李先寬， 王 冰 ， 鄭艷超， 宋 新， 丁 璞， 劉 樅

(遼寧中醫(yī)藥大學(xué)，遼寧 大連116600)

五味子為木蘭科植物五味子Schisandra chinensis (Turcz.)Baill 的干燥成熟果實［1］，是歷代藥典收載的常用藥材。作為一種傳統(tǒng)中藥，常用于治療干咳，哮喘，盜汗，遺精和慢性腹瀉等［2-3］?，F(xiàn)代研究證明，五味子具有多種有效成分，常用于保肝［4-5］、抗衰老、抗氧化［6-7］、提高免疫能力［8-9］、調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)系統(tǒng)［10-12］等作用。五味子是遼寧省最重要的道地藥材，由于近些年五味子的廣泛種植，其廣泛的種源，即種質(zhì)資源來源不一致是影響五味子質(zhì)量的一個重要因素［13］。本課題組于2012年9 月～10 月收集了東北地區(qū)主要栽培品種，包括紅珍珠、長白紅等共10 份樣品。本研究應(yīng)用苯酚-硫酸比色法和高效液相色譜法兩種方法，分別對五味子多糖和木脂素兩類主要有效成分進(jìn)行定量測定和分析，目的對東北地區(qū)不同的五味子栽培品種進(jìn)行質(zhì)量研究，為保護(hù)和合理利用五味子種質(zhì)資源提供理論依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 UV-1750 紫外分光光度計(SHIMADZU)、恒溫水浴鍋(北京永光明醫(yī)療儀器廠)、鼓風(fēng)恒溫干燥箱(沈陽市醫(yī)療器械廠)、索氏提取器、Agilent1100 高效液相色譜儀，VWD 檢測器(G1314A)，四元泵(G1311A) (美國Agilent 公司)、電子天平 (瑞士 Mettler Toledo AG285，AE240)、KQ-250 型超聲清洗器(昆山超聲儀器有限公司)。

1.2 試劑 無水葡萄糖、對照品五味子醇甲(110857-200507)、五味子甲素(110764-200609)、五味子乙素(110765-200710)(購自中國食品藥品檢定研究院)，五味子醇乙、五味子丙素(購自成都思科華生物技術(shù)有限公司)。重精餾苯酚、硫酸、無水乙醇均為分析純，甲醇為色譜純和分析純，乙腈為色譜純，水為重蒸餾水。

1.3 藥材 樣品來源見表1，經(jīng)遼寧中醫(yī)藥大學(xué)王冰教授鑒定為北五味子果實。取適量室內(nèi)自然晾干至一定程度的果實樣品，將果肉和種子小心剝離后得果肉樣品。果肉和果實樣品在室內(nèi)自然晾干，粉碎后過60 目篩，稱量前將樣品置于烘箱中，40 ℃下干燥24 h 后取出，放入干燥器中備用。

表1 五味子樣品來源Tab.1 Source of medicinal materials

2 方法

2.1 多糖測定方法

2.1.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精密稱量干燥至恒定質(zhì)量的葡萄糖對照品10 mg，加適量水溶解，轉(zhuǎn)移至100 mL 量瓶中，加水定容至刻度，搖勻，配成質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL 的葡萄糖對照溶液，備用。精密量取葡萄糖對照溶液0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、1.0 mL 于具塞試管中，分別加水補足至1.0 mL，再分別加入5%苯酚溶液1 mL，搖勻后加濃硫酸5 mL，充分搖勻，放入冰水浴中，所有樣品加完顯色劑后同時放入40 ℃水浴鍋中，反應(yīng)30 min，取出，放冷至室溫后，在485 nm 處測其吸光度，以多糖質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行線性回歸，得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程:A =10.428X -0.021 3，相關(guān)系數(shù)r = 0.996。實驗結(jié)果表明在0.01 ～0.1 mg/mL范圍內(nèi)質(zhì)量濃度與吸光度之間呈良好的線性關(guān)系。這符合Lambert-Beer 定律，表明根據(jù)吸光度來計算樣品中粗多糖量是可靠的。

2.1.2 供試品溶液制備 取干燥后的果實樣品粉末(60 目)0.20 g，精密稱定，用80%乙醇浸泡過夜，索氏提取器中80%乙醇回流提取2 h，粉末揮干溶劑后，以水為溶媒超聲提取55 min，料液比1 ∶30，提取溫度65 ℃，取出，放冷至室溫后，減壓抽濾，濾液定容于250 mL 量瓶中，搖勻，得粗多糖供試品溶液。

2.2 木脂素測定方法

2.2.1 HPLC 色譜條件 Agilent TC-C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流動相為乙腈(A)-水(B)梯度洗脫(0 ～15 min，50% A;15 ～25 min，75% A;25 ～30 min，58% A;30 ～32 min，58% A;32 ～35 min，65% A;35 ～45 min，65%A)。檢測波長250 nm，體積流量1 mL/min，柱溫35 ℃，進(jìn)樣量10 μL。高效液相色譜圖見圖1。

圖1 木脂素類對照品及樣品的HPLC 圖譜Fig.1 Chromatograms of sample and reference substances of lignans

