文 彬，陳 然，彭佩純，鄧 鑫

廣西中醫(yī)藥大學(xué)附屬瑞康醫(yī)院，南寧 530011

肝硬化的形成是一個(gè)多因素、多環(huán)節(jié)、多途徑的病理?yè)p傷過程。MMP-9 是基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)家族類重要成員，可以水解沉積的細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)。整合素作為跨膜信號(hào)分子，介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)黏附，通過激活多種信號(hào)分子，導(dǎo)致細(xì)胞生物學(xué)行為改變［1］。越來越多證據(jù)表明細(xì)胞外基質(zhì)的合成、降解功能失衡［2］及整合素介導(dǎo)的細(xì)胞外基質(zhì)-整合素-細(xì)胞骨架黏附網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)可以調(diào)控肝星狀細(xì)胞的增殖與凋亡，在肝纖維化形成中發(fā)揮重要作用［3］。天然?；撬崾敲F中藥“牛黃”的有效成分之一，前期的實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)天然?；撬峋哂休^好的抗肝纖維化作用［4］。本研究通過熒光定量PCR、免疫蛋白印跡法探討天然?；撬釋?duì)肝硬化大鼠MMP-9、Integrin-β1 表達(dá)的影響，旨在為進(jìn)一步揭示天然?；撬峥垢斡不淖饔脵C(jī)制提供依據(jù)。

1 材料與儀器

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SD 大鼠，SPF 級(jí)，6～7 周齡，雄性，體重(170 ±20)g，廣西醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，動(dòng)物合格證:scxk 桂2009-0002。

1.2 主要試劑及儀器

天然?；撬釓臑醺蛉馓崛?，采用熱水提取法［5］，紅外光譜儀鑒定產(chǎn)品質(zhì)量;四氯化碳(CCl4)，分析純，購(gòu)于天津富宇精細(xì)化工試劑廠產(chǎn)品;食用酒為北京方莊酒廠提供;食用橄欖油(西班牙貝蒂斯);肝纖四項(xiàng)放射免疫分析測(cè)定盒(上海海軍醫(yī)學(xué)研究所生物技術(shù)中心產(chǎn)品);總RNA 提取試劑盒(K0731)、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(K1622)、熒光擴(kuò)增試劑盒(k0222)均由(加拿大Fermentas 公司)提供;鼠抗單克隆Integrin β1 抗體(英國(guó)Abcam 公司，貨號(hào):ab52971)、鼠抗單克隆MMP9 抗體(英國(guó)Abcam 公司，貨號(hào):ab76003);HRP 標(biāo)記的二抗(美國(guó)Bio-rad公司，批號(hào):172-1011);PVDF 膜(美國(guó)Millipore 公司，批號(hào):IPVH00010);超微量分光光度計(jì)(美國(guó)Qμawell，Q5000);熒光定量PCR 儀(美國(guó)ABI 公司，ABI Stepone Plus)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 模型制備

采用復(fù)合因素法［6］制備肝硬化大鼠模型，大鼠首次以0.5 mL/100 g 皮下注射(橄欖油60% +40%CCl4)混合液，以后每隔3 日按0.3 mL/100 g 體重皮下注射，每周2 次;15%酒精為唯一飲料，0.5%膽固醇、20%豬油、79.5%玉米面的高脂飼料喂養(yǎng)，滿10 周時(shí)隨機(jī)抽取5 只大鼠行肝臟病理學(xué)檢測(cè);正常組則以普通飼料和純凈水喂養(yǎng)。

2.2 動(dòng)物分組

75 只SD 大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周后，隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組、天然牛磺酸高、中、低劑量組，每組各15 只。正常對(duì)照組不經(jīng)造模處理，從實(shí)驗(yàn)第1 d 開始，給予相同劑量的生理鹽水皮下注射;模型組給藥方法同模型制備;天然?；撬嶂委熃M在造模成功后，按高中低(1.2、0.6、0.3g/kg·d)劑量灌胃，每天一次，連續(xù)60 d，直至實(shí)驗(yàn)結(jié)束;模型組及對(duì)照組大鼠給與相同劑量生理鹽水灌胃。

