武 青， 袁 斌 ， 徐建亞， 周立華， 孔 飛， 張奕星

(1. 南京中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，江蘇 南京210029;2. 南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院兒科，江蘇 南京210029)

過敏性紫癜腎炎 (Henoch-Schonlein purpura nephritis)是兒科常見的繼發(fā)性腎病，一般認(rèn)為在過敏性紫癜患兒中有20% ～55%［1］可發(fā)生腎臟損傷。也有報(bào)道稱［2］，過敏性紫癜患兒患病6 個月后腎活檢示不同程度的腎損害幾乎占100%。本病大多預(yù)后良好，但部分病程遷延、少數(shù)還可發(fā)展至慢性腎功能不全［3］。目前西醫(yī)治療尚缺乏特異性方案，中醫(yī)藥在提高免疫力，改善蛋白尿等方面有獨(dú)特優(yōu)勢。對免疫功能具有雙向調(diào)節(jié)作用［4］的中藥制劑槐杞黃顆粒是由槐耳菌質(zhì)配伍枸杞子、黃精制成的顆粒劑，具有益氣養(yǎng)陰之功效，臨床實(shí)驗(yàn)已證實(shí)其對改善微循環(huán)及減少尿蛋白有良好效果。本實(shí)驗(yàn)通過建立過敏性紫癜腎炎大鼠模型，觀察槐杞黃顆粒對過敏性紫癜腎炎的大鼠蛋白尿及腎組織TGF-β1 表達(dá)的影響，探討槐杞黃顆粒治療過敏性紫癜腎炎的作用機(jī)制，以期為過敏性紫癜腎炎的臨床治療提供理論依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動物及分組 選取健康清潔級6 周齡雄性SD 大鼠18 只(購于南京青龍山動物繁殖場，合格證號:SCXKZ2009-0001)，體質(zhì)量約120 ～150 g，適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周，所有大鼠造模前兩次尿蛋白定性試驗(yàn)均呈陰性(試紙條法)。將大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為空白組、模型組和槐杞黃組，每組6 只。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(第16 周末)處死所有大鼠。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物 牛血清白蛋白(BSA)、脂多糖(LPS)購自美國Sigma 公司;四氯化碳(CCl4)、蓖麻油由南京頂?shù)律锟萍加邢薰咎峁?干姜及槐杞黃顆粒(啟東蓋天力藥業(yè)有限公司)由江蘇省中醫(yī)院提供。

1.3 主要實(shí)驗(yàn)器材 ELISA 試劑盒購自美國R＆D公司;BCA 試劑盒購自Thermo Pierce 公司;Trizol及逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量PCR 試劑盒均購自TaKaRa 公司;PCR 內(nèi)參及引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。所有實(shí)驗(yàn)耗材及儀器均由南京中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)室提供。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 過敏性紫癜腎炎大鼠模型的建立 參考張曉強(qiáng)等［5］關(guān)于過敏性紫癜動物模型的研制思路，綜合模擬IgA 腎病與血熱證動物模型，復(fù)合成為過敏性紫癜腎炎大鼠模型。模型組及槐杞黃組運(yùn)用BSA灌胃，LPS 尾靜脈注射，結(jié)合CCl4皮下注射造就IgA 腎病模型。用蒸餾水配制10%免疫原BSA，隔天灌胃4 mL/kg，持續(xù)8 周;皮下注射蓖麻油0.3 mL+CCl40.1 mL，每周1 次，持續(xù)9 周;用等滲鹽水配制0.025% LPS，分別于第6、8、10、12 周尾靜脈注射0.2 mL;模型組同時造就血熱模型，復(fù)合為過敏性紫癜腎炎大鼠模型，于第9 周開始隔天灌服25%干姜水10 mL/kg，建模期間室溫維持在30 ℃。空白組給予等量蒸餾水灌胃，等量等滲鹽水皮下注射及尾靜脈注射，環(huán)境溫度為室溫。至12 周末造模結(jié)束。

2.2 給藥方法及劑量 根據(jù)施新猷［6］動物藥物劑量換算公式“大鼠劑量(mg/kg) = 成年人劑量(mg/kg) ×折算系數(shù)(6.25)”，槐杞黃組自第13周起灌服槐杞黃顆粒12.6 g/kg，配制為25%的溶液。每天早晚各1 次，連續(xù)4 周;空白組及模型組在第13 周起給予相應(yīng)等量蒸餾水灌胃。所有大鼠均予標(biāo)準(zhǔn)飲食。