2.2.2 對照品溶液制備 分別精確稱取一定量干燥至恒定質(zhì)量的5 種對照品，分別用甲醇溶解并定容于25 mL 量瓶中，制備成五味子醇甲(0.205 2 mg/mL)、五味子醇乙(0.209 2 mg/mL)、五味子甲素(0.197 6 mg/mL)、五味子乙素 (0.203 6 mg/mL)、五味子丙素(0.202 8 mg/mL)的對照品溶液。

2.2.3 供試品溶液制備 取干燥后的樣品粉末(60 目)約0.25 g，精密稱定，置50 mL 錐形瓶中，精密加入甲醇25 mL，稱定質(zhì)量，超聲提取30 min，取出，放冷至室溫后，加甲醇補足失質(zhì)量，搖勻，濾過。濾液作為供試品溶液［14］。

2.2.4 木脂素標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 分別吸取五味子醇甲 (143.64 μg/mL)、五味子醇乙 (33.47 μg/mL)、五味子甲素(69.16 μg/mL)、五味子乙素(87.55 μg/mL)、五味子丙素(6.08 μg/mL)對照品溶液0.63、1.25、2.5、5 mL 分別置10 mL量瓶中，加甲醇稀釋到刻度，搖勻，分別精密吸取各質(zhì)量濃度對照品溶液10 μL，依次注入高效液相色譜儀，以各成分的峰面積平均值為縱坐標(biāo)(Y)，其對應(yīng)進(jìn)樣量(μg)為橫坐標(biāo)(X)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，做線性回歸。五味子醇甲在0.13 ～1.44 μg 范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，其回歸方程為Y =0.035X- 0.736 4 (r = 0.999);五味子醇乙在0.03 ～0.33 μg 范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，其回歸方程為Y=0.039 3X -0.000 6 (r =0.999);五味子甲素在0.06 ～0.69 μg 范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，其回歸方程為Y = 0.034 9X + 0.315 (r =0.999);五味子乙素在0.08 ～0.88 μg 范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，其回歸方程為Y = 0.039X -1.050 5 (r =0.999);五味子丙素在0.01 ～0.06 μg 范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，其回歸方程為Y =0.054 4X-0.054 (r=0.999)。

2.3 樣品測定

2.3.1 樣品中粗多糖測定 每份多糖供試品溶液平行測定3 次，顯色過程同“2.1.1”項。同時做一空白，在485 nm 處測其吸光度。按下式計算多糖的量，多糖量(%) = (A +0.021 3) ×250 ×100 /10.428 W。不同類型多糖測定結(jié)果見表2。

2.3.2 樣品中木脂素測定 稱取“1.3”項下備用的不同栽培品種五味子粉末0.25 g，精密稱定，按“2.2.3”項下制備供試品溶液，按“2.2.1”項下色譜條件測定。每一樣品平行進(jìn)樣3 次，以外標(biāo)法中的標(biāo)準(zhǔn)曲線法計算樣品各成分的量。不同農(nóng)家類型測定結(jié)果見表3。其中，總量的值為5 種指標(biāo)成分含有量的和。

表2 多糖測定結(jié)果Tab.2 Results of the contents with polysaccharide

2.3.3 果肉中木脂素量占果實中木脂素量的比例對不同五味子栽培品種，果實樣品和相對應(yīng)的果肉樣品中所測的木脂素指標(biāo)成分進(jìn)行比較分析，結(jié)果見表4。

3 討論

紅珍珠為我國選育唯一獲得登記的五味子品種，樣品7 和樣品8 均為紅珍珠，其采集時間相近，但所處的生態(tài)環(huán)境不同，五味子植株不同的生態(tài)環(huán)境可能是導(dǎo)致紅珍珠1 和紅珍珠2 樣品之間多糖百分含有量相差1%的主要原因。紅珍珠二代是在紅珍珠的基礎(chǔ)上，自主選育的栽培品種，與紅珍珠來相比，其果穗長，果穗密，果粒大，果肉厚，多糖百分含有量在所有樣品中最高為7.18%。鳳選系列為遼寧鳳城大梨樹培育的栽培品種，在采集樣品時，鳳選1 ～3 號均已成熟，鳳選4 號樣品距離最佳采收期提前約1 個星期，測定結(jié)果表明鳳選4 號果實樣品中多糖含有量低于鳳選1 ～3 號。五味子樣品多糖百分含有量平均值為5.83%，表明栽培品種樣品中多糖含有量是非常豐富的。然而，在五味子收獲季節(jié)，為了便于采摘、運輸和晾曬等，果實中多糖往往還未達(dá)到峰值便被采摘。五味子多糖藥理活性強，在保肝、增強免疫等方面具有良好的應(yīng)用前景［15］。探尋不同栽培品種五味子果實多糖積累最適宜的生態(tài)環(huán)境，確定最佳的采收期是非常重要的。

表3 木脂素測定結(jié)果(mg/g，n=3)Tab.3 Results of the contents with lignans (mg/g，n=3)

