廖成成， 臧 寧， 班建東， 唐景財， 何 敏， 李 力

(1. 廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院，廣西 南寧530000;2. 廣西醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)科學(xué)實驗中心，廣西 南寧530021;3. 廣西壯族自治區(qū)藥用植物園，廣西 南寧530023)

哮喘嚴(yán)重危害人類健康，發(fā)病人數(shù)逐年增加，預(yù)防和控制任務(wù)艱巨。 《本草綱目》記載蛤蚧(gecko)可用于虛喘氣促，臨床和民間應(yīng)用均顯示其可用于治療支氣管哮喘［1］。目前普遍認(rèn)為免疫失調(diào)是引發(fā)該病的重要原因。本研究通過觀察黑斑蛤蚧對過敏性哮喘小鼠血清中白介素4(IL-4)、白介素5 (IL-5)以及干擾素γ (IFN-γ)的影響，探討蛤蚧對BALB/c 哮喘模型小鼠的治療作用，進(jìn)一步為黑斑蛤蚧的治療提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實驗動物 4 周齡SPF 級雌性BALB/c 小鼠購自廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心(實驗動物合格證號:0046242)，10 只1 籠，繼續(xù)喂養(yǎng)至體質(zhì)量25 ～30 g。

1.2 試劑與藥物 卵白蛋白(Ovalbumin，OVA)購自Sigma 公司;氫氧化鋁(上海生化試劑廠);地塞米松(天津天藥藥業(yè)股份有限公司);生理鹽水(廣西醫(yī)科大學(xué)制藥廠);ELISA 試劑盒(上海西塘生物科技有限公司);黑斑蛤蚧粉由廣西藥用植物園提供，產(chǎn)地為廣西大新縣寶圩鄉(xiāng)。蛤蚧除去內(nèi)臟，60 ℃置烘箱內(nèi)烘干，粉碎成粉末。

1.3 儀器 酶標(biāo)儀為BioRad 公司的iMark680，超聲霧化器(402B)為江蘇魚躍醫(yī)療設(shè)備股份有限公司產(chǎn)品;自制小鼠霧化吸入箱材料為塑料，尺寸為(55 cm×35 cm ×30 cm)。

1.4 方法

1.4.1 哮喘模型的制備 50 只BALB/c 小鼠，10只為正常對照，不參與建模，其余40 只參照參考文獻(xiàn)［2-6］方法，小鼠分別于第1、第7 和第14天腹腔注射200 μL 內(nèi)含10 μg OVA、40 mg 氫氧化鋁的生理鹽水致敏。第15 天開始將上述小鼠一起置于霧化箱中，以1%OVA 生理鹽水霧化激發(fā)。霧化器動力為1.7 MHz，霧化率為2 mL/min，每天1次，每次30 min，共激發(fā)14 d。觀察小鼠是否出現(xiàn)煩躁、呼吸急促、哮鳴音、腹肌抽搐及口唇紫紺等癥狀，參與建模的小鼠均出現(xiàn)不同程度的上述癥狀，說明建模成功。

1.4.2 動物分組與給藥 50 只BALB/c 小鼠隨機分為10 只正常對照組及40 只哮喘模型組。建模成功的哮喘模型組被隨機分為3 組:黑點蛤蚧干預(yù)組、地塞米松干預(yù)組、生理鹽水組，每組10 只。最后一次致敏后第2 天開始給藥，黑斑蛤蚧組小鼠給藥劑量為1 g/kg，6 g 黑斑蛤蚧干粉加100 mL 生理鹽水調(diào)和，每只小鼠(按30 g 體質(zhì)量)0.5 mL灌胃給藥。地塞米松組給藥劑量為0.20 mg/mL，每只小鼠(按30 g 體質(zhì)量)0.5 mL 灌胃給藥。生理鹽水組及正常對照組均以生理鹽水0.5 mL 灌胃給藥。各組連續(xù)給藥7 d。

1.4.3 血清樣本制備 給藥結(jié)束后第2 天，3 組小鼠摘除眼球取血，室溫靜置1 h;于40 ℃，1 500 r/min 離心10 min，吸取血清，分裝后凍存于-20 ℃。

