李玲玉，趙 迪，劉曉宇，陳井生，3，段玉璽，陳立杰*

1沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院 北方線蟲研究所;2沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)理學(xué)院，沈陽(yáng) 110866;3 黑龍江農(nóng)科院大慶分院，大慶 163316

根結(jié)線蟲(Meloidogyne spp.)廣泛分布于世界各地，寄主植物有3000 余種，黃瓜番茄等各類蔬菜、煙草、果樹(shù)和觀賞植物等都是其良好寄主［1］。根結(jié)線蟲病是世界農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上危害最嚴(yán)重的一類線蟲病害，對(duì)我國(guó)的蔬菜、經(jīng)濟(jì)作物等種植已造成嚴(yán)重威脅。但是針對(duì)根結(jié)線蟲病的有效化學(xué)農(nóng)藥如涕滅威、溴甲烷等陸續(xù)被禁用或限制使用，因此尋找替代的高效低度低殘留的有效藥劑成為當(dāng)今世界研究熱點(diǎn)。目前生產(chǎn)中推廣使用的阿維菌素—鏈霉菌產(chǎn)生的抗生素是較為理想的防治藥劑，但是阿維菌素對(duì)根結(jié)線蟲卵無(wú)效。因此，尋找新的生物殺線劑，尤其是從放線菌的代謝產(chǎn)物中篩選高效低毒的生物殺線劑成為防治植物線蟲病的重要發(fā)展方向［2］。

放線菌中以鏈霉菌屬(Streptomyces)產(chǎn)生的生物活性物質(zhì)最多。如阿維菌素是由灰色鏈霉菌(Streptomyces avermitilis)發(fā)酵產(chǎn)生的大環(huán)內(nèi)酯類抗生素［3］。目前已陸續(xù)發(fā)現(xiàn)幾種對(duì)線蟲有活性的放線菌代謝產(chǎn)物。放線菌Snea253 菌株(委內(nèi)瑞拉鏈霉菌Streptomyces venezuelae)是本實(shí)驗(yàn)室前期從土壤中分離得到的具毒殺植物線蟲活性的高效菌株，其代謝物對(duì)大豆胞囊線蟲(Heterodera glycines)、南方根結(jié)線蟲(Meloidogyne incognita)和北方根結(jié)線蟲(M.hapla)的J2 均具有較高的生物活性，并且能夠抑制大豆胞囊線蟲卵的孵化［4，5］。經(jīng)初步對(duì)其殺線蟲活性物質(zhì)進(jìn)行分離純化、結(jié)構(gòu)解析，認(rèn)為其可能含有氨基寡酸的糖類活性物質(zhì)(待發(fā)表)，因此本文重點(diǎn)研究其代謝產(chǎn)物中殺線蟲活性物質(zhì)及已知寡糖類物質(zhì)對(duì)南方根結(jié)線蟲的活性。

寡糖素(Oligosaccharins)是Alberhseim 教授于1985 年首次提出的概念，活性寡糖具有調(diào)控植物生長(zhǎng)、發(fā)育、繁殖、防病和抗病等多方面的功能［6］。各種活性寡糖可發(fā)出調(diào)節(jié)特定功能的信息，激活防御反應(yīng)、誘導(dǎo)植物抗病性，調(diào)控植物生長(zhǎng)，產(chǎn)生具有抗病害的活性物質(zhì)，抑制病蟲害的形成和侵染，寡糖在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上顯示出廣闊的應(yīng)用前景［7］。鑒于本研究中Snea253 菌株發(fā)酵液中活性物質(zhì)可能含有寡糖類物質(zhì)，因此將此活性物質(zhì)與已知寡糖共同測(cè)試對(duì)南方根結(jié)線蟲卵孵化和J2 活性的影響，以明確寡糖類物質(zhì)對(duì)植物線蟲的毒力作用，為植物線蟲病害生物防治研究中生物殺線劑的研制提供新的理論支持。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

放線菌Snea253 菌株，菌株及其制備方法已獲得國(guó)家發(fā)明專利授權(quán)(ZL200810010465.X)。

1.2 放線菌Snea253 菌株發(fā)酵產(chǎn)物中活性物質(zhì)的粗提取

用50 L～100 L 發(fā)酵罐GUGS-50 進(jìn)行發(fā)酵，在28 ℃下培養(yǎng)，初始pH 為6，轉(zhuǎn)速150 r/min，發(fā)酵5～7 d。將放線菌Snea253 菌株發(fā)酵液濃縮10 倍，濃縮液和無(wú)水乙醇置于4 ℃冰箱中預(yù)冷12 h，再將兩者按1:5 混合充分搖勻靜置于4 ℃冰箱中12 h。取出混合液除去沉淀并用RE-52AA 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將乙醇蒸掉，將所得的預(yù)處理液用CoolSafe55-4 冷凍干燥儀冷凍干燥成粉末。用HC-ADS-7 大孔吸附樹(shù)脂吸附樣品中的色素，去離子水洗脫，收集液體并冷凍干燥即得粗提物，備用。

