武 青， 袁 斌 ， 徐建亞， 周立華， 孔 飛， 張奕星

(1. 南京中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，江蘇 南京210029;2. 南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院兒科，江蘇 南京210029)

過(guò)敏性紫癜腎炎 (Henoch-Schonlein purpura nephritis)是兒科常見(jiàn)的繼發(fā)性腎病，一般認(rèn)為在過(guò)敏性紫癜患兒中有20% ～55%［1］可發(fā)生腎臟損傷。也有報(bào)道稱［2］，過(guò)敏性紫癜患兒患病6 個(gè)月后腎活檢示不同程度的腎損害幾乎占100%。本病大多預(yù)后良好，但部分病程遷延、少數(shù)還可發(fā)展至慢性腎功能不全［3］。目前西醫(yī)治療尚缺乏特異性方案，中醫(yī)藥在提高免疫力，改善蛋白尿等方面有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)。對(duì)免疫功能具有雙向調(diào)節(jié)作用［4］的中藥制劑槐杞黃顆粒是由槐耳菌質(zhì)配伍枸杞子、黃精制成的顆粒劑，具有益氣養(yǎng)陰之功效，臨床實(shí)驗(yàn)已證實(shí)其對(duì)改善微循環(huán)及減少尿蛋白有良好效果。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立過(guò)敏性紫癜腎炎大鼠模型，觀察槐杞黃顆粒對(duì)過(guò)敏性紫癜腎炎的大鼠蛋白尿及腎組織TGF-β1 表達(dá)的影響，探討槐杞黃顆粒治療過(guò)敏性紫癜腎炎的作用機(jī)制，以期為過(guò)敏性紫癜腎炎的臨床治療提供理論依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 選取健康清潔級(jí)6 周齡雄性SD 大鼠18 只(購(gòu)于南京青龍山動(dòng)物繁殖場(chǎng)，合格證號(hào):SCXKZ2009-0001)，體質(zhì)量約120 ～150 g，適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周，所有大鼠造模前兩次尿蛋白定性試驗(yàn)均呈陰性(試紙條法)。將大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為空白組、模型組和槐杞黃組，每組6 只。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)(第16 周末)處死所有大鼠。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物 牛血清白蛋白(BSA)、脂多糖(LPS)購(gòu)自美國(guó)Sigma 公司;四氯化碳(CCl4)、蓖麻油由南京頂?shù)律锟萍加邢薰咎峁?干姜及槐杞黃顆粒(啟東蓋天力藥業(yè)有限公司)由江蘇省中醫(yī)院提供。

1.3 主要實(shí)驗(yàn)器材 ELISA 試劑盒購(gòu)自美國(guó)R＆D公司;BCA 試劑盒購(gòu)自Thermo Pierce 公司;Trizol及逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量PCR 試劑盒均購(gòu)自TaKaRa 公司;PCR 內(nèi)參及引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。所有實(shí)驗(yàn)耗材及儀器均由南京中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)室提供。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 過(guò)敏性紫癜腎炎大鼠模型的建立 參考張曉強(qiáng)等［5］關(guān)于過(guò)敏性紫癜動(dòng)物模型的研制思路，綜合模擬IgA 腎病與血熱證動(dòng)物模型，復(fù)合成為過(guò)敏性紫癜腎炎大鼠模型。模型組及槐杞黃組運(yùn)用BSA灌胃，LPS 尾靜脈注射，結(jié)合CCl4皮下注射造就IgA 腎病模型。用蒸餾水配制10%免疫原BSA，隔天灌胃4 mL/kg，持續(xù)8 周;皮下注射蓖麻油0.3 mL+CCl40.1 mL，每周1 次，持續(xù)9 周;用等滲鹽水配制0.025% LPS，分別于第6、8、10、12 周尾靜脈注射0.2 mL;模型組同時(shí)造就血熱模型，復(fù)合為過(guò)敏性紫癜腎炎大鼠模型，于第9 周開(kāi)始隔天灌服25%干姜水10 mL/kg，建模期間室溫維持在30 ℃?？瞻捉M給予等量蒸餾水灌胃，等量等滲鹽水皮下注射及尾靜脈注射，環(huán)境溫度為室溫。至12 周末造模結(jié)束。

2.2 給藥方法及劑量 根據(jù)施新猷［6］動(dòng)物藥物劑量換算公式“大鼠劑量(mg/kg) = 成年人劑量(mg/kg) ×折算系數(shù)(6.25)”，槐杞黃組自第13周起灌服槐杞黃顆粒12.6 g/kg，配制為25%的溶液。每天早晚各1 次，連續(xù)4 周;空白組及模型組在第13 周起給予相應(yīng)等量蒸餾水灌胃。所有大鼠均予標(biāo)準(zhǔn)飲食。

