成媛媛，王建輝，劉永樂，王發(fā)祥，李向紅，俞 健，張開勤

長沙理工大學(xué)化學(xué)與生物工程學(xué)院，長沙 410114

脂肪具有宜人的口感，是許多風(fēng)味物質(zhì)的載體，深受消費(fèi)者喜愛，但過量攝入，會(huì)帶來肥胖癥、高血壓、心臟病、動(dòng)脈硬化、糖尿病、膽結(jié)石等健康問題。因此，在滿足人們對風(fēng)味追求的同時(shí)減少疾病的發(fā)生，以碳水化合物、蛋白質(zhì)或脂肪等為基料，混合乳化劑、增稠劑等制成，能被人體消化吸收但提供較低能量或不能被人體消化而對人體不提供能量的脂肪模擬物應(yīng)運(yùn)而生［1］。其中，蛋白質(zhì)基脂肪模擬物占很大一部分［2］。因蛋白質(zhì)變性后，分子中的疏水基團(tuán)和區(qū)域暴露于分子表面，能模擬油脂的疏水性狀，同時(shí)微?；鞍踪|(zhì)水合后，分散液中水合蛋白質(zhì)顆粒直徑可以小于10 μm，此時(shí)，舌頭不能分辨出單個(gè)顆粒，制品不再具有粗糙的顆粒感，因而能模擬出脂肪良好的潤滑、奶油狀感官特征［3］。

大豆分離蛋白［4］(soy protein isolate，SPI)是以大豆為原料生產(chǎn)而成的優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)，其蛋白含量超過90%，消化利用率高達(dá)93%～97%，并且其起泡性、溶解性、乳化性、粘彈性、凝膠性和吸水吸油性等性能優(yōu)良。大豆分離蛋白及其水解液能降低肝臟脂肪合成酶的活性，降低血漿中葡萄糖水平，加快脂肪與能量新陳代謝。因此，其產(chǎn)品可作為治療肥胖癥中限制飲食能量的最合適的蛋白質(zhì)來源［5］。用大豆分離蛋白作為脂肪模擬物不僅能提供優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)來源，還能減少脂肪中能量的攝入，從而降低因脂肪的過量攝入而引起的肥胖、高血壓、高血脂等富貴病。目前大豆分離蛋白改性方法有物理法、化學(xué)法、酶法和基因工程法等，本文主要采用物理改性法，對大豆分離蛋白實(shí)施濕熱處理形成松散柔軟的疏水性蛋白質(zhì)顆粒，再經(jīng)高速剪切處理，從而研制出能模擬天然油脂潤滑、細(xì)膩口感特性，獲得與市售植物油相似的流變特性，且具有較好乳化穩(wěn)定性的大豆分離蛋白基脂肪模擬物。

1 材料與方法

1.1 原料與試劑

大豆分離蛋白，自制(堿提酸沉法，其蛋白含量達(dá)90%以上);長康均衡調(diào)和油，市購;十二烷基硫酸鈉(SDS)(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)。

1.2 儀器與設(shè)備

AR1500ex 流變儀(美國TA 公司);T10 均質(zhì)機(jī)(德國IKA 公司);AUY120 島津電子分析天平(日本島津公司);DF-101S 集熱式恒溫加熱磁力攪拌器(鞏義市予華儀器有限公司);78-1 磁力加熱攪拌器(金壇市醫(yī)療儀器廠);DS-1 高速組織搗碎機(jī)(上海標(biāo)本模型廠制造);UV2600 型紫外可見分光光度計(jì)(上海舜寧恒平科學(xué)儀器有限公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 粘度的測定

采用AR1500ex 流變儀，直徑為40 mm 平行板夾具，間距1000 μm，測量溫度25 ℃，穩(wěn)態(tài)模式，剪切速率范圍:0.1～100 s-1，測定粘度及剪切應(yīng)力隨剪切速率的變化。

1.3.2 乳化性的測定

取50 mL 改性后的大豆分離蛋白溶液于高速組織搗碎機(jī)，加入同體積植物油，以20000 r/min 均質(zhì)2 min，從乳濁液底部以t 時(shí)間間隔(t 分別為0、30 min)取100 μL 乳濁液，迅速與10 mL 0.1%的SDS溶液混合，于500 nm 波長下測定t 時(shí)刻的吸光度。乳化穩(wěn)定性用ESI表示:

1.3.3 改性條件的單因素實(shí)驗(yàn)

1.3.3.1 蛋白質(zhì)濃度

固定加熱溫度90 ℃、加熱時(shí)間20 min、均質(zhì)時(shí)間30 s，考察不同蛋白質(zhì)濃度(6%、7%、8%、9%、10%，g/mL)對大豆分離蛋白溶液流變性能及乳化穩(wěn)定性的影響。

1.3.3.2 加熱溫度

固定蛋白質(zhì)濃度9%、加熱時(shí)間20 min、均質(zhì)時(shí)間30 s，考察不同加熱溫度(50、60、70、80、90 ℃)對大豆分離蛋白溶液流變性能及乳化穩(wěn)定性的影響。

1.3.3.3 加熱時(shí)間

固定蛋白質(zhì)濃度9%、加熱溫度80 ℃、均質(zhì)時(shí)間30 s，考察不同加熱時(shí)間(10、20、30、40、50 min)對大豆分離蛋白溶液流變性能及乳化穩(wěn)定性的影響。

1.3.3.4 均質(zhì)時(shí)間

固定蛋白質(zhì)濃度9%、加熱溫度80 ℃、加熱時(shí)間10 min，考察不同均質(zhì)時(shí)間(10、20、30、40、50 s)對大豆分離蛋白溶液流變性能與乳化穩(wěn)定性的影響。

1.3.4 二因素正交中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選取加熱溫度與蛋白濃度兩個(gè)因素進(jìn)行響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)［7］，旨以得到與植物油相似流變性能(取剪切速率為100 s-1下的粘度進(jìn)行比較)及具有良好乳化穩(wěn)定性的大豆分離蛋白樣品。具體因素水平見表1。

表1 二因素正交中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)表Table 1 Two factors orthogonal center composition design

2 結(jié)果與討論

2.1 調(diào)和油流變性

由圖1 可知，當(dāng)剪切速率大于10 s-1時(shí)，調(diào)和油粘度隨剪切速率的增加變化不大，表現(xiàn)為牛頓流體的特性;當(dāng)剪切速率在0～10 s-1范圍內(nèi)時(shí)，調(diào)和油粘度隨剪切速率的增加顯著下降，可能緣于在微小剪切力擾動(dòng)作用增加的過程中，分子間的相互作用逐漸遭破壞，粘度有所下降。本研究主要為模擬調(diào)和油流變性能，以獲得與調(diào)和油流變性能相近且乳化穩(wěn)定性良好的變性大豆分離蛋白，進(jìn)行中心組合試驗(yàn)時(shí)選取剪切速率為100 s-1條件下調(diào)和油粘度46.3 mPa·s 作為參照值。

圖1 調(diào)和油粘度與剪切速率曲線Fig.1 Viscosity and shear rate curve of blend oil

2.2 蛋白質(zhì)濃度對大豆分離蛋白改性的影響

蛋白質(zhì)的粘度是指液體流動(dòng)時(shí)表現(xiàn)出的內(nèi)摩擦，而感官評(píng)定中的滑膩感主要與其粘度呈明顯正相關(guān)。大豆分離蛋白經(jīng)熱處理后，溶液的表觀粘度隨蛋白質(zhì)濃度增加而升高。乳化穩(wěn)定性是蛋白質(zhì)的一種重要功能性質(zhì)，表征了大豆分離蛋白維持兩相穩(wěn)定存在的能力［8］。如圖2 所示，各蛋白溶液的粘度均隨剪切速率的增加而減小，表現(xiàn)為假塑性流體。在同一剪切速率下，隨蛋白質(zhì)濃度的增加粘度增大，由于蛋白質(zhì)濃度增加，蛋白質(zhì)分子間的作用增強(qiáng)，分子間結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，從而使大豆分離蛋白溶液的粘度增大［9］，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)濃度為9%時(shí)，其粘度與調(diào)和油粘度最為接近，且其流體行為越接近于理想狀態(tài)的牛頓流體。由圖3 知，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)濃度低于9%時(shí)，乳化穩(wěn)定性隨蛋白質(zhì)濃度的增加而增加，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)濃度高于9%時(shí)，其乳化穩(wěn)定性的變化趨于平緩。這是緣于低濃度下表面張力隨蛋白質(zhì)濃度增加而迅速減小，當(dāng)濃度上升到一定程度時(shí)，每50～200 個(gè)蛋白質(zhì)分子聚集成團(tuán)形成膠束，從而乳化性提高，但當(dāng)乳液達(dá)到臨界膠束濃度后，油水界面上的蛋白質(zhì)不隨濃度增加而增多，導(dǎo)致乳化穩(wěn)定性不再升高［10］。因此，此條件下選擇最佳濃度蛋白質(zhì)濃度為9%。

