田 偉 ，馮玉萍，李明生，崔夢楠，靳冬武，龍仕和，馬忠仁*

1西北民族大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院;2 甘肅省動物細(xì)胞工程技術(shù)研究中心，蘭州 730030

水解乳蛋白是乳蛋白經(jīng)蛋白酶或肽酶水解的產(chǎn)物，含有豐富的氨基酸和多肽，可為細(xì)胞生長提供多種營養(yǎng)成分、貼壁因子及生長因子類似物等［1］，廣泛用于生物制藥、疫苗、食品等行業(yè)。Eagle 等［2，3］20 世紀(jì)50 年代將水解乳蛋白用于細(xì)胞和微生物培養(yǎng)基，隨后Mamoru［4］，Amiot［5］等分別將水解乳蛋白用于皮膚、器官等多種細(xì)胞的培養(yǎng)。我國學(xué)者張爾賢［6］于1986 年從原料、酶制劑及產(chǎn)品檢測等多個角度探討了細(xì)胞培養(yǎng)用水解乳蛋白的研制過程，這為國內(nèi)水解乳蛋白的研制奠定了基礎(chǔ)。

目前國內(nèi)水解乳蛋白主要以美國Hyclone 和Gibco 產(chǎn)品為主，開發(fā)水解乳蛋白在國內(nèi)具有廣闊的市場前景。試驗(yàn)針對傳統(tǒng)工藝水解率低，氨基酸破壞程度高，污染環(huán)境等缺陷，選取天然牧區(qū)凝乳酶干酪素為原料，用復(fù)合蛋白酶水解酪蛋白，以多肽含量和氨基氮含量為指標(biāo)優(yōu)化酶解工藝，對所得粗制品進(jìn)行游離氨基酸等一系列檢測。最后選取兩種常用的動物細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，研究其對動物細(xì)胞生長的影響，以期為細(xì)胞培養(yǎng)用水解乳蛋白的大規(guī)模生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

凝乳酶干酪素為甘肅省動物細(xì)胞工程技術(shù)研究中心自制;胰酶由西北民族大學(xué)生物工程與技術(shù)國家民委重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供(胰蛋白酶1298 U/g;胰淀粉酶17503 U/g;胰脂肪酶7200 U/g);中性蛋白酶購自南寧龐博(20 萬U/g);谷胱甘肽標(biāo)準(zhǔn)品購自索萊寶公司。

1.2 儀器與設(shè)備

L-8900 氨基酸分析儀(日本日立);SD-1500 噴霧干燥機(jī)(上海沃迪科技);BioMate5 紫外分光光度計(jì)(美國Thermo Fisher);SG-2 pH 計(jì)(美國METTLER TOLEDO);HJ-6A 加熱攪拌器(常州國華);LC-6M 離心機(jī)(上海離心機(jī)械研究所);CKX41 顯微鏡(OLYMPUS)。

1.3 方法

1.3.1 最佳工藝條件的確定

根據(jù)復(fù)合酶的最佳使用條件并結(jié)合單因素試驗(yàn)結(jié)果確定各因素適合的酶解范圍，設(shè)計(jì)L9(34)正交試驗(yàn)，方案見表1。

表1 正交試驗(yàn)方案Table 1 Orthogonal experiment design

1.3.2 水解乳蛋白的制備

配制5%［5］的酪蛋白水溶液，pH 調(diào)至8.0，加熱至完全溶解，迅速冷卻，按L9(34)正交試驗(yàn)篩選得最優(yōu)組合控制酶解條件，反應(yīng)結(jié)束后將反應(yīng)體系置于沸水浴中維持10 min，迅速冷卻，離心取上清噴霧干燥。

噴干條件:進(jìn)風(fēng)溫度180 ℃，出風(fēng)溫度90 ℃，風(fēng)速45 Hz，流速200 mL。

1.3.3 蛋白水解液中氨基氮含量測定

氨基氮含量的測定參考甲醛滴定法［7］。

1.3.4 蛋白水解液多肽含量測定

采用肽鍵測定法［8］。所得回歸方程:Y=0.095X+0.004，R2=1.0000。

1.3.5 游離氨基酸測定

樣品前處理［9］:準(zhǔn)確移取水解蛋白液于試管中，加入等體積5% 的三氯乙酸，充分震蕩搖勻，3800 rpm 離心5 min，除去蛋白，取上清液用0.45 μm 微孔濾膜過濾后上機(jī)。