1.4.4 血清中IL-5、IL-4、IFN-γ 的測定 采用ELISA 雙抗體夾心法測定，按試劑盒操作說明書進(jìn)行檢測。

2 結(jié)果

2.1 正常對照組與生理鹽水組的Th1，Th2 失衡分析 IFN-γ 代表Th1 型細(xì)胞因子，IL-4、IL-5 代表Th2 型細(xì)胞因子，可通過小鼠血清細(xì)胞因子的變化分析建模后Th1、Th2 失衡的情況。如表1 所示，生理鹽水組較正常對照組IL-4 和IL-5 水平均有顯著升高(P ＜0.05)，IFN-γ 則有顯著降低(P ＜0.05)。

表1 正常對照組與生理鹽水組小鼠血清中IL-4、IL-5 和IFN-γ 變化(±s)Tab.1 Changes of IL-4，IL-5 and IFN-γ between the control group and saline group in mice serum (±s)

表1 正常對照組與生理鹽水組小鼠血清中IL-4、IL-5 和IFN-γ 變化(±s)Tab.1 Changes of IL-4，IL-5 and IFN-γ between the control group and saline group in mice serum (±s)

注:與正常對照組比較，* P ＜0.05

組別 動物數(shù)IL-5/(pg·mL -1)IL-4/(pg·mL -1)IFN-γ/(pg·mL -1)10 13.00 ±2.09 14.60 ±3.50 389.76 ±22.34生理鹽水組 10 48.09 ±7.23* 47.18 ±4.46* 135.18 ±20.01正常對照組*

2.2 干預(yù)后各組小鼠血清中IL-5、IL-4、IFN-γ 的變化 黑斑蛤蚧干預(yù)組、地塞米松干預(yù)組與生理鹽水組相比較，IL-4 和IL-5 水平均有顯著降低(P ＜0.05)，IFN-γ 則有顯著提高(P ＜0.05);黑斑蛤蚧干預(yù)組與地塞米松干預(yù)組比較，地塞米松下調(diào)IL-4 和IL-5 水平和上調(diào)IFN-γ 水平的作用均強于黑斑蛤蚧(P ＜0.05)，見表2。

表2 干預(yù)后各組小鼠血清中IL-4、IL-5 和IFN-γ 變化(±s)Tab.2 Changes of IL-4，IL-5 and IFN-γ after the intervention (±s)

表2 干預(yù)后各組小鼠血清中IL-4、IL-5 和IFN-γ 變化(±s)Tab.2 Changes of IL-4，IL-5 and IFN-γ after the intervention (±s)

注:與生理鹽水組比較，* P ＜0.05;與地塞米松干預(yù)組比較，ΔP ＜0.05

組 別 動物數(shù) IL-5/(pg·mL -1) IL-4/(pg·mL -1) IFN-γ/(pg·mL -1)黑斑蛤蚧干預(yù)組 10 22.93 ±1.33* Δ 15.12 ±2.87* Δ 325.66 ±27.17*Δ地塞米松干預(yù)組 10 17.00 ±3.36* 11.60 ±2.82* 353.11 ±25.24*生理鹽水組10 48.09 ±7.23 47.18 ±4.46 135.18 ±20.01

2.3 各組小鼠干預(yù)后Th1、Th2 相關(guān)的細(xì)胞因子相關(guān)性分析 IL-4 和IL-5 屬于Th2 系統(tǒng)的細(xì)胞因子，而IFN-γ 屬于Th1 系統(tǒng)的細(xì)胞因子。為比較蛤蚧在干預(yù)過程中是否因IL-4 和IL-5 與IFN-γ 水平失衡的關(guān)系導(dǎo)致哮喘癥狀減輕，對Th1、Th2 相關(guān)的細(xì)胞因子相關(guān)性進(jìn)行分析。

黑斑蛤蚧干預(yù)組的IFN-γ 水平分別與IL-4、IL-5 水平呈負(fù)相關(guān)(r = -0.61， -0.71)，IL-4、IL-5 水平呈正相關(guān)(r=0.62)，P 值均＜0.05。地塞米松干預(yù)組的IFN-γ 水平分別與IL-4、IL-5 水平呈負(fù)相關(guān)(r = -0.76， -0.75)，IL-4、IL-5 水平呈正相關(guān)(r=0.76)，P 值均＜0.05。生理鹽水組IFN-γ 水平分別與IL-4、IL-5 水平呈負(fù)相關(guān)(r =-0.53，-0.62)，IL-4、IL-5 水平呈正相關(guān)(r =0.65)，P 值均＜0.05。見表3。

