，且檢測試劑價格偏高。由于是通過生產(chǎn)過程中的取樣分析，取樣容器和保存過程中易受外界環(huán)境的影響，無法實現(xiàn)在注射劑生產(chǎn)過程中的密閉環(huán)境中的內(nèi)毒素在線監(jiān)控。

目前，經(jīng)文獻(xiàn)分析發(fā)現(xiàn)，內(nèi)毒素根據(jù)其結(jié)構(gòu)特征具有類表面活性，在水溶液中呈現(xiàn)出團(tuán)聚狀態(tài)［12-13］，經(jīng)激光照射可呈現(xiàn)出散射特征［14］，因此通過對內(nèi)毒素本身的性質(zhì)開發(fā)注射劑生產(chǎn)過程中的在線監(jiān)控裝置，通過與注射劑生產(chǎn)管路并聯(lián)，才能真正地實現(xiàn)“過程監(jiān)控”［15］。

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