何慧蓉，黃 藝，鄧選利，但 梅，劉德兵，阮尚全，2*

1內(nèi)江師范學(xué)院化學(xué)化工學(xué)院;2 四川省高等學(xué)校果類(lèi)廢棄物資源化重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，內(nèi)江 641112

苧麻為蕁麻科苧麻屬多年草本植物，是一種重要的纖維性經(jīng)濟(jì)作物，在我國(guó)具有豐富的自然資源，被稱(chēng)為“中國(guó)草”，主要用作紡織工業(yè)原料，其產(chǎn)量占世界總產(chǎn)量的80%，四川達(dá)州因原麻品質(zhì)優(yōu)良已成為苧麻加工企業(yè)競(jìng)相購(gòu)買(mǎi)的優(yōu)質(zhì)原料［1-3］。苧麻副產(chǎn)物苧麻皮通常是被作為廢棄物處理，因其纖維強(qiáng)度較高，既浪費(fèi)資源又污染環(huán)境，因此將其資源化具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和生態(tài)價(jià)值。黃酮類(lèi)化合物是一類(lèi)低分子量而廣泛分布于植物界多的天然植物成分，為植物多酚類(lèi)的代謝產(chǎn)物，因具有很好的清除自由基和抗氧化能力，對(duì)抗癌腫瘤、內(nèi)分泌調(diào)節(jié)具良好的作用，受到國(guó)內(nèi)外學(xué)者高度重視［4，5］。本實(shí)驗(yàn)采用雙水相-微波輻射提取了苧麻皮中的黃酮，建立了苧麻皮中黃酮提取的新方法，并對(duì)萃取物清除超氧陰離子自由基、羥基自由基的能力進(jìn)行了初步實(shí)驗(yàn)，對(duì)苧麻生產(chǎn)中的廢棄物利用具有重要的實(shí)際意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實(shí)驗(yàn)所用苧麻皮采于達(dá)州市大竹縣。蘆丁(BR)、亞硝酸鈉、硝酸鋁、無(wú)水乙醇、氫氧化鈉、硫酸亞鐵、雙氧水、水楊酸、三羥甲基氨基甲烷、乙二胺四乙酸二鈉均為分析純。

1.2 主要儀器與設(shè)備

Uwave-1000 微波.紫外.超聲波三位一體合成萃取反應(yīng)儀(上海新儀);T6 新世紀(jì)紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(北京普析);TD-5 臺(tái)式低速離心機(jī)(四川蜀科);DFT-100 型中藥粉碎機(jī)(溫嶺);AE240 電子分析天平(梅特勒-托利多)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 工藝流程

苧麻皮→烘干→粉碎→過(guò)篩→微波提取→分離→定容→顯色→測(cè)定。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)樣品0.0200 g 于100 mL 容量瓶，用30%乙醇溶解并定容，取上述溶液0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0 mL 于25 mL 比色管中，采用文獻(xiàn)［6］方法測(cè)定。以吸光度A 為縱坐標(biāo)，蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度(μg/mL)為橫坐標(biāo)，用最小二乘法作線性回歸曲線。實(shí)驗(yàn)測(cè)得標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為:A=0.0114C-0.0019，相關(guān)系數(shù)R2=0.9993，蘆丁濃度在8.0～56.0 μg/mL 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

1.3.3 黃酮的提取

烘干粉碎樣品，準(zhǔn)確稱(chēng)取1.000 g，加入30 mL 40%的乙醇溶液和硫酸銨0.2 g/mL 形成雙水相，于微波中提取，微波功率為200 W，微波時(shí)間為120 s，離心分離，離心液用蒸餾水定容制成100 mL。取2 mL 溶液于比色管中，加入30%乙醇8 mL，加入5%的亞硝酸鈉溶液1.0 mL，6 min 后加入10%硝酸鋁溶液1.0 mL，6 min 后加4%氫氧化鈉溶液10.0 mL，用蒸餾水定容搖勻，于波長(zhǎng)511 nm 處測(cè)定吸光度。