表3 小鼠血清細(xì)胞因子相關(guān)性分析Tab.3 Correlational analysis of cytokines in mice serum

2.4 黑斑蛤蚧與地塞米松的療效比較 IL-4 和IL-5 屬于Th2 系統(tǒng)的細(xì)胞因子，而IFN-γ 屬于Th1 系統(tǒng)的細(xì)胞因子。為比較蛤蚧在干預(yù)過程中對Th1/Th2 的影響，Th1/Th2 的平衡情況通過IFN-γ/ IL-4和IFN-γ/ IL-5 反映。如表4 所示，3 組比較，地塞米松干預(yù)組與黑斑蛤蚧干預(yù)組的IFN-γ/ IL-4 和IFN-γ/ IL-5 均比生理鹽水組有顯著升高 (P ＜0.05)，兩組間比較，地塞米松干預(yù)組較黑斑蛤蚧干預(yù)組有顯著升高(P ＜0.05)，而黑斑蛤蚧干預(yù)組較生理鹽水組有顯著提高(P ＜0.05)。

表4 黑斑蛤蚧與地塞米松的療效比較(±s)Tab.4 Comparison of therapeutic effects between blackspotted geckos and dexamethasone (±s)

表4 黑斑蛤蚧與地塞米松的療效比較(±s)Tab.4 Comparison of therapeutic effects between blackspotted geckos and dexamethasone (±s)

注:與生理鹽水組比較，* P ＜0.05;與黑斑蛤蚧干預(yù)組比較，ΔP ＜0.05

組別 動物數(shù) (IFN-γ/IL-4) (IFN-γ/IL-5)黑斑蛤蚧干預(yù)組 10 22.30 ±4.96* 14.27 ±1.62*地塞米松干預(yù)組 10 30.44 ±9.16* Δ 20.77 ±5.86* Δ生理鹽水組10 2.87 ±0.65 2.81 ±0.76

3 討論

目前認(rèn)為Th1/Th2 細(xì)胞平衡失調(diào)，機體正常的免疫耐受功能受損，從而導(dǎo)致免疫細(xì)胞及其成分對機體自身組織結(jié)構(gòu)和功能的破壞，是哮喘發(fā)病的基礎(chǔ)［7］。其失衡的程度與哮喘的發(fā)病關(guān)系密切。其中IFN-γ 及IL-4、IL-5 是調(diào)節(jié)Th1/Th2 細(xì)胞平衡重要細(xì)胞因子。IL-4 是Th2 細(xì)胞的特征性細(xì)胞因子，由Th0 細(xì)胞產(chǎn)生，誘導(dǎo)Th0 細(xì)胞向Th2 細(xì)胞轉(zhuǎn)化［8］，并且可調(diào)控Th1 細(xì)胞向Th2 細(xì)胞分化［9］。IL-5 主要調(diào)節(jié)嗜酸性粒細(xì)胞生長、分化及其活性的細(xì)胞因子。研究表明，在小鼠氣管內(nèi)注入IL-5 可引起肺嗜酸性粒細(xì)胞明顯增多及誘導(dǎo)氣道增生或化生的黏液細(xì)胞凋亡增加［10］。IFN-γ 對IL-4 的拮抗作用可能是通過阻斷GATA-3 的表達(dá)，抑制IL-4、IL-5 的合成從而降低體內(nèi)IgE 的水平［11］。在哮喘發(fā)生時，高水平的IL-5 在IL-4 條件下可促使Th0細(xì)胞向Th2 分化，并且可間接抑制Th1 分泌IFNγ、IL-2 等炎癥抑制因子，阻礙Th0 細(xì)胞向Th1 分化，造成Th1/Th2 的失衡而引發(fā)哮喘［12］。通過調(diào)節(jié)哮喘Th1 和Th2 細(xì)胞因子的平衡，從而逆轉(zhuǎn)Th1/Th2 失衡或許是治療哮喘的新途徑。

目前，哮喘的治療仍有爭議，糖皮質(zhì)激素治療是目前公認(rèn)的最有效的藥物治療，尤其是吸入糖皮質(zhì)激素可下調(diào)氣道上皮炎癥因子的表達(dá)［13］。雖然效果明顯，但是長期使用糖皮質(zhì)激素治療會產(chǎn)生嚴(yán)重的副作用。

