吳 振，李 紅，陳 崗，師 萱，譚紅軍*

1重慶市中藥研究院，重慶 400065;2 重慶市食品藥品檢驗所，重慶 401121;3 重慶市計量質(zhì)量檢測研究院 重慶市食品安全工程技術(shù)中心 國家農(nóng)副加工產(chǎn)品及調(diào)味品質(zhì)量監(jiān)督檢驗中心，重慶 401123

大黃酚(chrysophanol，Chr)，是大黃、虎杖、何首烏、決明子等中藥中提取的一種蒽醌類活性成分，化學名為1，8-二羥基-3-甲基蒽醌(圖1)，具有抗菌、縮短血液凝固時間、興奮神經(jīng)、麻痹肌肉、止咳、利尿、抗癌作用。近年來研究表明，大黃酚能延緩衰老，能清除氧自由基，增強抗氧化能力和改善學習記憶障礙等作用［1］。但大黃酚具有味苦、對胃有刺激性，難溶于水、理化性質(zhì)不穩(wěn)定，見光易氧化等不利因素［2］，因而沒有適宜的劑型供臨床應用。因此，提高該類小分子生物活性成分的溶解度(增溶)對其在醫(yī)藥中的廣泛使用和生物功能發(fā)揮具有非常重要的意義。

近年來發(fā)現(xiàn)，超分子包合技術(shù)是提高難溶性非極性分子藥物溶解性的有效途徑之一。超分子包合技術(shù)應用的包合材料主要集中在環(huán)糊精、冠醚、杯芳烴、多聚糖等［3］，其中經(jīng)過選擇性修飾的環(huán)糊精——甲基化-β-環(huán)糊精(M-β-CD)，水溶性好，在有機溶劑中也表現(xiàn)出良好的溶解性，因此成為提高藥物溶解性的方法之一［4］。為此本實驗采用電磁攪拌-噴霧干燥法(ES)制備Chr-M-β-CD 包合物制劑，旨在提高其溶解度和穩(wěn)定性，掩蓋不良氣味，減少其對胃的刺激性，同時，對其包合過程的熱力學參數(shù)和體外釋放特性進行研究，為大黃酚的應用提供更好的實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

大黃酚標準品(Chr，HPLC≥98%，南京奧多福尼生物科技有限公司);2，6-甲基化-β-環(huán)糊精(M-β-CD，平均取代度10.12，山東濱州智源生物科技有限公司);其它化學試劑均為國產(chǎn)分析純;所用水為雙蒸水，所用溶液均自行配制。

高效液相色譜儀(日本Shimadzu 公司);PHS-3C 酸度計(上海虹益儀器儀表有限公司);SD-1500實驗型噴霧干燥機(上海沃迪科技有限公司);R-124 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(瑞典BUCHI 公司)。

1.2 方法

1.2.1 Chr-M-β-CD 包合物和物理混合物的制備

采用電磁攪拌-噴霧干燥法(ES)制備Chr-M-β-CD 包合物，分別稱取規(guī)定量的Chr 與M-β-CD 置于燒杯中，加入50%乙醇使二者溶解，置于磁力加熱攪拌器上，在30 ℃下，固定轉(zhuǎn)速為800 rpm，攪拌2 h后，靜置。將溶液真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去乙醇，用0.45 μm 的微孔濾膜過濾以除去未被包合的大黃酚，將濾液進行噴霧干燥，得Chr-M-β-CD 包合物固體粉末。噴霧干燥的工藝參數(shù):蠕動泵流速:1.2 mL/min，進口溫度80 ℃，噴霧流量300 mL/h。