1.3 放線菌Snea253 殺線蟲活性物質(zhì)的成分分析

1.3.1 試管法分析活性物質(zhì)［8］

取Snea253 粗提物樣品溶液1 mL 于試管中，加入顯色劑，不同化合物發(fā)生不同的顯色反應(yīng)，從而鑒別其中化合物成分。用α-萘酚試劑和斐林試劑檢查糖及苷;茚三酮試劑和雙縮脲試劑檢查氨基酸、多肽和蛋白質(zhì);碘化鉍鉀試劑檢查生物堿;三氯化鐵試劑檢查酚類;鹽酸-鎂粉試劑和醋酸鉛試劑檢查黃酮及甙;Borntrager 試劑和醋酸鎂試劑檢查蒽醌及甙;堿性3，5-二硝基苯甲酸試劑和堿性苦味酸試劑檢查強(qiáng)心苷;異羥肟酸鐵試劑檢查內(nèi)酯、香豆素及甙;氯化鈉-明膠試劑和新鮮石灰水試劑檢查鞣質(zhì);泡沫試劑和氯仿-濃硫酸試劑檢查皂甙;冰醋酸-硫酸試劑和氯仿-濃硫酸試劑檢查甾體萜類;揮發(fā)油試劑和油脂試劑檢查揮發(fā)油和油脂。

1.3.2 薄層層析法預(yù)試［8］

將Snea253 粗提物樣品點(diǎn)樣到硅膠薄層層析板上，用乙酸乙酯:甲醇:水:冰乙酸(V:V:V:V)=12:5:1:1 作展層劑，在層析缸內(nèi)充分展開(kāi)。硅膠板干燥后，噴顯色劑，各種化合物遇特異顯色劑顯示出特有的顏色，方法如上，從而判斷化合物的類型。

1.4 已知寡糖的選擇

所選用寡糖均為分析純，分別為D(+)半乳糖、D-果糖、D(+)木糖、L-山梨糖、D(+)麥芽糖、D(+)葡萄糖、乳糖和蔗糖。所用寡糖溶液的濃度與Snea253 活性物質(zhì)的濃度相同，均為5 mg/mL。

1.5 南方根結(jié)線蟲卵囊和二齡幼蟲的獲得

在溫室中用盆栽番茄繁殖南方根結(jié)線蟲(番茄品種為L(zhǎng)402)。第一代卵囊成熟后，將番茄根系取出，用水輕輕沖洗，小心挑取卵囊。卵囊在0.5%次氯酸鈉中消毒3 min，無(wú)菌水反復(fù)沖洗3 次，將消毒的部分卵囊置于自制孵化池中備用。

另一部分卵囊放在自制的孵化池中，孵化池放在少量無(wú)菌水的滅菌培養(yǎng)皿里，25 ℃恒溫箱中培養(yǎng)，每隔24 h 收集一次新孵化的南方根結(jié)線蟲J2，置于滅菌的培養(yǎng)皿中制成J2 線蟲懸液備用。

1.6 活性物質(zhì)及寡糖溶液對(duì)南方根結(jié)線蟲卵囊中卵孵化的影響

取新鮮飽滿大小均一的消毒卵囊，每2 個(gè)消毒卵囊放入一個(gè)消毒孵化池中，再將孵化池放入盛有測(cè)試溶液的滅菌培養(yǎng)皿中，測(cè)試溶液包括5 mg/mL的Snea253 發(fā)酵液粗提取后的活性物質(zhì)和5 mg/mL各類寡糖溶液各1 mL，以無(wú)菌水處理作為對(duì)照，為盡可能的減少皿中液體的蒸發(fā)，培養(yǎng)皿用封口膜密封，每個(gè)處理重復(fù)3 次。將放有卵囊的培養(yǎng)皿置于25 ℃恒溫箱中，7 d 后計(jì)數(shù)線蟲孵化總數(shù)，計(jì)算孵化相對(duì)抑制率。

1.7 活性物質(zhì)及寡糖溶液對(duì)南方根結(jié)線蟲J2 的影響

在經(jīng)過(guò)高溫滅菌的貝氏小皿中放入活潑的南方根結(jié)線蟲J2，各加入1 mL 的活性物質(zhì)和寡糖溶液，以無(wú)菌水作為空白對(duì)照，每個(gè)處理重復(fù)3 次。各處理的貝氏小皿放入25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中，24 h 后計(jì)數(shù)線蟲的死亡率，計(jì)算線蟲校正死亡率，采用毛針碰觸和NaOCl 刺激法來(lái)判斷線蟲的死活。