2.3 血清肝纖維四項(xiàng)指標(biāo)測(cè)定

血清HA、LN、IV、PCIII 的檢測(cè)采用放射免疫法，嚴(yán)格按試劑盒步驟操作。

2.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測(cè)MMP-9、Integrin-β1 mRNA 的表達(dá)

各基因引物序列如下:MMP-9 上游:AAGGTCGCTCGGATGGTTAT，下游:AGTTGCCCCCAGTTACAGTG;Integrin-β1 上 游:TTGCCTTGCTGCTGATTTGG，下游:AGTTGTCACGGCACTCTTGT;GAPDH 上 游:TGACTCTACCCACGGCAAGT，下 游:TACTCAGCACCAGCATCACC。取新鮮肝臟組織，應(yīng)用TRlzol 法抽提總RNA，超微量分光光度計(jì)測(cè)定OD260/280 吸光值，計(jì)算總RNA 含量及純度。嚴(yán)格按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(K1622)將RNA 逆轉(zhuǎn)錄成cDNA后進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。以GAPDH 為內(nèi)參基因，QPCR 體系配置(20 μL):2 ×Master Mix 10 μL，F(xiàn)orward Primer(10 mM)0.8 μL，Reverse Primer(10 mM)0.8 μL，cDNA 0.8 μL，Water nuclease-free 7.6 μL。QPCR 反應(yīng)條件:Integrin-β1 反應(yīng)條件:95 ℃預(yù)變性5 min;95℃15s 變性，62 ℃1 min 退火，擴(kuò)增35個(gè)循環(huán);最后72 ℃延伸7 min。MMP-9 反應(yīng)條件:94 ℃預(yù)變性4 min 后，以94 ℃變性40 s，60 ℃退火35 s，共40個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min。PCR 反應(yīng)結(jié)果數(shù)據(jù)采用2-△△CT進(jìn)行相對(duì)定量比較。

2.5 免疫蛋白印跡檢測(cè)MMP-9、Integrin-β1 蛋白的表達(dá)

采用免疫蛋白印跡技術(shù)，取100 mg 新鮮肝組織加裂解液(50 mmoL/L Tris-HCL pH 7.2，0.15mol/L NaCl，1%NP-40，1%SDS，5 mmoL/L EDTA，1 mmoL/L PMSF)充分裂解，4 ℃，12000 rpm 離心10 min，取上清提取肝組織總蛋白，測(cè)定總蛋白濃度。取40 μg 總蛋白，SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上，經(jīng)5%脫脂奶粉溶液封閉后，分別加入一抗MMP-9(1∶100)、integrin-β1(1∶500)，抗體4 ℃孵育過夜，洗滌后以偶聯(lián)HRP 標(biāo)記的二抗(1∶5000)結(jié)合反應(yīng)，ECL 顯影曝光，GAPDH 為內(nèi)參，Quantity One 軟件半定量分析特異性條帶灰度值，與內(nèi)參灰度值的比值為蛋白相對(duì)含量。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 17.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示，多組間指標(biāo)的檢測(cè)采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t 檢驗(yàn)，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 大鼠一般情況

正常對(duì)照組大鼠一般情況好，皮毛色澤光滑、柔順;模型組大鼠精神萎靡，易驚恐煩躁，體重減輕，皮毛色澤無光滑，造模期間死亡4 只，隨機(jī)抽取的5 只大鼠肝臟病理學(xué)檢測(cè)均提示肝硬化模型制作成功;天然?；撬嶂委熃M大鼠皮毛柔順，體重增加，精神狀況明顯改善，治療期間無死亡。

3.2 天然?；撬釋?duì)大鼠血清肝纖四項(xiàng)的影響

與對(duì)照組相比，模型組大鼠血清HA、LN、IV-C和PCIII 水平顯著升高(P＜0.05);與模型組相比，天然?；撬岣鲃┝拷MHA、LN、IV-C 和PCIII 均明顯降低(P＜0.01);中、高劑量組降低HA、LN、IV-C和PCIII 水平明顯優(yōu)于低劑量組(P＜0.05)，中、高劑量組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＞0.05)(見表1)。