2.3 血尿及蛋白尿檢測(cè) 實(shí)驗(yàn)結(jié)束(第16 周末)用代謝籠分別收集所有實(shí)驗(yàn)大鼠24 h 尿液，并記錄尿量。觀察肉眼血尿程度，并采用定量尿沉渣計(jì)數(shù)法檢測(cè)尿紅細(xì)胞個(gè)數(shù)，BCA 法檢測(cè)大鼠24 h 尿蛋白定量。

2.4 腎臟病理檢查 尿液收集后，用10%水合氯醛麻醉并處死所有實(shí)驗(yàn)大鼠，取出腎臟，并分離腎皮質(zhì)，用4%甲醛固定腎皮質(zhì)，常規(guī)石蠟包埋，切片厚4 ～5 μm，PAS 染色，光鏡下觀察腎組織病理改變。

2.5 ELISA 法檢測(cè)腎組織中TGF-β1 的水平 取各組腎組織，制成10%勻漿，采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA 法)檢測(cè)腎組織TGF-β1 水平，操作順序嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

2.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測(cè)腎皮質(zhì)TGF-β1 mRNA 的表達(dá) 以GAPDH 為內(nèi)參(內(nèi)參及引物序列見(jiàn)表1)。Trizol 抽提腎組織皮質(zhì)總RNA，紫外分光光度儀測(cè)RNA 濃度、A260/280 及A260/230，嚴(yán)格按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明配制逆轉(zhuǎn)錄試劑，將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，取2 μL cDNA 加入總體積為20 μL的PCR 反應(yīng)體系中(反應(yīng)液按試劑盒說(shuō)明配制)，7500 全自動(dòng)熒光定量PCR 儀按95 ℃，30 s;95 ℃，5 s;57 ℃，34 s;95 ℃，15 s;60 ℃，1 min;95 ℃，5 s 反應(yīng)條件循環(huán)40 次進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR 反應(yīng)，退火溫度為57 ℃。取各樣本CT 值，按(實(shí)驗(yàn)組目的基因-實(shí)驗(yàn)組內(nèi)參基因) - (空白組目的基因 - 空白組內(nèi)參基因)公式計(jì)算2 -ΔΔCT 值，以空白組為對(duì)照(空白組2 -ΔΔCT 值為1)，實(shí)驗(yàn)組2 -ΔΔCT 值≥2 認(rèn)為目的基因表達(dá)增加，實(shí)驗(yàn)組2 - ΔΔCT 值＜0.5 認(rèn)為表達(dá)下降，重復(fù)至少3 次以上用以統(tǒng)計(jì)。

表1 RT-PCR 引物序列Tab.1 Primer sequences of RT-PCR

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 17.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，正態(tài)分布數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，偏態(tài)分布用中位數(shù)(四分位間距)，即M (QR)表示。資料正態(tài)分布且方差齊時(shí)，采用單因素方差分析(One-Way ANOVA)，組間兩兩比較采用最小顯著差異法(LSD);資料偏態(tài)分布時(shí)，采用秩和檢驗(yàn)(Kruskal-Wallis)。以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

4.1 血尿及蛋白尿 3 組大鼠尿紅細(xì)胞計(jì)數(shù)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.009)，其中模型組和空白組相比，紅細(xì)胞計(jì)數(shù)明顯增高(P =0.013)，槐杞黃組較模型組紅細(xì)胞數(shù)量有減少趨勢(shì)，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.334);3 組大鼠24 h 尿蛋白定量不全相等(P = 0.018)，其中模型組顯著高于空白組(P=0.000)，槐杞黃組蛋白尿較模型組明顯緩解(P =0.016)。見(jiàn)表2 ［紅細(xì)胞計(jì)數(shù)呈偏態(tài)分布，數(shù)據(jù)用中位數(shù)(四分位間距)，即M (QR)表示;尿蛋白定量呈正態(tài)分布，數(shù)據(jù)用均數(shù)± 標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示］。

表2 大鼠尿紅細(xì)胞計(jì)數(shù)及24 h 尿蛋白定量Tab.2 Count of urinary red cells and 24-hour urinary protein quantity