物理混合物的制備方法:準確稱取適量Chr 和M-β-CD(摩爾比和使用量與超分子包合物一致)，置于研缽中混合研磨，干燥，避光保存，備用。

1.2.2 相溶解度的測定

相溶解度的測定參考文獻［5］的方法，精密稱取M-β-CD 用蒸餾水配成質(zhì)量分數(shù)為5、10、20、50、100、150 mmol/L 的系列溶液，分別吸取5 mL 置具塞試管中，均加入過量的Chr 固體粉末，超聲10 min后，置于恒溫振蕩器(調(diào)整振蕩頻率為100 rpm)中分別在25、35 和45 ℃條件下，振蕩5 h。使溶解達到平衡后，靜置，取上清液用0.45 μm 的微孔濾膜過濾，濾液用高效液相法測定Chr 的峰面積，用標準曲線計算Chr 的濃度。以M-β-CD 濃度(mmol/L)為橫坐標，Chr 濃度(mmol/L)為縱坐標，繪制平衡相溶解度圖，并計算線性回歸方程及包合常數(shù)，通過相溶解度的研究，分析M-β-CD 對Chr 的增溶作用。

1.2.3 等摩爾連續(xù)遞變法測定包合摩爾比

采用等摩爾連續(xù)遞變法(即Job’s 方法)確定化學計量比［6］，在實驗條件下，將所研究的Chr 和Mβ-CD 配制成一系列濃度比，而其總濃度固定不變，M-β-CD 的摩爾分數(shù)從0.1 增大至0.9。在最大吸收波長254 nm，測試體系溶液的吸光度為A1，純Chr溶液的吸光度為A2，以吸光度變化(△A=A2-A1)對M-β-CD 的摩爾組分作圖(Job’s 圖)，根據(jù)圖中吸光度變化△A 最大處對應的M-β-CD 的摩爾組分，即可以計算出主體M-β-CD 與客體Chr 的包合比。

1.2.4 超分子包合常數(shù)和包合過程熱力學參數(shù)計算

分別對不同溫度的各相溶解度曲線的直線部分作線性回歸，求得回歸方程的斜率(SS)和截距(S0)，按Higuchi-Connors 公式［7］計算超分子包合常數(shù)(Kb，L/mol)。

式中，SS為斜率;S0為截距，即各溫度下Chr 在未添加M-β-CD 的水溶液中的溶解度。

根據(jù)范特霍夫方程lnKb=-△H0/RT+△S0/R，以lnKb對1/T 作線性回歸，直線的斜率即為-△H0/R，截距即為△S0/R，從而求得包合反應的焓變△H0及熵變△S0;根據(jù)公式△G0=△H0-T△S0，計算不同溫度下的包合反應的吉布斯自由能變化△G0。

1.2.5 Chr-M-β-CD 包合物的體外釋放特性研究

參考《中國藥典》2010 年版溶出度測定第一法并略作修改，測定所得體系的的體外釋藥特性。具體方法為:取900 mL 含0.5%十二烷基硫酸鈉的pH 6.8 磷酸鹽緩沖液置于溶出杯中，加熱，待其溫度恒定在(37 ±0.5)℃后，分別精密稱取Chr 原藥5 mg、Chr-M-β-CD 包合物(相當于原藥5 mg)、物理混合物(摩爾比和使用量與超分子包合物一致，相當于原藥5 mg)置溶出杯中，調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速為100 rpm，分別于5～200 min 取樣(同時補充等量同溫溶液介質(zhì))，樣品經(jīng)0.45 μm 濾膜過濾，采用HPLC 測定，計算各采樣點時樣品中的藥物濃度和累積釋放率。同批樣品測定6 份，結(jié)果取平均值。

1.2.6 HPLC 測定Chr 含量及方法學研究

HPLC 條件:日本島津公司LC-20A 高效液相色譜儀，色譜柱為C18Hypersil BDS(250 mm × 4.6 mm)。檢測波長:254 nm;柱溫:30 ℃;流動相甲醇-0.1%磷酸(65∶35);流速1.2 mL/min，進樣量:20 μL，大黃酚的HPLC 色譜圖具體如圖1 所示。