表1 各組大鼠血清肝纖維化指標(biāo)比較()Table 1 Indices of serum liver fibrosis in rats()

表1 各組大鼠血清肝纖維化指標(biāo)比較()Table 1 Indices of serum liver fibrosis in rats()

注:NT 代表天然牛磺酸，與對(duì)照組比較，△P＜0.01;與模型組比較，★P＜0.01;與中劑量組比較，○P ＞0.05。Note:NT-Natural Taurine，Compare with control，△P＜0.01;Compare with Model，★P＜0.01;Compare with NT-M，○P ＞0.05.

圖1 GAPDH、MMP-9、Integrin-β1 擴(kuò)增和溶解曲線圖Fig.1 Amplification and meltcurves of GAPDH，MMP-9，Integrinβ1

3.3 RNA 純度及PCR 擴(kuò)增曲線

提取總RNA 用超微量分光光度計(jì)測(cè)定OD260/280 吸光值在1.8～2.0 之間，RNA 純度符合擴(kuò)增要求。GAPDH、MMP-9、Integrin-β1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增曲線呈S 型，基線平滑，將檢測(cè)臨界點(diǎn)定在CT值，即PCR 產(chǎn)物進(jìn)入指數(shù)增長(zhǎng)期的起始點(diǎn)。產(chǎn)物熔解曲線呈銳利的單一峰，熔解溫度(Tm)均一，說明PCR 產(chǎn)物特異性高，無雜帶(見圖1)。

3.4 天然?；撬釋?duì)大鼠肝組織MMP-9、Integrinβ1 mRNA 的表達(dá)水平影響

以相對(duì)定量法2-△△CT值［7］比較各組大鼠MMP-9、Integrin-β1 mRNA 表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)模型組MMP-9、Integrinβ1 mRNA 表達(dá)水平明顯高于正常對(duì)照組;天然牛磺酸低劑量組MMP-9、Integrin-β1 mRNA 表達(dá)降低，與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，天然牛磺酸中高劑量組MMP-9、Integrin-β1 mRNA表達(dá)降低尤明顯，與模型組比較差異非常顯著(P＜0.01)。(見圖2)。

圖2 各組大鼠肝組織MMP-9、Integrin-β1 mRNA 表達(dá)水平比較Fig.2 MMP-9，Integrin-β1 mRNA expression level in different groups

3.5 天然?；撬釋?duì)肝硬化大鼠MMP-9、Integrin-β1蛋白表達(dá)的調(diào)控

各組大鼠肝組織MMP-9、Integrin-β1 與內(nèi)參GAPDH 平均灰度值比值分別為:正常組(4.1 ±1.0，2.2 ±0.6)，模型組(9.0 ±1.9，5.0 ±1.1)，高劑量組(4.4 ±1.1，2.4 ±0.7)，中劑量組(4.3 ±1.1，2.4±0.8)，低劑量組(6.1 ±1.3，3.6 ±0.9)。與正常組相比，模型組大鼠肝組織MMP-9、Integrin-β1 蛋白表達(dá)明顯增加(P＜0.01);天然?；撬岣鲃┝拷M可以顯著降低模型組MMP-9、Integrin-β1 蛋白表達(dá)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);中劑量組降低MMP-9、Integrin-β1 蛋白表達(dá)明顯優(yōu)于低劑量組(P＜0.01)，與高劑量比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＞0.05)(見圖3)。

圖3 各組大鼠MMP-9 蛋白(A)、Integrin-β1 蛋白(B)表達(dá)水平Fig.3 MMP-9(A)andIntegrin-β1(B)protein expression levels in different groups of rats

