徐 莉

(武漢市中南干休所醫(yī)務(wù)室，湖北 武漢 430071)

近年來的研究表明腦出血(intracerebral hemorrhage，ICH)后血腫四周存在明顯的炎癥反應(yīng)，炎癥反應(yīng)在腦出血繼發(fā)性腦損傷中起著十分重要的作用［1］。研究發(fā)現(xiàn)，補體系統(tǒng)在腦損傷炎癥反應(yīng)過程中起著重要作用［2］。本實驗通過觀察不同時間段高血壓腦出血大鼠腦組織含水量、腦組織C9 表達和NO 水平，以探討其與腦損傷程度的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 動物分組與造模

大鼠由湖北省動物實驗中心提供，合格證號:SCXK(鄂)2011～012;分組:將96 只大鼠隨機分為均等的3 部分(每部分32 只)，分別用于腦組織含水量測定、腦組織NO 水平測定和C9 表達檢測。每部分又隨機分為假手術(shù)組、模型組共2組，每組16 只;每個小組16 只大鼠再4 個為一組，分別觀察術(shù)后2h、12、24、72h 四個時間點各項指標(biāo)，各組飼養(yǎng)條件相同。

高血壓模型及腦出血模型的制備是通過應(yīng)用雙腎雙夾法來復(fù)制腎性高血壓大鼠(RHR)模型。剔除飼養(yǎng)過程期間出現(xiàn)腦卒中癥狀和體征的大鼠。雙腎雙夾術(shù)后2～3 月體質(zhì)量300～350g/只的高血壓大鼠參照Rosenberg［3］的方法，術(shù)前禁食，可自由飲水，大鼠用戊巴比妥(0.1ml/100g)注射液腹腔麻醉后俯臥位固定于立體定位儀上，據(jù)圖譜調(diào)整立體定位儀于注射點，頭皮正中常規(guī)消毒后矢狀位切開約1.5cm，暴露前囟點，用骨鉆鉆顱打孔(直徑約1mm)后，用微量進樣器吸取膠原酶2μl 迅速插入鉆好的孔內(nèi)，進針5mm，注射時間不少于15min，且留針10min 后緩慢退針，鉆孔處用骨蠟封閉，局部消毒后，縫合皮膚。

1.1.2 藥品與儀器

注射用尿激酶(03290，南京南大藥業(yè)有限責(zé)任公司)，配制成200IU/L 的溶液;兔抗大鼠C9 免疫組化試劑盒(上海恒遠生化試劑有限公司);NO試劑盒來自南京建成生物工程研究所。儀器:大鼠腦立體定位儀，微量注射儀購于北京智鼠多寶生物科技有限責(zé)任公司;電子天平(SARTOR2US，BP211D)，德國生產(chǎn);8021 離心機(上海手術(shù)器械廠);752 分光光度儀(上海精密儀器儀表有限公司);半自動免疫組化儀(常州市郝思琳醫(yī)用儀器有限公司);計算機病理圖像管理系統(tǒng)4.10(北航圖像中心)。

1.2 方法

分別于術(shù)后第2、12、24 及72h，用10%水合氯醛麻醉大鼠后，迅速取出全腦，并用濾紙吸干腦表面液體和血跡，一部分置于中性福爾馬林內(nèi)固定作HE 染色和免疫組化染色。另一部分用于腦組織含水量測定。

1.2.1 腦組織含水量測定［4］

將樣本小塑料封口袋密閉，置-20 ℃冰箱內(nèi)5～10 min 微凍硬后取出，置于薄膜隔開的干冰上，用薄刀片切取離膠原酶注入點4mm 以外的2mm 厚冠狀腦片，分離出血側(cè)皮質(zhì)及基底節(jié)，置濃硫酸處理過的稱量杯內(nèi)。用電子天平稱取濕重后，置小玻璃瓶中，再放入105℃烤箱內(nèi)烘烤24～48h，直到稱重為恒重。根據(jù)Eliott 公式可以計算腦組織含水量(Water Content，WC)

1.2.2 腦組織C9 表達測定

分別于第2、12、24、72h 手術(shù)，取腦組織，固定:C9 著色于細(xì)胞漿和細(xì)胞膜。采用兔抗大鼠C9 免疫組化試劑合，按試劑盒要求檢測。在免疫組化陽性細(xì)胞胞漿及胞膜可見棕黃色顆粒。緊貼血腫周圍但不包括血腫區(qū)切片，每張切片隨機取4 個不重復(fù)高倍視野(400 倍)，計數(shù)每個高倍視野下陽性細(xì)胞數(shù)。所有切片均在同等強度下、同等放大倍數(shù)下分析，取每一時間點高倍視野下的陽性細(xì)胞數(shù)平均數(shù)，結(jié)果用表示。

1.2.3 NO 測定

分別于第2、12、24、72h 手術(shù)，微凍硬后取出，置薄膜隔開的干冰上，分離出血側(cè)皮質(zhì)及基底節(jié)，4℃下用預(yù)冷的勻漿介質(zhì)制備成10%的腦勻漿置3000r/min 離心15min 后，取腦勻漿上清液，按硝基還原酶法測定NO 的含量，嚴(yán)格按照試劑盒說明書進行操作。

1.3 統(tǒng)計方法

2 結(jié)果

2.1 大鼠腦組織含量變化

從表1 可見，與假手術(shù)組相比，ICH組腦組織含水量從2h 開始增加，12h 增加較為明顯(P ＜0.05)，24～72h 增加最明顯(P ＜0.01)。