表4 果肉中木脂素成分占果實中木脂素成分的比例(mg/mg)Tab.4 Proportions (pulp/fruit)of the contents with the 5 kinds of index ingredients (mg/mg)

由表3 可知，所有栽培品種果實樣品中五味子醇甲含有量均達(dá)到了《中國藥典》的標(biāo)準(zhǔn)［1］。五味子果實中果肉與所對應(yīng)的種子干粒重比，以1 為準(zhǔn)上下波動［16］，故由表3 和表4 可知，5 種成分在種子中的含有量要明顯高于果肉中的含有量;表明五味子木脂素成分主要存在于種子中。實驗結(jié)果表明五味子醇乙和五味子丙素在果肉中的量占果實中量的比例要明顯高于其他3 種成分，這2 種成分比例平均值分別為0.270 和0.211。因此五味子藥材在與其他藥物配伍使用時，為提高木脂素類成分的有效利用率，可考慮將藥材適當(dāng)粉碎后入藥。

白果五味子為五味子的變異類型［17］，在遼寧省鳳城市和東港市等五味子基地均有少量分布，據(jù)本課題組統(tǒng)計，白果五味子植株所占基地五味子植株的比例大約在1/3 000 左右，多年跟蹤觀察發(fā)現(xiàn)其遺傳性狀較為穩(wěn)定。目前關(guān)于白果五味子的研究較少，本研究對其多糖和木脂素兩類成分同時進(jìn)行了測定分析，結(jié)果表明白果五味子樣品多糖含有量為5.57%，與五味子栽培樣品相比無明顯差異;木脂素類成分五味子乙素在果實樣品中含有量相對其他樣品較小，同時，五味子乙素在其果肉樣品中沒有被檢出，其他木脂素類指標(biāo)成分含有量與五味子栽培樣品相比無明顯差異。

本研究對東北地區(qū)五味子主要栽培品種中多糖類和木脂素類有效成分進(jìn)行了研究，對綜合評價栽培五味子的品質(zhì)，指導(dǎo)今后五味子的育種工作和對種質(zhì)資源的合理保護(hù)具有重要的意義。

［1］ 國家藥典委員會. 中華人民共和國藥典:2010 年版一部［S］. 北京:中國醫(yī)藥科技出版社，2010:61-62.

［2］ Saunders R M K. Monograph of Kadsura (Schisandraceae)［J］. Syst Bot Mon，1998，54(22):24-106.

［3］ Lin Q，Duan L D，Yao B F. Notes on three species of the genus Kadsura Juss. (Schisandraceae)［J］. Acta Phys Sin，2005，43(6):567-570.

［4］ 李秀娟，高文霞，馮玉霞. 五味子對撲熱息痛致肝臟毒性的保護(hù)作用［J］. 齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2001，22(7):727.

［5］ 高普軍，樸云峰，郭曉林，等. 北五味子粗多糖保肝作用的機理［J］. 白求恩醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，1996，22(1):23.

［6］ 李 莉，劉耕陶. 五味子酚對氧自由基引起大鼠腦突觸體和線粒體損傷的保護(hù)作用［J］. 藥學(xué)學(xué)報，1998，33(2):81.

［7］ 孫文娟，呂文偉，于曉鳳，等. 北五味子粗多糖抗衰老作用的實驗研究［J］. 中國老年學(xué)雜志，2001，21(11):454.

［8］ 李 巖，曲紹春，孫文娟，等. 北五味子粗多糖對環(huán)磷酰胺所致小鼠免疫功能低下的保護(hù)作用［J］. 白求恩醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，1995，21(6):583.

［9］ 苗明三，方曉艷. 五味子多糖對正常小鼠免疫功能的影響［J］. 中國中醫(yī)藥科技，2003，10(2):100.

［10］ 霍艷雙，陳曉輝，李 康，等. 北五味子的鎮(zhèn)靜、催眠作用［J］. 沈陽藥科大學(xué)學(xué)報，2005，22(2):126.

［11］ 鈕心懿. 五味子有效成分“醇甲”的中樞神經(jīng)系統(tǒng)作用［J］. 藥學(xué)學(xué)報，1983，18(6):416.

［12］ 齊 治，崔景榮，田建柱，等. 五味子果實揮發(fā)油對中樞神經(jīng)系統(tǒng)的藥理作用研究［J］. 北京醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，1988，20(6):457.

［13］ 于立合，孫慶龍，竇圣姍，等. 藥用五味子種質(zhì)資源調(diào)查及研究［J］. 亞太傳統(tǒng)醫(yī)藥，2005，(3):84-87.

［14］ 李先寬，趙 玥，韓榮春，等. 遼寧省栽培五味子品質(zhì)評價［J］. 中成藥，2011，33(1):82-86.

［15］ 蘇明威，王乃平，辛華雯，等. 五味子藥理作用研究進(jìn)展［J］. 中國藥師，2009，12(7):960-962.

［16］ 李先寬，韓榮春，王 冰，等. 遼寧省栽培五味子生物學(xué)特征分析［J］. 北方園藝，2010(24):209-211.

［17］ 卓麗環(huán)，黃普華. 黑龍江省北五味子新變種［J］. 植物研究，1994，14(1):35-36.