1.3.4 抗氧化性研究

1.3.4.1 清除·OH 活性

H2O2與Fe2+作用產(chǎn)生·OH，水楊酸能與·OH作用產(chǎn)生在510 nm 波長(zhǎng)處有強(qiáng)吸收的有色物2，3-二羥基苯甲酸。向反應(yīng)中加入被測(cè)物，則會(huì)與水楊酸競(jìng)爭(zhēng)·OH，使有色物生成量減少。對(duì)·OH 清除的測(cè)定方法按文獻(xiàn)［7］進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1 硫酸銨用量對(duì)黃酮提取率的影響

按照1.3.3 方法，選擇不同用量的硫酸銨。實(shí)驗(yàn)表明:總黃酮提取率隨著硫酸銨用量增加而升高，達(dá)飽和后影響不顯著。其主要原因是，隨著硫酸銨用量的增加，雙水相體系的分相能力逐漸增大，故黃酮提取率會(huì)增大，但硫酸銨用量飽和與否對(duì)提取率影響不大。因此硫酸銨的用量確定為0.2 g/mL［9，10］。見(jiàn)圖1。

圖1 硫酸銨用量對(duì)總黃酮得率的影響Fig.1 Effect of the dosage of (NH4)2SO4on extraction yield of total flavonoids

2.1.2 乙醇濃度對(duì)黃酮提取率的影響

按照1.3.3 方法，選擇不同濃度的乙醇溶液。實(shí)驗(yàn)表明:總黃酮提取率隨著乙醇濃度的升高而增加，在乙醇濃度60%處達(dá)到最高，隨后又逐漸降低。因?yàn)辄S酮溶于乙醇，乙醇濃度越高，黃酮更加容易擴(kuò)散到提取劑中來(lái)，故提取率會(huì)增加，但在雙水相體系中，乙醇的濃度過(guò)高，會(huì)破壞雙水相體系的穩(wěn)定性，從而降低了黃酮的提取率。因此，確定乙醇濃度60%。見(jiàn)圖2。

圖2 乙醇濃度對(duì)總黃酮得率的影響Fig.2 Effect of the concentration of ethanol on extraction yield of total flavonoids

2.1.3 料液比對(duì)黃酮提取率的影響

按照1.3.3 方法，選擇不同的料液比。實(shí)驗(yàn)表明，總黃酮提取率隨著料液比的增大而增加，在加入40mL 乙醇溶液時(shí)達(dá)到最高，隨后變化不大。由于黃酮醇溶性好，故增加溶劑的用量有利于黃酮向提取液中擴(kuò)散，這樣黃酮提取率會(huì)增加，但原料一定的情況下，多余的乙醇作用不大。所以在料液比1∶40 達(dá)到最高，隨后變化不大，因此選擇料液比1∶40。見(jiàn)圖3。

圖3 料液比對(duì)總黃酮得率的影響Fig.3 Effect of ratio of solid solution on extraction yield of total flavonoids

2.1.4 微波功率對(duì)黃酮提取率的影響

按照1.3.3 方法，選擇不同微波功率。實(shí)驗(yàn)表明，總黃酮提取率隨著微波功率的增加而增大，在功率為150 W 時(shí)達(dá)到最高，然后降低。微波功率越大對(duì)樣品作用得越充分，黃酮更易擴(kuò)散到溶劑中，黃酮提取率會(huì)增加，但微波功率過(guò)大，則升溫速率越大，溫度會(huì)越高，這樣可能導(dǎo)致黃酮被氧化或分解加多，同時(shí)也會(huì)使乙醇揮發(fā)加快，從而使黃酮提取率下降。見(jiàn)圖4。

圖4 微波功率對(duì)總黃酮得率的影響Fig.4 Effect of microwave power on extraction yield of total flavonoids