色譜條件:泵1(洗脫溶液)流速:0.100 mL/min;泵2(茚三酮溶液)流速:0.100 mL/min;分析柱溫度:50 ℃;反應(yīng)柱溫度:135 ℃;進(jìn)樣體積:20 μL。

1.3.6 細(xì)胞培養(yǎng)試驗(yàn)

配制水解乳蛋白終濃度為0.2%含10%胎牛血清的MEM 培養(yǎng)基，用對應(yīng)濃度的Hyclone 產(chǎn)品作為對照，以1.0 ×104/mL 的細(xì)胞濃度接種BHK 和Vero 細(xì)胞于96 孔板培養(yǎng)。每隔24 h 觀察細(xì)胞生長情況，并計(jì)數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 最佳工藝條件的確定

2.1.1 水解時間的確定

試驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示不同條件下水解時間對氨基氮含量的影響呈現(xiàn)一定規(guī)律性，結(jié)果見圖1。

圖1 水解時間對氨基氮的影響Fig.1 The influence of hydrolysis time on amino nitrogen content

水解乳蛋白需具有滿足細(xì)胞生長所需要的多種氨基酸［6］，而氨基氮含量與游離氨基酸含量成正比。從圖1 可看出，不同反應(yīng)條件下，產(chǎn)物中氨基氮含量在反應(yīng)初期緩慢上升，至6 h 最大，隨后緩慢降低至平穩(wěn)。這是由于反應(yīng)初期酪蛋白解聚不徹底，與酶結(jié)合較少;一段時間后底物徹底解聚，底物上反應(yīng)位點(diǎn)逐漸被酶分子飽和。因此，水解乳蛋白制備的水解時間為6 h。

2.1.2 工藝條件的優(yōu)化

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Results of orthogonal experiment

2.1.2.1 以氨基氮含量為指標(biāo)的正交試驗(yàn)結(jié)果分析

表2 中以氨基氮含量為指標(biāo)的極差分析顯示，各因素影響氨基氮含量的主次順序?yàn)?酶量＞酶組分＞溫度＞pH，最優(yōu)組合為A1B1C1D1。

2.1.2.2 以多肽含量為指標(biāo)的正交試驗(yàn)結(jié)果分析

由表2 以多肽含量為指標(biāo)的極差分析顯示，各因素對多肽含量影響的主次順序?yàn)?酶量＞pH ＞溫度＞酶組分，最優(yōu)組合為A1B1C1D1。

綜上所述，各因素對兩個指標(biāo)影響的主次順序略有差異，但對兩者影響的最優(yōu)組合是一致的。因此，復(fù)合蛋白酶(胰酶:中性蛋白酶=2∶1)水解酪蛋白制備水解乳蛋白的最優(yōu)工藝條件為:40 ℃，pH=7.0，E/S=1∶5 水解6 h。

2.2 對自制水解乳蛋白的檢測

按正交試驗(yàn)篩選的最優(yōu)條件進(jìn)行不同規(guī)模放大驗(yàn)證試驗(yàn)，對產(chǎn)物進(jìn)行分析，結(jié)果如下:

2.2.1 氨基氮及多肽含量測定

表3 不同批次放大驗(yàn)證試驗(yàn)Table 3 Different batches validation test

結(jié)果表明，在最優(yōu)條件下，不同規(guī)模放大各指標(biāo)基本穩(wěn)定，收率(以酪蛋白算)為40.20%，氨基氮含量平均為3.21 g/L，多肽含量平均為35.63 g/L。

2.2.2 氨基酸組分測定

配制5%的自制水解乳蛋白，以5%的Hyclone水解乳蛋白作對照，測定常用18 種游離氨基酸組分，圖譜見圖2。

圖2 Hyclone 對照品(A)和樣品(B)的氨基酸色譜圖Fig.2 Chromatograms of Hyclone standard (A)and sample (B)