標準曲線:精密稱取Chr 標準品1.13 mg，以甲醇為溶劑溶解后定容到10 mL，搖勻得113 μg/mL Chr 對照品溶液，備用。精密吸取Chr 對照品溶液2、10、20、100、200、400、1000 μL 至2 mL 量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，使?jié)舛瘸蔀?.113、0.565、1.130、5.650、11.300、22.600、56.500 μg/mL 的一系列對照品溶液，進樣，測定。以質(zhì)量濃度對峰面積做線性回歸。得回歸方程Y=89977X-4833.3，R2=0.9999，線性范圍為0.113～56.5 μg/mL。

圖1 大黃酚(Chr)的HPLC 色譜圖(內(nèi)插圖為Chr 分子結(jié)構(gòu))Fig.1 HPLC chromatogram of chrysophanol (insert:molecular structure of chrysophanol)

精密度實驗:制備低、中、高濃度的Chr 溶液，HPLC 測定，同日內(nèi)測5 次及每天測1 次、連續(xù)測5 d。結(jié)果日內(nèi)和日間的平均RSD 均＜2%，表明本方法精密度好。

重復性實驗:取Chr 對照品適量，共6 份，按樣品處理和測定方法平行測定，計算Chr 含量，結(jié)果RSD=0.65%，表明方法重復性良好。

回收率實驗:精確稱取0.03 mg 大黃酚，共6份，與不同濃度的Chr-M-β-CD 樣品溶液混合，HPLC測定Chr 濃度，平均加樣回收率98.10%，RSD=1.28%。

2 結(jié)果與分析

2.1 Chr-M-β-CD 包合物的相溶解度分析

包合常數(shù)(Kb)和結(jié)合摩爾比是表征小分子藥物與環(huán)糊精及其衍生物形成包合物的重要參數(shù)，相溶解度分析被廣泛用于評價上述兩個參數(shù)［8］。以CChr(mmol/L)為縱坐標，以CM-β-CD(mmol/L)為橫坐標，繪制相溶解度圖，分別得到25、35 和45 ℃時Mβ-CD 不同濃度對Chr 的相溶解度圖，結(jié)果見圖2(A)。采用線性回歸擬合發(fā)現(xiàn)，擬合R2均＞0.95。根據(jù)Higuchi 等［7］的報道，環(huán)糊精包合物的相溶解度曲線一般分為A 型和B 型。客體濃度隨環(huán)糊精濃度增大而增加的為A 型，表現(xiàn)為增溶作用，進一步分為3個亞型:AL、AP和AN型。若環(huán)糊精對客體以物質(zhì)的量之比為1∶1 進行包合，相溶解度曲線呈線性增加，表現(xiàn)為AL型，而AP和AN分別為線性增加的正偏差和負偏差。圖2(A)顯示，Chr 在不同濃度M-β-CD 作用下的相溶解度圖曲線為線性AL型;隨著M-β-CD 濃度的增加，Chr 的溶解度隨之增加，且有較好的線性關(guān)系。圖2(B)說明Chr 與M-β-CD形成了物質(zhì)的量之比為1∶1 的包合物。

圖2 Chr-M-β-CD 包合物在不同溫度下的相溶解度曲線(A)和等摩爾連續(xù)遞變曲線(B)(n=6)Fig.2 Phase solubility diagram (A)and continuous variation plot (B)of Chr-M-β-CD+at different temperatures

Chr-M-β-CD 超分子包合常數(shù)(Kb)是衡量包合物穩(wěn)定性的重要參數(shù)，Kb越大，表明該藥物與空腔分子的結(jié)合越穩(wěn)定，越容易形成包合物。根據(jù)線性方程和式(1)得出包合物在25、35 和45 ℃條件下的Kb分別為:6.56 ×102、7.85 ×102、1.09 ×103L/mol。Kb隨溫度的升高而升高，這可能是由于分子間作用力(客體Chr 與空腔M-β-CD 間的范德華力、疏水客體與空腔問的“疏水性鍵力”等)的減小造成的［9］。鄭曉霞等［10］研究發(fā)現(xiàn)，Chr-HP-β-CD 的Kb為401.19 L/mol(研究條件為:25 ℃)，比較發(fā)現(xiàn)Mβ-CD 對Chr 的包合作用更強。Loftsson 等［11］研究發(fā)現(xiàn)，當環(huán)糊精及其衍生物對藥物的包合常數(shù)在50 L/mol～2000 L/mol 范圍內(nèi)，說明二者之間有較強的相互作用。