2.1.5 提取時(shí)間對(duì)黃酮提取率的影響

按照1.3.3 方法，選擇不同提取時(shí)間。實(shí)驗(yàn)表明，總黃酮提取率隨著微波時(shí)間的增加而增大，在微波時(shí)間為100 S 時(shí)達(dá)到最高，之后逐漸降低。延長(zhǎng)提取時(shí)間可使目標(biāo)產(chǎn)物提取更徹底，提取率會(huì)增加，但加熱時(shí)間延過(guò)長(zhǎng)，可能使黃酮發(fā)生分解或氧化，并且時(shí)間越長(zhǎng)乙醇揮發(fā)得越多，故黃酮提取率會(huì)降低，因此確定提取時(shí)間為100S。見(jiàn)圖5:

圖5 提取時(shí)間對(duì)總黃酮得率的影響Fig.5 Effect of extraction time on extraction yield of total flavonoids

2.2 提取產(chǎn)物的定性鑒定

取2mL 提取液，加入適量試劑，觀察顏色變化見(jiàn)表1，結(jié)果與文獻(xiàn)一致［11］，由此具有黃酮類(lèi)化合物存在。

表1 黃酮類(lèi)化合物的鑒定結(jié)果Table 1 Identification results of the flavonoid

2.3 正交實(shí)驗(yàn)

單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，硫酸銨用量對(duì)總黃酮提取率影響相對(duì)較小，料液比、微波功率、提取時(shí)間、乙醇濃度對(duì)提取率影響較大，故選取影響較大的因素進(jìn)行正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)。取三個(gè)水平按L9(34)設(shè)計(jì)成正交實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1。

表2 L9(34)正交試驗(yàn)因素水平Table 2 Factors and levels of the orthogonal test L9(34)

表3 L9(34)正交試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Result of orthogonal experiment L9(34)

實(shí)驗(yàn)表明:料液比、微波功率、提取時(shí)間、乙醇濃度、硫酸銨用量等因素均對(duì)苧麻皮中總黃酮的提取有影響，各因素對(duì)總黃酮提取率的影響主次順序?yàn)?A ＞B ＞C ＞D。從苧麻皮中提取黃酮的工藝條件最優(yōu)組合為A3B3C3D3，即在硫酸銨用量為0.2 g/mL的條件下:料液比1∶50，微波功率200 W，微波提取120 s，乙醇濃度70%時(shí)為最佳提取條件。驗(yàn)證試驗(yàn):在最優(yōu)條件下進(jìn)行3 次平行實(shí)驗(yàn)，苧麻皮的黃酮提取率分別為:2.4075%、2.4879%、2.4305%，平均提取率為2.4420%，RSD 為1.6%，表明實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)合理可行。

2.4 提取物的抗氧化性實(shí)驗(yàn)

2.4.1 清除·OH 活性的測(cè)定

參照1.3.4.1 方法進(jìn)行試驗(yàn)，清除·OH 活性的結(jié)果如圖6。

圖6 黃酮對(duì)·OH 清除率Fig.6 Scavenging rates of total flavonoids to ·OH

由圖可以看出，在8.77～87.7 μg/mL 的濃度范圍內(nèi)，其·OH 清除率為3.97～83.41%，·OH 清除能力隨著總黃酮質(zhì)量濃度的增加而逐漸增強(qiáng)。

圖7 黃酮對(duì)清除率Fig.7 Scavenging rates of total flavonoids to

由圖可以看出，在8.77～87.7 μg/mL 的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，其清除率為3.09～69.33%清除能力隨著總黃酮質(zhì)量濃度的增加而逐漸增強(qiáng)。

3 結(jié)論

文章采用單因素和正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，雙水相協(xié)同-微波法提取了苧麻皮中的總黃酮，并對(duì)提取產(chǎn)物試驗(yàn)了清除·OH 和活性測(cè)定。最后試驗(yàn)得最佳工藝條件為:硫酸銨用量0.2 g/mL，料液比1∶50，微波功率200 W，微波提取時(shí)間120 s，乙醇濃度70%。本法作為一種天然產(chǎn)物黃酮提取的新技術(shù)，具有條件溫和，快速的特點(diǎn)。苧麻皮中的黃酮具有良好的抗氧化性，實(shí)驗(yàn)結(jié)果具有一定的適用價(jià)值，為今后苧麻產(chǎn)業(yè)的發(fā)展具有一定的作用。

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