4.2 光鏡下腎組織病理改變 光鏡下，空白組腎小球系膜、基底膜無(wú)增生，腎小球未見(jiàn)硬化;模型組可見(jiàn)腎小球系膜明顯增生，腎小管腫脹，伴見(jiàn)節(jié)段性腎小球硬化，腎小球血管襻坍陷，血管周圍有炎性細(xì)胞浸潤(rùn);槐杞黃組腎小球系膜增厚，但較模型組好轉(zhuǎn)，有少量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。見(jiàn)圖1。

圖1 各組大鼠腎組織病理(PAS 染色×200)Fig.1 Renal histopathology of each group (PAS staining×200)

4.3 ELISA 法檢測(cè)腎組織中TGF-β1 的水平 模型組大鼠腎組織皮質(zhì)TGF-β1 的水平較空白組明顯升高，槐杞黃組TGF-β1 的水平較模型組有所降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(前者P =0.005，后者P =0.042)，見(jiàn)表3。標(biāo)準(zhǔn)曲線圖見(jiàn)圖2。

圖2 ELISA 標(biāo)準(zhǔn)曲線圖Fig.2 Canonical plotting of ELISA

表3 腎組織中TGF-β1 測(cè)定Tab.3 TGF-β1 content in nephridial tissue

4.4 腎組織TGF-β1 mRNA 的表達(dá)( 見(jiàn)表4) 模型組大鼠腎組織皮質(zhì)TGF-β1 mRNA 的表達(dá)較空白組明顯提高，而槐杞黃組TGF-β1 mRNA 的表達(dá)較模型組顯著降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(前者P =0.026，后者P=0.040)。

表4 腎組織TGF-β1 mRNA 表達(dá)量2 - ΔΔ CTTab.4 2 - ΔΔ CT value of mRNA expression quantity about TGF-β1

5 討論

過(guò)敏性紫癜是一種由免疫復(fù)合物介導(dǎo)的系統(tǒng)性小血管炎，過(guò)敏性紫癜腎炎也屬免疫復(fù)合物性腎病，臨床以血尿和蛋白尿?yàn)橹?，多發(fā)生于皮膚紫癜后一個(gè)月內(nèi)，可以同時(shí)并見(jiàn)皮膚紫癜、腹痛、關(guān)節(jié)腫痛、便血等，有的僅是無(wú)癥狀性的尿異常。目前對(duì)于過(guò)敏性紫癜的發(fā)病機(jī)制，認(rèn)為與體內(nèi)免疫功能紊亂相關(guān)［7］，主要通過(guò)體液免疫，但也涉及細(xì)胞免疫，一些細(xì)胞因子和炎癥介質(zhì)，凝血機(jī)制均參與本病發(fā)病。

過(guò)敏性紫癜腎炎主要為系膜增生性腎小球腎炎，常伴節(jié)段性腎小球毛細(xì)血管袢壞死、新月體形成等血管炎表現(xiàn)。系膜細(xì)胞的增殖與細(xì)胞外基質(zhì)的過(guò)度沉積是各種系膜增殖性腎病的病理基礎(chǔ)。腎小球系膜細(xì)胞能分泌TGF-β1，TGF-β1 通過(guò)與系膜細(xì)胞上相應(yīng)的受體結(jié)合來(lái)調(diào)節(jié)其增殖速度和基質(zhì)蛋白的合成。不難看出，TGF-β1 是各種腎臟病(如腎間質(zhì)纖維化和腎小球硬化)發(fā)生、發(fā)展的必要因子，其最大特點(diǎn)是能夠使多種細(xì)胞停留在G1 期，從而抑制細(xì)胞生長(zhǎng)［8］。在體外，外源TGF-β1 可誘導(dǎo)正常的腎小球、腎小球膜和非腎細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞外間質(zhì)，且抑制蛋白酶的活性，同時(shí)其中和抗體可阻止大白鼠腎組織中細(xì)胞外基質(zhì)的積累［9］，因此，TGF-β1 過(guò)度產(chǎn)生在許多腎臟病中引起了不可逆的腎間質(zhì)纖維化［10］，抑制TGF-β1 表達(dá)是治療甚至預(yù)防其發(fā)生、發(fā)展的關(guān)鍵［11］。

目前西醫(yī)治療以激素和免疫抑制劑為主，但這種免疫性炎癥因?yàn)槭苊庖咭蜃拥挠绊?，?duì)炎癥的過(guò)度抑制或抑制不足都可能促進(jìn)炎癥的發(fā)展。使用外源性免疫抑制劑的劑量與組織的炎癥程度很難做到恰到好處，這為徹底控制炎癥帶來(lái)極大困難，效果也不十分理想。因此探索中藥對(duì)過(guò)敏性紫癜腎炎的治療具有很大的臨床價(jià)值。

