唐進(jìn)法， 宋云香， 魯 靜， 李學(xué)林

(河南中醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院 藥學(xué)部，河南 鄭州450000)

丹紅注射液是由丹參、紅花兩味中藥按科學(xué)配方提取，制成的中藥復(fù)方制劑，能夠明顯緩解心絞痛癥狀，改善心肌缺血情況，臨床上主要用于治療肺心病、冠心病、心絞痛、慢性腦供血不足等疾?。?］。丹酚酸B 是丹參中的主要酚酸類成分，具有保護(hù)心腦血管缺血-再灌注損傷、抗纖維化、促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞增殖分化等作用［2-5］。測(cè)定不同種屬動(dòng)物血漿中丹酚酸B 的方法均有所報(bào)道［6-11］。王小平等［12-13］采用HPLC-MS 法測(cè)定了大鼠靜脈注射丹紅注射液后血漿中丹酚酸B 的質(zhì)量濃度，但所需儀器昂貴，分析時(shí)間長(zhǎng)。本實(shí)驗(yàn)建立了測(cè)定大鼠血漿中丹酚酸B 的超高效液相色譜(UPLC)法，方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、快速，適用于大鼠靜脈注射丹紅注射液后丹酚酸B 藥代動(dòng)力學(xué)行為的研究。

1 材料與方法

1.1 儀器 H-CLASS 超高效液相色譜儀(美國(guó)waters 公司);電子分析天平 (德國(guó)賽多利斯)，TGL-16B 離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)，QL-901漩渦混合器 (海門市其林貝爾儀器制造有限公司)，BF-2000 氮?dú)獯蹈蓛x(北京八方世紀(jì)科技有限公司)。

1.2 藥品與試劑 丹紅注射液(菏澤步長(zhǎng)制藥有限公司，批號(hào)12031018)，丹酚酸B (純度大于98.0%，中國(guó)藥品生物制品檢定所，111562-201111)，甲醇、乙腈、甲酸為色譜純，水為超純水，其他試劑為分析純。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 Wistar 大鼠，SPF 級(jí)，體質(zhì)量240 ～260 g，雌雄各半，山東魯抗動(dòng)物中心提供。動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào):SCXK 魯20080002。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 BEH Shield RP18色譜柱 (2.1 mm×100 mm，1.7 μm)，BEH Shield RP18保護(hù)柱(2.1 mm ×5 mm，1.7 μm);流動(dòng)相甲醇-乙腈-0.5%甲酸水溶液(29 ∶10 ∶61);體積流量0.3 mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng)286 nm;柱溫30 ℃;進(jìn)樣量5 μL。

2.2 溶液制備 精密稱定丹酚酸B 對(duì)照品3.41 mg，置于10 mL 量瓶中，加75%甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，配制成丹酚酸B 為0.341 mg/mL的對(duì)照品貯備液。取丹酚酸B 對(duì)照品貯備液適量，分別用75% 甲醇稀釋成含丹酚酸B 0.170 5、0.341、0.682、 1.705、 3.410、 6.820、 17.05、34.10 μg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)系列溶液。對(duì)照品貯備液及標(biāo)準(zhǔn)系列溶液于4 ℃冰箱保存。

2.3 血漿樣品處理 取血漿200 μL，加入75%甲醇200 μL，2 mol/L 鹽酸溶液100 μL，1%醋酸溶液100 μL，再加入乙酸乙酯1 mL，渦旋1 min，15 000 r/min 離心15 min，吸取有機(jī)層于20 ℃氮?dú)饬飨麓蹈?。殘留物?5%甲醇100 μL 溶解，渦旋1 min，15 000 r/min 離心15 min，吸取上清液5 μL 測(cè)定。

2.4 方法學(xué)確證

2.4.1 專屬性 取大鼠空白血漿200 μL，按“2.3”項(xiàng)方法操作，所得色譜圖見圖1A;將0.170 5 μg/mL 的丹酚酸B 對(duì)照品溶液加入大鼠空白血漿，除不加75% 甲醇200 μL 外，其余按“2.3”項(xiàng)方法操作，所得色譜圖見圖1B;取大鼠尾靜脈給藥2 h 后的血漿樣品200 μL，按“2.3”項(xiàng)方法操作，所得色譜圖見圖1C。結(jié)果顯示，血漿中的內(nèi)源性物質(zhì)不干擾樣品的測(cè)定。