2 結(jié)果與分析

2.1 放線菌Snea253 代謝產(chǎn)物中活性物質(zhì)的成分分析結(jié)果

對(duì)放線菌Snea253 發(fā)酵液中活性物質(zhì)的化學(xué)成分進(jìn)行試管預(yù)試和薄層層析，結(jié)果見(jiàn)表1、表2。通過(guò)試管法(表1)可知:α-萘酚試驗(yàn)呈紫紅色環(huán)，斐林試驗(yàn)呈磚紅色沉淀，說(shuō)明該物質(zhì)中含有糖成分;茚三酮試驗(yàn)呈藍(lán)色，雙縮脲試驗(yàn)不變化，說(shuō)明含有氨基酸，從而排除了生物堿、酚類和醌、酮等其他物質(zhì)的可能性。

薄層層析法(表2)可知，苯胺-二苯胺顯色劑呈藍(lán)色斑點(diǎn)，苯胺-鄰苯二甲酸試劑呈棕色斑點(diǎn)，α-萘酚試劑呈藍(lán)色斑點(diǎn)，仍然說(shuō)明該活性物質(zhì)中含有糖成分。茚三酮顯色劑呈粉紅色斑點(diǎn)，說(shuō)明活性物質(zhì)中含有氨基酸。其他的生物堿、酚類、醌、酮和有機(jī)酸、油脂類均無(wú)變化。

因此，可以判斷放線菌Snea253 發(fā)酵液的代謝產(chǎn)物中殺線蟲活性物質(zhì)含有糖和氨基酸。而后經(jīng)過(guò)柱層析、液相色譜、質(zhì)譜和核磁共振成像初步解析為寡糖類(待發(fā)表)。

微生物產(chǎn)生的抗生素等生物活性物質(zhì)主要來(lái)自放線菌中的鏈霉菌屬。阿維菌素是目前使用高效、低劑量的殺線蟲劑，目前陸續(xù)有研究者從鏈霉菌中分離出對(duì)植物線蟲有作用的抗生素、酸、黃酮等物質(zhì)，但還沒(méi)有發(fā)現(xiàn)從鏈霉菌中分離出對(duì)植物線蟲有活性的寡糖類物質(zhì)。

表1 放線菌Snea253 代謝產(chǎn)物中活性物質(zhì)化學(xué)成分試管法分析結(jié)果Table 1 Snea253 metabolites identified by test tube method

表2 放線菌Snea253 代謝產(chǎn)物中活性物質(zhì)化學(xué)成分薄層層析法分析結(jié)果Table 2 Snea253 metabolites by identified thin layer chromatography

2.2 Snea253 代謝產(chǎn)物中活性物質(zhì)與寡糖對(duì)南方根結(jié)線蟲卵囊中卵孵化和J2 的影響

試驗(yàn)選擇已知寡糖類物質(zhì)8 種，比較與Snea253代謝產(chǎn)物中氨基寡糖對(duì)南方根結(jié)線蟲的卵和J2 的毒性，研究結(jié)果顯示，Snea253 代謝產(chǎn)物中的活性物質(zhì)對(duì)南方根結(jié)線蟲的毒性最高，而其他寡糖類物質(zhì)對(duì)根結(jié)線蟲毒性很低，甚至可以促進(jìn)線蟲的卵孵化和J2 存活。

圖1 Snea253 活性物質(zhì)和寡糖對(duì)南方根結(jié)線蟲卵孵化的影響Fig.1 Effect of Snea253 active substance and oligosacharides on egg hatching of M.incognita.

圖2 Snea253 活性物質(zhì)和寡糖對(duì)南方根結(jié)線蟲卵孵化的相對(duì)抑制率Fig.2 Relative suppression rate of egg hatching of M.incognita by Snea253 active substance and oligosacharides

D(+)半乳糖、D-果糖和D(+)木糖對(duì)南方根結(jié)線蟲卵孵化具有顯著的促進(jìn)作用;其次是乳糖、D(+)葡萄糖和L-山梨糖有一定的促進(jìn)作用，但與對(duì)照相比不顯著;蔗糖和麥芽糖略有抑制，但也不顯著;而Snea253 活性物質(zhì)則能夠顯著抑制南方根結(jié)線蟲的卵孵化(圖1)。而且Snea253 對(duì)卵囊中卵孵化的相對(duì)抑制率最高，達(dá)到84.95%;麥芽糖和蔗糖相對(duì)抑制率不顯著，但是半乳糖、果糖和木糖正相反，顯著促進(jìn)了南方根結(jié)線蟲的卵孵化，乳糖、山梨糖和葡萄糖也有一定促進(jìn)作用，但與對(duì)照相比不顯著(圖2)。