表1 大鼠腦組織含水量(，%)

表1 大鼠腦組織含水量(，%)

與假手術(shù)組比較，* P ＜0.05、＊＊P ＜0.01

2.2 大鼠腦組織C9 表達結(jié)果

腦出血后2h 血腫周圍可見少量C9 表達，陽性細(xì)胞為小膠質(zhì)細(xì)胞(P ＞0.05)，腦出血后12h增加明顯，24h 達到高峰(P ＜0.01)，主要為小膠質(zhì)細(xì)胞和少量的神經(jīng)元細(xì)胞，血管內(nèi)皮細(xì)胞亦可表達，一直持續(xù)到72h?？梢?，腦出血后24～72h，C9 的表達處于高峰，與假手術(shù)組比較有顯著性差異。見表2。

表2 大鼠腦組織補體C9 表達(，個)

表2 大鼠腦組織補體C9 表達(，個)

與假手術(shù)組比較，* P ＜0.05、＊＊P ＜0.01

2.3 大鼠腦組織中NO 含量的結(jié)果

與假手術(shù)組比較，ICH組大鼠2h 腦組織NO含量已有下降，12h 已有顯著性差異(P ＜0.05)，24～72h 處于低水平(P ＜0.01)。

表3 大鼠腦組織NO 含量的變化(，μmol/L)

表3 大鼠腦組織NO 含量的變化(，μmol/L)

與假手術(shù)組比較，* P ＜0.05、＊＊P ＜0.01

3 討論

在腦出血的病理發(fā)展過程中，腦組織繼發(fā)性損傷是腦出血病情加重、預(yù)后不良的重要因素［5］。出血性腦損傷的炎性反應(yīng)，由白細(xì)胞粘附血管壁，血-腦屏障遭破壞、炎性細(xì)胞侵入腦實質(zhì)等組成。腦出血時炎性因子表達增加，能增加腦水腫、血管壁通透性。NO 是由血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌的強有力的血管舒張因子，可以直接作用于平滑肌細(xì)胞，通過激活鳥苷酸環(huán)化酶，使細(xì)胞內(nèi)的游離鈣水平降低，平滑肌松弛。腦部血流是由內(nèi)皮衍生的NO調(diào)節(jié)的，NO 還是紅細(xì)胞聚集性的重要影響因素［6］。NO 可通過抑制白細(xì)胞-內(nèi)皮細(xì)胞粘附、阻止血小板凝集和疏通組織灌注等限制缺血性腦損傷［7］。本實驗中與假手術(shù)組比較，ICH組大鼠2h腦組織NO 含量已有下降，12h 已有差異(P ＜0.05)，24～72h 處于較低水平(P ＜0.01)，說明腦出血急性期NO 下降是導(dǎo)致紅細(xì)胞聚集，進而溶解破裂、血腫形成的重要因素，因而治療中改善微循環(huán)是重要環(huán)節(jié)。腦出血后腦水腫主要分為血管源性腦水腫和細(xì)胞毒性腦水腫，血管源性腦水腫常發(fā)生于腦出血早期，它的形成原因主要有血管壁通透性增加、血管損傷、血漿外滲及血腦屏障破壞［8］。腦出血后補體級聯(lián)被激活，C9 表達增加，補體C9-C5b組成膜攻擊復(fù)合物(MAC)，MAC 是大分子復(fù)合物，可形成跨膜孔道使大分子物質(zhì)和離子雙向流動，進而攻擊神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞和血腫內(nèi)的紅細(xì)胞，加劇ICH 后腦損傷，MAC 也可直接插入星形膠質(zhì)細(xì)胞、神經(jīng)元和內(nèi)皮細(xì)胞，破壞血腦屏障。實驗表明腦出血后24～72h，C9 的表達處于高峰，說明在腦出血后腦水腫尤其在血管源性腦水腫中補體系統(tǒng)對于其發(fā)展起著重要作用。

［1］聶亞雄，王東，張雄，等.三七總皂苷注射液對腦出血大鼠腦水腫的影響［J］.中國中西醫(yī)結(jié)合雜志，2006，26(10):922

［2］Hua Y，Xi G，Keep RF，et al.Complement activation in the brain after experimental intracerebral hemorhage［J］.J Neurosurg，2000，92(6):1016

［3］Rosenberg GA，Mun-Bryce S，Kornfeld M，et al.Colla-genase induced intracerebral hemorrhage in rats［J］.Stroke，1990，21(5):801

［4］Guohua Xi，Ya Hue，Keep RF，et al.Activation of p44/42 mitogen activated protein kinase in thrombin-induced brain tolerance［J］.Brain Res，2001，(895):153

［5］Keep RF，Xi G，Hua Y，et al.The deleterious or beneficial effects of different agents in intracerebral hemorrhage:think big，think small or is hematoma size important［J］.Stroke，2005，36(7):1594

［6］Beridze M，Momtsehdze N，Shakarishvili R，et al.Effect of nitric oxide initial blood levels on erythroeyte aggrega-bility during 1 2 houm from ischemic stroke onset［J］.Clinical Hemorheology and Microcirculation，2004，30:403

［7］Cosentino F，Rubaattu S，Savoia C，et al.Endothelial dysfunction and stroke［J］.J Cardiovasc Pharmacol，2001，38(Suppl 2):75

［8］Nakam ura T，Xi G，Park JW，et al.Holo-transferrin and thrombin can interact to cause brain dam age［J］.Stroke，2005，36(2):348