2.3 血尿及蛋白尿檢測 實(shí)驗(yàn)結(jié)束(第16 周末)用代謝籠分別收集所有實(shí)驗(yàn)大鼠24 h 尿液，并記錄尿量。觀察肉眼血尿程度，并采用定量尿沉渣計(jì)數(shù)法檢測尿紅細(xì)胞個數(shù)，BCA 法檢測大鼠24 h 尿蛋白定量。

2.4 腎臟病理檢查 尿液收集后，用10%水合氯醛麻醉并處死所有實(shí)驗(yàn)大鼠，取出腎臟，并分離腎皮質(zhì)，用4%甲醛固定腎皮質(zhì)，常規(guī)石蠟包埋，切片厚4 ～5 μm，PAS 染色，光鏡下觀察腎組織病理改變。

2.5 ELISA 法檢測腎組織中TGF-β1 的水平 取各組腎組織，制成10%勻漿，采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA 法)檢測腎組織TGF-β1 水平，操作順序嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。

2.6 實(shí)時熒光定量PCR 檢測腎皮質(zhì)TGF-β1 mRNA 的表達(dá) 以GAPDH 為內(nèi)參(內(nèi)參及引物序列見表1)。Trizol 抽提腎組織皮質(zhì)總RNA，紫外分光光度儀測RNA 濃度、A260/280 及A260/230，嚴(yán)格按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明配制逆轉(zhuǎn)錄試劑，將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，取2 μL cDNA 加入總體積為20 μL的PCR 反應(yīng)體系中(反應(yīng)液按試劑盒說明配制)，7500 全自動熒光定量PCR 儀按95 ℃，30 s;95 ℃，5 s;57 ℃，34 s;95 ℃，15 s;60 ℃，1 min;95 ℃，5 s 反應(yīng)條件循環(huán)40 次進(jìn)行實(shí)時定量PCR 反應(yīng)，退火溫度為57 ℃。取各樣本CT 值，按(實(shí)驗(yàn)組目的基因-實(shí)驗(yàn)組內(nèi)參基因) - (空白組目的基因 - 空白組內(nèi)參基因)公式計(jì)算2 -ΔΔCT 值，以空白組為對照(空白組2 -ΔΔCT 值為1)，實(shí)驗(yàn)組2 -ΔΔCT 值≥2 認(rèn)為目的基因表達(dá)增加，實(shí)驗(yàn)組2 - ΔΔCT 值＜0.5 認(rèn)為表達(dá)下降，重復(fù)至少3 次以上用以統(tǒng)計(jì)。

表1 RT-PCR 引物序列Tab.1 Primer sequences of RT-PCR

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 17.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，正態(tài)分布數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，偏態(tài)分布用中位數(shù)(四分位間距)，即M (QR)表示。資料正態(tài)分布且方差齊時，采用單因素方差分析(One-Way ANOVA)，組間兩兩比較采用最小顯著差異法(LSD);資料偏態(tài)分布時，采用秩和檢驗(yàn)(Kruskal-Wallis)。以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

4.1 血尿及蛋白尿 3 組大鼠尿紅細(xì)胞計(jì)數(shù)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.009)，其中模型組和空白組相比，紅細(xì)胞計(jì)數(shù)明顯增高(P =0.013)，槐杞黃組較模型組紅細(xì)胞數(shù)量有減少趨勢，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.334);3 組大鼠24 h 尿蛋白定量不全相等(P = 0.018)，其中模型組顯著高于空白組(P=0.000)，槐杞黃組蛋白尿較模型組明顯緩解(P =0.016)。見表2 ［紅細(xì)胞計(jì)數(shù)呈偏態(tài)分布，數(shù)據(jù)用中位數(shù)(四分位間距)，即M (QR)表示;尿蛋白定量呈正態(tài)分布，數(shù)據(jù)用均數(shù)± 標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示］。

表2 大鼠尿紅細(xì)胞計(jì)數(shù)及24 h 尿蛋白定量Tab.2 Count of urinary red cells and 24-hour urinary protein quantity