4 討論

肝硬化目前尚缺乏良好的治療手段，中醫(yī)中藥在此方面具有廣闊前景，天然?；撬崾敲F中藥“牛黃”的有效成分之一，也是多種中藥的有效成分，海洋生物如烏蛤、珍珠母、牡蠣、海藻等含有豐富的天然?；撬?，現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明［8，9］:天然?；撬峋哂薪舛咀o(hù)肝，抗氧化損傷，抗腫瘤及增強(qiáng)機(jī)體免疫功能等活性。我們的前期研究也證實(shí)天然?；撬峥梢酝ㄟ^減輕肝細(xì)胞炎癥反應(yīng)，降低脂質(zhì)過氧化而達(dá)到抗纖維化的作用［4］。

隨著對(duì)肝纖維化機(jī)制了解的深入，細(xì)胞外基質(zhì)-整合素-細(xì)胞骨架調(diào)控系統(tǒng)在肝纖維化中的作用越來越受到重視。整合素作為一類黏附分子，主要由α 和β 兩條肽鏈以非共價(jià)鍵連接而形成的異二聚體的跨膜糖蛋白，其配體主要為細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)蛋白［10］。目前認(rèn)為肝星狀細(xì)胞的激活、凋亡等與細(xì)胞外基質(zhì)、黏附分子的相互作用密切相關(guān)［11］。也有報(bào)道ECM-整合素-細(xì)胞骨架組成的黏著斑已成為肝纖維化進(jìn)展的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，ECM 可以與整合素通過FAK信號(hào)傳導(dǎo)來調(diào)控肝星狀細(xì)胞(HSC)的活化增殖與凋亡，進(jìn)而影響肝纖維化的進(jìn)程［3］。

基膜性MMPs 主要包括MMP-2 和MMP-9，是調(diào)控肝內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)降解的主要酶類，其在肝纖維化中的作用，目前仍存在不同觀點(diǎn)，有認(rèn)為MMP-9 可以破壞肝竇內(nèi)基底膜，破壞肝細(xì)胞內(nèi)環(huán)境，致使肝星狀細(xì)胞(HSC)活化，促進(jìn)肝纖維化的形成［12］。也有研究表明增加MMP-9 表達(dá)量不僅可以降解過多沉積的間質(zhì)性膠原纖維，而且抑制HSC 膠原酶表達(dá)及減少基質(zhì)金屬蛋白酶抑制因子的產(chǎn)生，對(duì)逆轉(zhuǎn)肝纖維化發(fā)揮有利作用［13，14］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)模型組大鼠MMP-9 表達(dá)量明顯增多，至于在肝纖維化進(jìn)程中起促進(jìn)或逆轉(zhuǎn)作用，目前機(jī)制尚未明確:一方面肝纖維化形成中由于膠原過度沉積，MMP-9 持續(xù)升高可能是機(jī)體代償性降解過度沉積的細(xì)胞外基質(zhì);另一方面MMP-9 持續(xù)增多，是否破壞內(nèi)基底膜及促進(jìn)HSC 激活，此方面的論據(jù)仍有待進(jìn)一步考證。

Sheu 等研究表明MMP-9、Integrin-β1 存在多種生物體內(nèi)，并且可以表達(dá)于多種正常細(xì)胞［15］。本實(shí)驗(yàn)中各組大鼠肝內(nèi)均可見到MMP-9、Integrin-β1 表達(dá)，與Sheu 等研究結(jié)果一致。但肝硬化大鼠MMP-9、integrin-β1 表達(dá)較正常大鼠異常增多，說明MMP-9、Integrin-β1 與肝纖維化密切相關(guān)，其在基因和蛋白的高表達(dá)與肝硬化呈正相關(guān)，兩者之間可能通過(細(xì)胞外基質(zhì)-整合素-細(xì)胞骨架)的黏附而發(fā)揮協(xié)同作用。天然?；撬峥梢燥@著降低MMP-9、Integrinβ1mRNA 及蛋白表達(dá)，以中、高劑量組較明顯，可見天然?；撬峥垢斡不淖饔脵C(jī)制可能與調(diào)控MMP-9、Integrin-β1 表達(dá)水平有關(guān)，但天然?；撬釋?duì)MMP-9、Integrin-β1 調(diào)控機(jī)制及信號(hào)傳導(dǎo)途徑仍未明了，有待進(jìn)一步深入研究。

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