圖2 不同蛋白質(zhì)濃度下改性蛋白溶液粘度與剪切速率曲線Fig.2 Viscosity and shear rate curve of soy protein modified under different concentrations

圖3 蛋白質(zhì)濃度對改性蛋白溶液乳化穩(wěn)定性的影響Fig.3 Effect of protein concentration on emulsion stability of soy protein modification

2.3 加熱溫度對大豆分離蛋白改性的影響

蛋白質(zhì)的熱處理會(huì)造成蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)變化、肽鍵水解、氨基酸側(cè)鏈的改性以及蛋白質(zhì)分子與其他分子間的縮合，大豆分離蛋白的乳化作用取決于可溶性氮的溶解指數(shù)。隨溫度的升高，蛋白質(zhì)分子的熱運(yùn)動(dòng)增強(qiáng)，內(nèi)部結(jié)構(gòu)被破壞，分子間的粘滯作用減弱，蛋白質(zhì)溶液的粘度降低。而大豆分離蛋白的變性溫度一般在50 ℃，隨溫度的升高，其氮溶解指數(shù)降低，變性之后，隨溫度升高，蛋白質(zhì)主鏈上的疏水性基團(tuán)展開，疏水氨基酸暴露，使大豆分離蛋白溶液在油水界面中具有很好的定位［9］。由圖4 可知，在不同溫度下，蛋白質(zhì)溶液的粘度均隨剪切速率的增加而減小，表現(xiàn)為假塑性流體。同一剪切速率下，其粘度隨加熱溫度的增加而減小，當(dāng)加熱溫度為80 ℃時(shí)，蛋白質(zhì)溶液粘度與調(diào)和油粘度最為接近，且其流體行為越接近于理想狀態(tài)的牛頓流體。由圖5 知，大豆分離蛋白溶液的乳化穩(wěn)定性隨加熱溫度的升高而增強(qiáng)，當(dāng)加熱溫度為80 ℃時(shí)大豆分離蛋白溶液的乳化穩(wěn)定性基本趨于穩(wěn)定，綜合考慮選取80 ℃為最佳改性溫度。

圖4 不同加熱溫度下改性蛋白溶液粘度與剪切速率曲線Fig.4 Viscosity and shear rate curve of soy protein modified with different heating temperature

圖5 加熱溫度對改性蛋白溶液乳化穩(wěn)定性的影響Fig.5 Effect of heating temperature on emulsion stability of soy protein modification

2.4 加熱時(shí)間對大豆分離蛋白改性的影響

熱處理有利于促進(jìn)蛋白質(zhì)分子表面暴露的疏水性氨基酸殘基的增加，并伴隨著油膜厚度的增加，蛋白質(zhì)的乳化穩(wěn)定性增強(qiáng)。但過度的熱處理，大豆分離蛋白7S 各亞基及部分11S 酸性亞基和堿性亞基發(fā)生聚合，形成分子量更高的聚合物。由于空氣的粘度低，與蛋白質(zhì)疏水基團(tuán)的相互作用較弱，高分子量的蛋白質(zhì)聚合物擴(kuò)散到氣/水界面及在界面的吸附能力也較低，從而降低了蛋白質(zhì)的粘度與乳化穩(wěn)定性［6］。由圖6 可知，蛋白質(zhì)溶液流變特性均為剪切變稀，表現(xiàn)為假塑性流體。隨著加熱時(shí)間延長其粘度總體呈現(xiàn)下降趨勢，當(dāng)加熱時(shí)間為10 min，隨剪切速率的增大其剪切稀化行為趨于平緩，接近于理想狀態(tài)的牛頓流體，與調(diào)和油流變行為最為接近。由圖7 知，當(dāng)加熱時(shí)間低于20 min 時(shí)，大豆分離蛋白溶液乳化穩(wěn)定性均變化不大，當(dāng)加熱時(shí)間高于20 min 時(shí)，其乳化穩(wěn)定性逐漸下降。因此，綜合選取加熱時(shí)間為10 min。