本實(shí)驗(yàn)采用綜合模擬瘀熱證與IgA 腎病動(dòng)物模型，復(fù)合成為過(guò)敏性紫癜腎炎大鼠模型的造模方式，結(jié)果顯示模型組大鼠出現(xiàn)較為嚴(yán)重的血尿、蛋白尿，而且腎病理顯示腎小球系膜細(xì)胞增生及節(jié)段性腎小管硬化，間接免疫熒光及RT-PCR 均表現(xiàn)模型組腎組織皮質(zhì)TGF-β1 水平及TGF-β1 mRNA 表達(dá)升高，這都說(shuō)明了模型組大鼠存在腎損害，造模較成功。

中醫(yī)認(rèn)為，本病的病機(jī)除了瘀熱，還與氣陰虧損體質(zhì)密切相關(guān)。小兒腎常虛，腎陽(yáng)未充，封藏失司，陰精外泄，或腎病日久，溫陽(yáng)太過(guò)傷損于陰，腎水匱乏，水不涵木，肝腎陰虛火旺，灼傷血絡(luò)而見(jiàn)血尿，虛火迫血妄行，外溢肌膚而發(fā)紫癜，久病氣虛無(wú)以固腎，精微下泄則產(chǎn)生蛋白尿［12］。而且腎臟疾病通過(guò)激素治療后往往加重氣陰虧損表現(xiàn)。精不化氣而化水，水停則氣阻，氣滯則血瘀，氣陰虧損，無(wú)力推動(dòng)血液運(yùn)行，加重血行瘀阻而致血瘀的癥狀，而血不利則病水，形成惡性循環(huán)。氣陰虧損若能得到改善，氣行推動(dòng)血行，血瘀癥狀也將有所好轉(zhuǎn)，這和槐杞黃顆粒臨床研究中提示其能改善微循環(huán)的結(jié)論是一致的。所以益氣養(yǎng)陰法為治療過(guò)敏性紫癜腎炎的方法之一?；辫近S顆粒以功擅益氣強(qiáng)壯的槐耳為君藥，配合臣藥枸杞子滋養(yǎng)腎陰、黃精補(bǔ)氣而兼潤(rùn)養(yǎng)，藥均和平，平補(bǔ)氣陰，平中寓奇，共奏益氣養(yǎng)陰之功，有效改善微循環(huán)及過(guò)敏性紫癜腎炎大鼠蛋白尿水平。

結(jié)合本實(shí)驗(yàn)，槐杞黃組TGF-β1 及TGF-β1 mRNA 表達(dá)顯著低于模型組，說(shuō)明槐杞黃顆粒的益氣養(yǎng)陰之功能有效下調(diào)TGF-β1 mRNA 的表達(dá)，TGF-β1 的水平下降也體現(xiàn)在槐杞黃組腎小球系膜增厚、節(jié)段性腎小球硬化及血管周圍有炎性細(xì)胞浸潤(rùn)等病理表現(xiàn)都較模型組好轉(zhuǎn)，而病理表現(xiàn)從另一方面也充分證明了槐杞黃顆?？梢源龠M(jìn)組織修復(fù)，有效減少微循環(huán)梗塞，延緩過(guò)敏性紫癜腎炎的進(jìn)展，減少蛋白尿。作為中藥復(fù)方制劑，槐杞黃顆粒成分相對(duì)復(fù)雜，目前應(yīng)用的方法不能對(duì)全部(或大部分)成分進(jìn)行研究和觀察，且作用機(jī)制比較復(fù)雜［13］，需進(jìn)一步研究，當(dāng)然，有效成分組的研究還存在許多尚解決的問(wèn)題，如選擇生物活性檢測(cè)的指標(biāo)，分析活性篩選的結(jié)果，多種活性成分的綜合分析以及作用機(jī)理研究等等，都有待在實(shí)踐中進(jìn)行探討［14-15］。另外，因過(guò)敏性紫癜腎炎動(dòng)物模型還不成熟且該實(shí)驗(yàn)樣本較少，益氣養(yǎng)陰法是否通過(guò)其他通路途徑改善過(guò)敏性紫癜腎炎腎損害及其糾正腎損害的具體機(jī)制還需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究。而且試驗(yàn)中槐杞黃組血尿水平雖較模型組降低，但不具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，因此槐杞黃顆粒能否改善血尿水平亦有待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

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