在細(xì)胞培養(yǎng)過程中使用水解乳蛋白目的是滿足細(xì)胞生長所需要的多種氨基酸，不僅種類上有要求，而且需要保證各種氨基酸的數(shù)量［10］。由圖2 看出，自制樣品分離效果較好，與Hyclone 產(chǎn)品基本一致。自制品和對照品均有17 種常用游離氨基酸，各氨基酸含量有一定的差異，結(jié)果見表4。

表4 產(chǎn)物氨基酸組成Table 4 Amino acids composition of the lacto-protein hydrolysate

由表4 可看出，自制水解乳蛋白中賴氨酸、精氨酸、苯丙氨酸含量高，這與胰酶中胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶的專一性有關(guān)。其中酸性氨基酸(如谷氨酸、纈氨酸、亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸等)含量較高，這與酪蛋白有明顯酸性是一致的。酪蛋白中超過55%的氨基酸有極性基團(tuán)，而水解產(chǎn)物中極性氨基酸含量均較高。另外，自制水解乳蛋白氨基酸總量也明顯高于對照品，而個別氨基酸卻遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于對照品。這與兩者所用原料不同有關(guān)。

2.3 水解乳蛋白對細(xì)胞生長的影響

通過細(xì)胞計(jì)數(shù)和細(xì)胞形態(tài)圖反應(yīng)水解乳蛋白對細(xì)胞生長的影響，結(jié)果如下:

2.3.1 細(xì)胞計(jì)數(shù)

由表5(細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果)可看出，細(xì)胞培養(yǎng)24 h時，BHK 和Vero 細(xì)胞的密度分別為4.0 ×104/mL和6.0 ×104/mL，兩者均為各自空白的2.0 倍;與Hyclone 產(chǎn)品相比，BHK 和Vero 細(xì)胞的密度分別是Hyclone 的1.0 倍和0.86 倍。48 h 時，BHK 和Vero細(xì)胞的密度分別為1.5 ×105/mL 和1.6 ×105/mL，是各自空白的5.0 倍和4.0 倍，與Hyclone 產(chǎn)品相比，兩細(xì)胞密度均是Hyclone 的0.88 倍。因此，添加水解乳蛋白對BHK 和Vero 細(xì)胞生長有明顯的促進(jìn)作用，且自制樣品和Hyclone 產(chǎn)品相差不明顯。

表5 細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果Table 5 Cell count result

2.3.2 細(xì)胞形態(tài)圖

圖3 水解乳蛋白培養(yǎng)BHK 和Vero 細(xì)胞Fig.3 BHK and Vero cells cultured with lacto-protein hydrolysate

從圖3(細(xì)胞整體形態(tài))可看出，添加水解乳蛋白對BHK 和Vero 細(xì)胞生長有明顯的促進(jìn)作用。自制水解乳蛋白和Hyclone 產(chǎn)品差別不明顯。這是因?yàn)榈鞍姿馕镌谝欢l件下可提高細(xì)胞活力，促進(jìn)細(xì)胞增殖。

在細(xì)胞培養(yǎng)過程中我們發(fā)現(xiàn)添加水解乳蛋白濃度過高或過低對細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用均有抑制。這是由于濃度過低營養(yǎng)物質(zhì)未達(dá)到最大化;濃度過高時水解乳蛋白中某種抑制細(xì)胞生長的氨基酸濃度過大抑制了細(xì)胞的生長，或者某些氨基酸的濃度過大使培養(yǎng)基的某些環(huán)境發(fā)生改變，對細(xì)胞的生長產(chǎn)生抑制。

3 結(jié)論

水解乳蛋白制備的最優(yōu)工藝為:復(fù)合蛋白酶(胰酶∶中性蛋白酶=2∶1)，40 ℃，pH 7.0，E/S=1∶5(重量比)水解6 h。在此工藝條件下，氨基氮含量3.21 g/L，多肽含量35.63 g/L，噴干收率(以酪蛋白計(jì))達(dá)40.20%。自制水解乳蛋白對兩種細(xì)胞有明顯促進(jìn)作用，且與Hyclone 產(chǎn)品差異不明顯。這為細(xì)胞培養(yǎng)用水解乳蛋白的大規(guī)模生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。

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