對(duì)南方根結(jié)線蟲J2 的致死率試驗(yàn)中，Snea253活性物質(zhì)對(duì)J2 的校正死亡率最高為98.21%，與寡糖和對(duì)照處理差異極其顯著，寡糖中除D(+)半乳糖的致死率為4.176%相比對(duì)較顯著外，其他寡糖對(duì)J2 致死效果均不顯著，而且葡萄糖、乳糖和蔗糖溶液中的線蟲沒(méi)有死亡現(xiàn)象，與無(wú)菌水對(duì)照相比，反而有促進(jìn)J2 更活躍生存的作用(圖3)。

圖3 Snea253 活性物質(zhì)和寡糖對(duì)南方根結(jié)線蟲J2 的致死率Fig.3 Mortality of M.incognita J2 by Snea253 active substance and oligosacharide

3 討論

農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中所用的寡糖是一類對(duì)生物具有某種或某類特定功效作用的低聚糖類，即為功能性寡糖，如殼寡糖、甘露寡糖、胡蘿卜寡糖等種類［9］。根據(jù)活性物質(zhì)和已知寡糖對(duì)南方根結(jié)線蟲的作用，可推斷活性物質(zhì)并不是簡(jiǎn)單的寡糖而是功能性寡糖。Hirano 等研究顯示功能性寡糖可以作為抗菌劑直接殺死病原微生物［10］，Ayers 等發(fā)現(xiàn)寡糖也可以激發(fā)植物自身防衛(wèi)反應(yīng)以達(dá)到防治植物病害目的［11］。殼寡糖對(duì)小麥紋枯病、黃瓜灰霉病、辣椒白粉病等真菌病害和某些病毒病害及細(xì)菌病害都有明顯的防治效果［7］。也有研究發(fā)現(xiàn)殼聚糖處理可以誘導(dǎo)黃瓜對(duì)根結(jié)線蟲的抗病性［12］，因此，功能性寡糖對(duì)線蟲病害的防治研究將具有深遠(yuǎn)意義。

關(guān)于微生物代謝產(chǎn)物中含氨基寡糖類物質(zhì)對(duì)植物線蟲的活性研究報(bào)道很少。本研究證明委內(nèi)瑞拉鏈霉菌Snea253 產(chǎn)生的含氨基酸的寡糖類物質(zhì)對(duì)植物線蟲有活性。委內(nèi)瑞拉鏈霉菌是研發(fā)較早的醫(yī)用抗生素來(lái)源菌之一。Uchida 從委內(nèi)瑞拉鏈霉菌Tü 1102 中分離出核酸霉素(Rinamycin)，它能抑制真菌、酵母菌、革蘭氏陽(yáng)性和一些陰性細(xì)菌［13］。委內(nèi)瑞拉鏈霉菌還能產(chǎn)生大環(huán)內(nèi)酯類抗生素如酒霉素(Methymycin)、新酒霉素(Neomethymycin)和苦霉素(Picromycin)［14］。但未見(jiàn)其抗生素對(duì)植物線蟲有活性的報(bào)道，因此需進(jìn)一步進(jìn)行系統(tǒng)的研究，以明確其殺線蟲活性物質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能，為植物線蟲病害的防治提供新的生防資源。

4 結(jié)論

本文經(jīng)過(guò)薄層層析法和試管法測(cè)試了放線菌Snea253 發(fā)酵液中活性物質(zhì)，顯色反應(yīng)包含有氨基酸和糖類物質(zhì)。根據(jù)之后對(duì)活性物質(zhì)的分離純化及核磁、質(zhì)譜結(jié)果，可以初步判定為寡糖類物質(zhì)(待發(fā)表)。利用活性跟蹤測(cè)試，Snea253 活性物質(zhì)對(duì)南方根結(jié)線蟲卵囊中卵孵化具有很強(qiáng)的抑制作用，對(duì)J2也有強(qiáng)烈的毒殺作用，24 h 校正死亡率即可達(dá)到98.21%，顯著高于各寡糖處理和空白對(duì)照。不同寡糖對(duì)南方根結(jié)線蟲的作用不同，相比Snea253 代謝產(chǎn)物的高活性而言，已知寡糖的作用非常微弱，有的甚至起到促進(jìn)南方根結(jié)線蟲卵孵化和J2 存活的作用。如半乳糖、果糖和木糖顯著促進(jìn)了南方根結(jié)線蟲的卵孵化，而葡萄糖、乳糖和蔗糖還有促進(jìn)J2 存活的作用，推測(cè)可能這些已知寡糖為線蟲卵孵化和J2 存活提供了營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。

致謝:感謝沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院于志國(guó)教授對(duì)本論文提供的建設(shè)性意見(jiàn)。

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