2.4.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線與最低下限 取空白血漿200 μL，分別加入丹酚酸B 對(duì)照品標(biāo)準(zhǔn)系列溶液200 μL，得到質(zhì)量濃度為0.170 5、0.341 0、0.682 0、1.705、3.410、6.820、17.05 和34.10 μg/mL 的血漿標(biāo)準(zhǔn)樣品，除不加75%甲醇200 μL 外，其余按“2.3”項(xiàng)方法操作，進(jìn)樣分析。以對(duì)照品質(zhì)量濃度(μg/mL)為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，用加權(quán)最小二乘法(W =1/X2)計(jì)算回歸方程和相關(guān)系數(shù)。得到丹酚酸B 的標(biāo)準(zhǔn)曲線為y = 34 623.913x+240.466，r=0.992 0。結(jié)果表明，丹酚酸B 在0.170 5 ～31.40 μg/mL 的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，定量下限為0.170 5 μg/mL。

2.4.3 準(zhǔn)確度與精密度 取空白血漿200 μL，分別加入0.341 0、3.410、27.28 μg/mL 的丹酚酸B對(duì)照品溶液，得到高、中、低不同質(zhì)量濃度的血漿質(zhì)控樣品，除不加75%甲醇200 μL 外，其余按“2.3”項(xiàng)方法操作，進(jìn)樣分析。每個(gè)質(zhì)量濃度6樣本，連續(xù)測(cè)定3 d，計(jì)算得到方法準(zhǔn)確度與精密度，結(jié)果見表1。

圖1 空白血漿(A)、空白血漿加入0.170 5 μg/mL 的丹酚酸B 對(duì)照品溶液(B)、大鼠給藥2 h 后血漿(C)的色譜圖Fig.1 UPLC chromatograms:A (blank plasma sample);B (blank spiked with 0.170 5 μg/mL standard salvianolic acid B solution );C (rat plasma sample collected 2 h after intrarenous administration)

表1 大鼠血漿中丹酚酸B 的準(zhǔn)確度和精密度Tab.1 Accuracy and precision of salvianolic acid B in rat plasma

2.4.4 回收率測(cè)定 取空白血漿200 μL，分別加入0.341 0、3.410、27.28 μg/mL 的丹酚酸B 對(duì)照品溶液，得到高、中、低不同質(zhì)量濃度的血漿質(zhì)控樣品，除不加75%甲醇200 μL 外，其余按“2.3”項(xiàng)方法操作，進(jìn)樣分析，另取相應(yīng)質(zhì)量濃度對(duì)照品溶液 (0.341 0、3.410、27.28 μg/mL)，進(jìn) 樣10 μL，將所得峰面積比較，計(jì)算提取回收率分別為(90.0 ±6.4)%、 (90.3 ±4.3)%和(92.1 ±2.5)%。

2.5 藥代動(dòng)力學(xué)研究

2.5.1 樣品采集及測(cè)定 Wistar 大鼠6 只，雌雄各半，實(shí)施頸靜脈插管手術(shù)，插管后飼養(yǎng)3 d，給藥前禁食12 h，自由飲水。大鼠以10 mL/kg (含丹酚酸B 0.336 5 mg/mL)的劑量尾靜脈注射丹紅注射液，分別于給藥前及給藥后 0.016 7、0.083 3、0.167、0.25、0.5、0.75、1、1.5、2 h經(jīng)導(dǎo)管取血約0.5 mL，置肝素化離心管中，在4 ℃下4 500 r/min 離心15 min，分離血漿，于-80 ℃冰箱中保存待測(cè)。

血漿樣品按“2.3”項(xiàng)處理，取上清液分析測(cè)定，將所測(cè)得色譜峰面積代入標(biāo)準(zhǔn)曲線，求出不同時(shí)間點(diǎn)的血藥濃度。

2.5.2 藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù) 大鼠尾靜脈注射丹紅注射液后，丹酚酸B 的平均血藥濃度-時(shí)間曲線見圖2。采用DAS2.1.1 軟件計(jì)算主要的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)，結(jié)果見表2。

圖2 大鼠單劑量靜脈注射丹紅注射液后血漿中丹酚酸B平均血藥濃度-時(shí)間曲線Fig.2 Mean plasma concentration-time profile of salvianolic acid B after intravenous administration of Danhong Injection to rats

表2 大鼠單劑量靜脈注射丹紅注射液后血漿中丹酚酸B 藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)Tab.2 Pharmacokinetic parameters of salvianolic acid B in rats after intravenous administration of Danhong Injection