圖6 不同加熱時(shí)間下改性蛋白溶液粘度與剪切速率曲線Fig.6 Viscosity and shear rate curve of soy protein modified with different heating time

圖7 加熱時(shí)間對改性蛋白溶液乳化穩(wěn)定性的影響Fig.7 Effect of heating time on emulsion stability of soy protein modification

2.5 均質(zhì)時(shí)間對大豆分離蛋白改性的影響

大豆分離蛋白在變性條件下因變性而展開，發(fā)生粘附，凝聚形成較大的顆粒，從而不能模擬脂肪的感官特性，因此在大豆分離蛋白變性、凝聚過程中進(jìn)行高速剪切處理，即可防止較大凝聚顆粒的形成，使顆粒大小保持在0.1～2.0 μm，處于舌頭感官閾值之下，此時(shí)舌頭分辨不出，可模擬脂肪良好的潤滑、奶油狀感官特性［11］。由圖8 可知，蛋白質(zhì)溶液均為剪切變稀，表現(xiàn)為假塑性流體。隨著均質(zhì)時(shí)間的延長其稀化行為減弱，當(dāng)剪切速率增加到100 s-1時(shí)，不同均質(zhì)時(shí)間下的蛋白溶液粘度均較接近調(diào)和油粘度，且40 s 條件下最為接近。由圖9 知，均質(zhì)時(shí)間對大豆分離蛋白溶液乳化穩(wěn)定性的影響不大，當(dāng)均質(zhì)時(shí)間為40 s 時(shí)乳化穩(wěn)定性達(dá)最大，綜合考慮，選取40 s 為最佳均質(zhì)時(shí)間。

圖8 不同均質(zhì)時(shí)間下改性蛋白溶液粘度與剪切速率曲線Fig.8 Viscosity and shear rate curve of soy protein modified with different homogeneity time

圖9 均質(zhì)時(shí)間對改性蛋白溶液乳化穩(wěn)定性的影響Fig.9 Effect of homogeneity time on emulsion stability of soy protein modification

2.6 加熱溫度和蛋白質(zhì)濃度對大豆分離蛋白改性的影響

在確定加熱時(shí)間10 min，均質(zhì)時(shí)間40 s 的條件下，以蛋白質(zhì)濃度和加熱溫度為影響因子，以大豆分離蛋白溶液粘度(剪切速率為100 s-1下)和乳化穩(wěn)定性為響應(yīng)值，通過響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)研究物理改性對大豆分離蛋白粘度與乳化穩(wěn)定性的影響。利用Design-expert 軟件對試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行二次多元回歸擬合，實(shí)驗(yàn)結(jié)果及擬合方程分別見表2、3。

由表3 可知，得到的兩個(gè)數(shù)學(xué)擬合模型的R2值分別為0.93 和0.96，可見通過多元二次回歸得到的Y1和Y2的模型與試驗(yàn)擬合很好，具有較高的可靠性。當(dāng)P 值小于0.01 時(shí)，即表示該項(xiàng)指標(biāo)極顯著。根據(jù)Y1和Y2的模型的方差分析結(jié)果，推測出大豆分離蛋白粘度及乳化穩(wěn)定性建立的回歸整體數(shù)學(xué)模型均為極顯著(P ＜0.01)。

對于大豆分離蛋白溶液粘度(Y1)模型，擬合數(shù)學(xué)模型的方差分析結(jié)果表明模型中兩個(gè)因素的平方項(xiàng)影響為極顯著(P ＜0.01)(表4)。同時(shí)，由兩個(gè)因素的F 值大小可推斷，在所選擇的試驗(yàn)條件下，兩個(gè)因素對大豆分離蛋白溶液粘度的影響的排序?yàn)?蛋白質(zhì)濃度＞加熱溫度。對于大豆分離蛋白溶液乳化穩(wěn)定性(Y2)模型，擬合數(shù)學(xué)模型的方差分析結(jié)果表明模型中兩個(gè)因素的線性和平方項(xiàng)的影響為極顯著(P ＜0.01)(表4)。根據(jù)兩個(gè)因素的F 值大小可推斷，在所選擇的試驗(yàn)條件下，兩個(gè)因素對大豆分離蛋白溶液乳化穩(wěn)定性的影響的排序?yàn)?蛋白質(zhì)濃度＞加熱溫度。