4.2 光鏡下腎組織病理改變 光鏡下，空白組腎小球系膜、基底膜無增生，腎小球未見硬化;模型組可見腎小球系膜明顯增生，腎小管腫脹，伴見節(jié)段性腎小球硬化，腎小球血管襻坍陷，血管周圍有炎性細(xì)胞浸潤;槐杞黃組腎小球系膜增厚，但較模型組好轉(zhuǎn)，有少量炎癥細(xì)胞浸潤。見圖1。

圖1 各組大鼠腎組織病理(PAS 染色×200)Fig.1 Renal histopathology of each group (PAS staining×200)

4.3 ELISA 法檢測腎組織中TGF-β1 的水平 模型組大鼠腎組織皮質(zhì)TGF-β1 的水平較空白組明顯升高，槐杞黃組TGF-β1 的水平較模型組有所降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(前者P =0.005，后者P =0.042)，見表3。標(biāo)準(zhǔn)曲線圖見圖2。

圖2 ELISA 標(biāo)準(zhǔn)曲線圖Fig.2 Canonical plotting of ELISA

表3 腎組織中TGF-β1 測定Tab.3 TGF-β1 content in nephridial tissue

4.4 腎組織TGF-β1 mRNA 的表達(dá)( 見表4) 模型組大鼠腎組織皮質(zhì)TGF-β1 mRNA 的表達(dá)較空白組明顯提高，而槐杞黃組TGF-β1 mRNA 的表達(dá)較模型組顯著降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(前者P =0.026，后者P=0.040)。

表4 腎組織TGF-β1 mRNA 表達(dá)量2 - ΔΔ CTTab.4 2 - ΔΔ CT value of mRNA expression quantity about TGF-β1

5 討論

過敏性紫癜是一種由免疫復(fù)合物介導(dǎo)的系統(tǒng)性小血管炎，過敏性紫癜腎炎也屬免疫復(fù)合物性腎病，臨床以血尿和蛋白尿?yàn)橹?，多發(fā)生于皮膚紫癜后一個月內(nèi)，可以同時并見皮膚紫癜、腹痛、關(guān)節(jié)腫痛、便血等，有的僅是無癥狀性的尿異常。目前對于過敏性紫癜的發(fā)病機(jī)制，認(rèn)為與體內(nèi)免疫功能紊亂相關(guān)［7］，主要通過體液免疫，但也涉及細(xì)胞免疫，一些細(xì)胞因子和炎癥介質(zhì)，凝血機(jī)制均參與本病發(fā)病。

過敏性紫癜腎炎主要為系膜增生性腎小球腎炎，常伴節(jié)段性腎小球毛細(xì)血管袢壞死、新月體形成等血管炎表現(xiàn)。系膜細(xì)胞的增殖與細(xì)胞外基質(zhì)的過度沉積是各種系膜增殖性腎病的病理基礎(chǔ)。腎小球系膜細(xì)胞能分泌TGF-β1，TGF-β1 通過與系膜細(xì)胞上相應(yīng)的受體結(jié)合來調(diào)節(jié)其增殖速度和基質(zhì)蛋白的合成。不難看出，TGF-β1 是各種腎臟病(如腎間質(zhì)纖維化和腎小球硬化)發(fā)生、發(fā)展的必要因子，其最大特點(diǎn)是能夠使多種細(xì)胞停留在G1 期，從而抑制細(xì)胞生長［8］。在體外，外源TGF-β1 可誘導(dǎo)正常的腎小球、腎小球膜和非腎細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞外間質(zhì)，且抑制蛋白酶的活性，同時其中和抗體可阻止大白鼠腎組織中細(xì)胞外基質(zhì)的積累［9］，因此，TGF-β1 過度產(chǎn)生在許多腎臟病中引起了不可逆的腎間質(zhì)纖維化［10］，抑制TGF-β1 表達(dá)是治療甚至預(yù)防其發(fā)生、發(fā)展的關(guān)鍵［11］。

目前西醫(yī)治療以激素和免疫抑制劑為主，但這種免疫性炎癥因?yàn)槭苊庖咭蜃拥挠绊?，對炎癥的過度抑制或抑制不足都可能促進(jìn)炎癥的發(fā)展。使用外源性免疫抑制劑的劑量與組織的炎癥程度很難做到恰到好處，這為徹底控制炎癥帶來極大困難，效果也不十分理想。因此探索中藥對過敏性紫癜腎炎的治療具有很大的臨床價值。