2.2 Chr 與M-β-CD 包合過程的熱力學參數(shù)分析

以lnKb對1/T 作線性回歸，得線性回歸方程為lnKb=– 2.416 ×103/T +14.57(R2=0.9655)。Chr 與M-β-CD 包合過程的熱力學參數(shù)結(jié)果見表1。實驗結(jié)果顯示△G0＜0，說明Chr 與M-β-CD 包合過程是一個自發(fā)過程;△H0＞0，說明包合過程是一個吸熱過程;△S0＞0，說明包合過程是無序化增加的過程。同時實驗結(jié)果說明Chr 與M-β-CD 包合過程為熵驅(qū)動過程。環(huán)糊精及其衍生物的包合增溶作用主要通過對客體小分子的包結(jié)作用實現(xiàn)，包合物形成是增溶的前提［12］。包合過程實質(zhì)是客體分子Chr進入M-β-CD 空腔，并將其中的水分子替換出來的過程，包合的主要驅(qū)動力來自于空腔內(nèi)高焓值水的釋放，包合物的形成可能是Chr 與M-β-CD 間多種力相互作用的結(jié)果，如氫鍵、范德華力、疏水相互作用，以及M-β-CD 在包合過程中釋放的環(huán)張力等。

表1 不同溫度下Chr 與M-β-CD 包合過程的熱力學參數(shù)Table 1 The thermodynamic parmeters of Chr-M-β-CD inclusion complex under different temperatures

圖3 大黃酚及大黃酚包合物累積釋放曲線(n=6)Fig.3 Dissolution profiles of Chr and its inclusion complex

2.3 Chr-M-β-CD 包合物體外釋放特性分析

從圖3 可知，Chr 原藥在介質(zhì)中的溶出行為很差，200 min 在介質(zhì)中的累積釋放率僅為19.9%。物理混合物中由于水溶性輔料的存在，改善了Chr的表面潤濕性，對藥物的溶出有所改善，但最終的累積釋放率也僅為43.6%。采用電磁攪拌-噴霧干燥法(ES)制備Chr-M-β-CD 包合物，可以顯著提高Chr原藥的初期釋放率和最終的累積釋放率。ES 方法將藥物溶液在熱氣流的作用下使霧滴中的水分迅速蒸發(fā)，直接獲得疏松的干燥品，免去了后期其它加工工藝，且得到的粉末大部分為液滴經(jīng)過膨脹產(chǎn)生的空心顆粒，有利于粉末的潤濕，能更好的改善藥物的累積釋放率。

3 結(jié)論

經(jīng)過電磁攪拌-噴霧干燥法(ES)制備的Chr-甲基化-β-環(huán)糊精(M-β-CD)包合物提高了Chr 溶解和溶出行為，不同溫度下Chr 的相溶解度圖均呈現(xiàn)出AL型特點。在25、35 和45 ℃條件下Chr 與M-β-CD 包合過程的超分子包合常數(shù)分別為6.56 ×102、7.85 ×102、1.09 ×103L/mol。包合過程的△H0為20.09 kJ/mol;△S0為121.11 J/(mol·K);△G0分別為-16.01、-17.21、-18.42 kJ/mol;M-β-CD 與Chr可自發(fā)形成質(zhì)量比為1∶1 的包合物，整個包合過程體現(xiàn)為熵驅(qū)動過程，形成的超分子包合物均有較好的增溶作用，為Chr 的口服新劑型的設計提供新的思路。同時電磁攪拌-噴霧干燥法(ES)制備得到的Chr-M-β-CD 包合物粉末大多為液滴經(jīng)膨脹產(chǎn)生的空心顆粒，有利于被水潤濕電磁攪拌-噴霧干燥法制品較有工業(yè)化前景。

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