本研究顯示，黑斑蛤蚧對哮喘小鼠進(jìn)行干預(yù)后，Th1 型細(xì)胞因子IFN-γ 水平顯著升高，而Th2型細(xì)胞因子IL-4、IL-5 水平顯著降低，并且IFN-γ和IL-4、IL-5 均呈現(xiàn)出負(fù)相關(guān)性，表明黑斑蛤蚧對哮喘模型小鼠外周血Th1/Th2 系統(tǒng)具有一定的免疫調(diào)節(jié)作用。同時研究數(shù)據(jù)也顯示，地塞米松干預(yù)組與黑斑蛤蚧干預(yù)組相比較，黑斑蛤蚧下調(diào)IL-4和IL-5 水平和上調(diào)IFN-γ 水平的作用均不及地塞米松。黑斑蛤蚧藥用部位是去除內(nèi)臟的全身，中醫(yī)認(rèn)為具有助陽益精、補肺益腎、納氣定喘的功效。近年來許多研究表明，蛤蚧具有抗腫瘤、平喘、性激素樣、抗炎等作用，本研究針對黑斑蛤蚧對哮喘模型的作用，初步探討其作用機制。對蛤蚧在哮喘治療中的免疫調(diào)節(jié)相關(guān)性還需作進(jìn)一步探討，明確其有效成分、劑量、療效，為臨床應(yīng)用提供實驗依據(jù)。

［1］ 袁經(jīng)權(quán)，李 力. 黑點蛤蚧與紅點蛤蚧的本草考證［J］. 中藥材，2008，31(9):1437-1439.

［2］ Trifilieff A，El-Hashim A，Bertrand C. Time course of inflammatory and remodeling events in a murine model of asthma:effect of steroid treatment［J］. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol，2000，279(6):L1120-L1128.

［3］ 商 艷，李 強，黃 怡，等. 不同劑量致敏原對小鼠過敏性哮喘模型的影響［J］. 第二軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報，2002，23(1):69-71.

［4］ 劉素芝，劉玉麗，曹國龍，等. 哮喘動物模型免疫炎癥反應(yīng)發(fā)生驗證的要點［J］. 中國組織工程研究與臨床康復(fù)，2007，11(29):5814-5816.

［5］ 張 於，戴愛國. 柴樸湯對支氣管哮喘豚鼠支氣管肺組織中Bcl-2 表達(dá)的影響［J］. 中國實驗方劑學(xué)雜志，2012，18(10):275-279.

［6］ 陳 賀，張慧穎，劉 禾，等. 復(fù)方川貝顆粒對OVA 介導(dǎo)的豚鼠過敏性哮喘模型的平喘作用機制研究［J］. 中國實驗方劑學(xué)雜志，2013，19(18):228-231.

［7］ McKee A S，Pearce E J. CD25+CD4+cells contribute to Th2 polarization during helminth infection by suppressing Th1 response development［J］. J Immunol，2004，173 (2):1224-1231.

［8］ Ryan J J，McReynolds L J，Keegan A，et al. Growth and gene expression are predominantly controlled by distinct regions of the human IL-4 receptor［J］. Immunity，1996，4(2):123-132.

［9］ Lambrecht B N，Hoogsteden H C，Pauwels R A. Dendritic cells as regulators of the immune response to inhaled allergen:recent findings in animal models of asthma［J］. In Arch Allergy immunol，2001，124(4):432-446.

［10］ Yamasaki M，Mizutani N，Sasaki K，et al. No involvement of interleukin-5 or eosinophils in experimental allergic rhinitis in guinea pigs［J］. Eur J Pharmacol，2002，439(1):159-169.

［11］ 黃 艷，陳吉泉，修清玉. 腹腔注射干擾素γ 對哮喘小鼠肺組織GATA-3 及氣道炎癥的影響［J］. 第二軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報，2005，26(10):1152-1156.

［12］ 謝 華，何韶衡，馬曉鋒，等. 急性哮喘患者血漿白細(xì)胞介素-18，白細(xì)胞介素-16，白細(xì)胞介素-4 及γ-干擾素水平的相關(guān)性研究及臨床意義［J］. 中國呼吸與危重監(jiān)護(hù)雜志，2004，3(6):398-400.

［13］ de Veerman M，Heirman C，van Meirvenne S，et al. Retrovirally transduced bone marrow-derived dendritic cells require CD4+T cell help to elicit protective and therapeutic antitumor immunity［J］. J Immunol，1999，162(1):144-151.