3 討論

本實(shí)驗(yàn)前期曾嘗試使用甲醇、乙腈等試劑沉淀蛋白來處理血漿，但所得樣品色譜圖中，內(nèi)源性干擾峰及雜質(zhì)都較多，檢測(cè)靈敏度較差，故改用液液萃取法。考察了中性及酸性(1 moL/L 鹽酸溶液+1%醋酸溶液、2 moL/L 鹽酸溶液+1%醋酸溶液)條件下血漿中丹酚酸B 的提取回收率，確定以2 moL/L 鹽酸溶液和1%醋酸溶液為酸化劑。接著比較了不同提取溶劑(丙酮、乙酸乙酯)對(duì)血漿中丹酚酸B 提取回收率的影響，最終選擇乙酸乙酯為提取溶劑。

中藥制劑中含有多種化學(xué)成分，成分間可能會(huì)發(fā)生相互作用，使Tmax、Cmax或AUC 等藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)發(fā)生改變［9，14］，目前，關(guān)于丹紅注射液中各成分相互協(xié)調(diào)、發(fā)揮綜合協(xié)同作用的研究報(bào)道較少，今后，將多開展丹紅注射液中多組分藥代動(dòng)力學(xué)的研究。

［1］ 周 松，陳 騰，王青麗. 丹紅注射液的藥理作用與臨床應(yīng)用概述［J］. 中國(guó)藥師，2008，11(8):987-989.

［2］ 李 琴，韓力培，李澤慧，等. 丹酚酸B 通過抑制MAPK 通路減輕大鼠腦缺血再灌注引起的血腦屏障損傷［J］. 藥學(xué)學(xué)報(bào)，2010，45(12):1485-1490.

［3］ 高元峰，陳 虎，王銀輝，等. 丹酚酸B 對(duì)大鼠心肌缺血保護(hù)作用及其機(jī)制研究［J］. 時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2012，23(11):2771-2772.

［4］ 周 娟，張 悅，陸海英，等. 丹參酚酸B 鹽對(duì)大鼠腎纖維化的影響［J］. 中國(guó)中藥雜志，2009，34(21):2790-2793.

［5］ 郭國(guó)慶，李 斌，王圓圓，等. 丹酚酸B 促進(jìn)胎鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)干細(xì)胞增殖、突起生長(zhǎng)和分化［J］. 中國(guó)科學(xué)(C 輯:生命科學(xué))，2009，39(8):793-802.

［6］ 馬 樂，任偉超，董 婧，等. 大鼠靜脈注射丹參酚酸B 后的藥代動(dòng)力學(xué)研究［J］. 中國(guó)臨床藥理學(xué)與治療學(xué)，2007，12(11):1231-1236.

［7］ 王小平，劉 峰，楊東華，等. 丹參總酚酸在大鼠血漿中的藥動(dòng)學(xué)研究［J］. 中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)，2013，19(12):141-144.

［8］ 宋 敏，杭太俊，張正行. 丹參提取物有效成分在大鼠體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)和相互影響研究［J］. 藥學(xué)學(xué)報(bào)，2007，42(3):294-300.

［9］ 林 力，劉建勛，張 穎，等. 復(fù)方丹參制劑不同配伍對(duì)丹酚酸B 在大鼠血漿中藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)的影響［J］. 中國(guó)中藥雜志，2008，33(2):2683-2687.

［10］ 陳 平，路 通，吳伯英，等. 應(yīng)用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)檢測(cè)血漿樣品中丹參酚酸類成分的濃度［J］. 中國(guó)臨床藥理學(xué)與治療學(xué)，2007，12(7):748-755.

［11］ 林 力，劉建勛，張 穎，等. LC-MS/MS 法同時(shí)測(cè)定犬血漿中丹酚酸A、丹酚酸B、紫草酸和迷迭香酸及其在丹參提取物的藥代動(dòng)力學(xué)研究應(yīng)用［J］. 世界科學(xué)技術(shù)-中醫(yī)藥現(xiàn)代化，2012，14(3):1567-1571.

［12］ 王小平，劉 峰，楊東華，等. HPLC-MS 法測(cè)定大鼠注射丹紅注射液后血漿中3 種酚酸類成分［J］. 中草藥，2012，43(2):275-278.

［13］ 王小平，白吉慶，楊東華，等. 丹紅注射液中迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B 在大鼠血漿中的濃度測(cè)定［J］. 中國(guó)新藥雜志，2011，20(24):2475-2478.

［14］ 郝 福，蔣 曄，李艷榮，等. 復(fù)方中藥化學(xué)成分的研究進(jìn)展［J］. 中成藥，2007，29(2):258-262.