根據(jù)回歸方程作出等高線圖及響應(yīng)曲面圖(圖10，圖11)，由等高線圖可以看出在蛋白質(zhì)濃度較大而溫度適中時(shí)，大豆分離蛋白的粘度與調(diào)和油接近，且乳化穩(wěn)定性較高。應(yīng)用Design-expert 軟件優(yōu)化程序，得到最佳大豆分離蛋白改性工藝參數(shù):蛋白質(zhì)濃度9.08%、加熱溫度79.59 ℃，此條件下大豆分離蛋白粘度為46.3 mPa·s，乳化穩(wěn)定性為50.13 min。

考慮實(shí)際操作的可行性，將大豆分離蛋白物理改性的工藝條件修正為蛋白質(zhì)濃度9.10%、加熱溫度79.6 ℃，在此優(yōu)化條件下進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)3 次，測得大豆分離蛋白溶液的粘度為46.8 mPa·s，理論預(yù)測值為46.3 mPa·s;乳化穩(wěn)定性為49.15 min，理論預(yù)測值為50.13 min。預(yù)測值與實(shí)測值非常接近，偏差較小，說明試驗(yàn)設(shè)計(jì)和數(shù)學(xué)模型具有可靠性與重現(xiàn)性。

表2 正交中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)表及實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 Result of two factor orthogonal center composition design experiments

表3 模型擬合結(jié)果Table 3 Outcomes of model fitting

表4 模型方差分析Table 4 Variance analysis of model

注:* 影響顯著，P ＜0.05;＊＊影響極顯著，P ＜0.01。Note:* significant(P ＜0.05)，＊＊ very significant(P ＜0.01).

圖10 蛋白質(zhì)濃度和加熱溫度對大豆分離蛋白溶液粘度的影響Fig.10 Effect of protein concentrations and heating temperature on viscosity of SPI

圖11 蛋白質(zhì)濃度和加熱溫度對大豆分離蛋白溶液乳化穩(wěn)定性的影響Fig.11 Effect of protein concentrations and heating temperature on emulsion stability of SPI

3 結(jié)論

隨著現(xiàn)代生活中因高脂肪攝入所導(dǎo)致的肥胖等富貴病的涌現(xiàn)，脂肪模擬物已倍受人們關(guān)注，并成為一股不可逆轉(zhuǎn)的潮流［12］。本文是以市售植物油為參考，以大豆分離蛋白為原料通過物理改性法模擬油脂，以期達(dá)到與市售植物油相似的流變特性，并具有良好的乳化穩(wěn)定性。在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，運(yùn)用響應(yīng)面法對大豆分離蛋白改性工藝進(jìn)行優(yōu)化，大豆分離蛋白基脂肪模擬物的最佳工藝條件為蛋白質(zhì)濃度9.10%、加熱溫度79.6 ℃、加熱時(shí)間10 min、均質(zhì)時(shí)間40 s，此時(shí)，溶液粘度達(dá)到46.8 mPa·s，乳化穩(wěn)定性為49.15 min，其粘度與乳化穩(wěn)定性與市售調(diào)和油相似，可模擬出脂肪良好的潤滑、奶油狀口感。大豆分離蛋白濕熱變性暴露出多肽鏈上的疏水基團(tuán)，產(chǎn)生親油性而提高蛋白質(zhì)的乳化特性，進(jìn)而改善低脂食品的質(zhì)構(gòu)［13］，從而能作為蛋白質(zhì)基模擬脂肪。脂肪模擬物已被消費(fèi)者所接受，其市場前景廣闊，但目前尚無可完全取代脂肪功能特性與感官特性的理想的單一脂肪模擬物，而本研究以單一的大豆分離蛋白為研究對象，通過粘度和乳化性能的擬合，得到了最佳擬合參數(shù)，然以期達(dá)到更好的模擬效果，仍需開展進(jìn)一步的研究。

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