本實(shí)驗(yàn)采用綜合模擬瘀熱證與IgA 腎病動物模型，復(fù)合成為過敏性紫癜腎炎大鼠模型的造模方式，結(jié)果顯示模型組大鼠出現(xiàn)較為嚴(yán)重的血尿、蛋白尿，而且腎病理顯示腎小球系膜細(xì)胞增生及節(jié)段性腎小管硬化，間接免疫熒光及RT-PCR 均表現(xiàn)模型組腎組織皮質(zhì)TGF-β1 水平及TGF-β1 mRNA 表達(dá)升高，這都說明了模型組大鼠存在腎損害，造模較成功。

中醫(yī)認(rèn)為，本病的病機(jī)除了瘀熱，還與氣陰虧損體質(zhì)密切相關(guān)。小兒腎常虛，腎陽未充，封藏失司，陰精外泄，或腎病日久，溫陽太過傷損于陰，腎水匱乏，水不涵木，肝腎陰虛火旺，灼傷血絡(luò)而見血尿，虛火迫血妄行，外溢肌膚而發(fā)紫癜，久病氣虛無以固腎，精微下泄則產(chǎn)生蛋白尿［12］。而且腎臟疾病通過激素治療后往往加重氣陰虧損表現(xiàn)。精不化氣而化水，水停則氣阻，氣滯則血瘀，氣陰虧損，無力推動血液運(yùn)行，加重血行瘀阻而致血瘀的癥狀，而血不利則病水，形成惡性循環(huán)。氣陰虧損若能得到改善，氣行推動血行，血瘀癥狀也將有所好轉(zhuǎn)，這和槐杞黃顆粒臨床研究中提示其能改善微循環(huán)的結(jié)論是一致的。所以益氣養(yǎng)陰法為治療過敏性紫癜腎炎的方法之一?；辫近S顆粒以功擅益氣強(qiáng)壯的槐耳為君藥，配合臣藥枸杞子滋養(yǎng)腎陰、黃精補(bǔ)氣而兼潤養(yǎng)，藥均和平，平補(bǔ)氣陰，平中寓奇，共奏益氣養(yǎng)陰之功，有效改善微循環(huán)及過敏性紫癜腎炎大鼠蛋白尿水平。

結(jié)合本實(shí)驗(yàn)，槐杞黃組TGF-β1 及TGF-β1 mRNA 表達(dá)顯著低于模型組，說明槐杞黃顆粒的益氣養(yǎng)陰之功能有效下調(diào)TGF-β1 mRNA 的表達(dá)，TGF-β1 的水平下降也體現(xiàn)在槐杞黃組腎小球系膜增厚、節(jié)段性腎小球硬化及血管周圍有炎性細(xì)胞浸潤等病理表現(xiàn)都較模型組好轉(zhuǎn)，而病理表現(xiàn)從另一方面也充分證明了槐杞黃顆?？梢源龠M(jìn)組織修復(fù)，有效減少微循環(huán)梗塞，延緩過敏性紫癜腎炎的進(jìn)展，減少蛋白尿。作為中藥復(fù)方制劑，槐杞黃顆粒成分相對復(fù)雜，目前應(yīng)用的方法不能對全部(或大部分)成分進(jìn)行研究和觀察，且作用機(jī)制比較復(fù)雜［13］，需進(jìn)一步研究，當(dāng)然，有效成分組的研究還存在許多尚解決的問題，如選擇生物活性檢測的指標(biāo)，分析活性篩選的結(jié)果，多種活性成分的綜合分析以及作用機(jī)理研究等等，都有待在實(shí)踐中進(jìn)行探討［14-15］。另外，因過敏性紫癜腎炎動物模型還不成熟且該實(shí)驗(yàn)樣本較少，益氣養(yǎng)陰法是否通過其他通路途徑改善過敏性紫癜腎炎腎損害及其糾正腎損害的具體機(jī)制還需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究。而且試驗(yàn)中槐杞黃組血尿水平雖較模型組降低，但不具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，因此槐杞黃顆粒能否改善血尿水平亦有待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

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