朱靖博 ，韓聰敏，丁 燕，寇自農(nóng)，王振中，蕭 偉

1大連工業(yè)大學(xué)食品學(xué)院;2 大連工業(yè)大學(xué)分析測(cè)試中心，大連 116034;3江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司，連云港 222001

中藥現(xiàn)代化的核心是對(duì)中藥成分的系統(tǒng)性認(rèn)識(shí)，包括化學(xué)成分與藥理活性的認(rèn)識(shí)，其中化學(xué)成分認(rèn)識(shí)的前提是對(duì)化學(xué)成分的系統(tǒng)性分離。中藥成分具有種類(lèi)繁多、共存多種結(jié)構(gòu)類(lèi)似物、化學(xué)穩(wěn)定性差、理化性質(zhì)跨度大等特點(diǎn)［1，2］。針對(duì)中藥特點(diǎn)制定系統(tǒng)分離方法是實(shí)現(xiàn)中藥現(xiàn)代化的關(guān)鍵，而色譜分離技術(shù)是實(shí)現(xiàn)中藥成分系統(tǒng)分離的有效手段;植物提取物的色譜條件篩選及快速分離制備已有相關(guān)報(bào)導(dǎo)［3，4］。至今已從牡丹皮中發(fā)現(xiàn)了80 多種化學(xué)成分，包括丹皮酚類(lèi)、芍藥苷類(lèi)、黃酮類(lèi)、三萜類(lèi)、甾體類(lèi)等多種化合物［5］。鑒于中藥成分的復(fù)雜性和色譜分離技術(shù)的特殊性，提高色譜分離效率、降低色譜柱污染，研究系統(tǒng)化色譜分離方法分離牡丹皮中的化學(xué)成分，形成具有指導(dǎo)意義的體系與程序?qū)τ谥兴幀F(xiàn)代化研究具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

牡丹皮藥材由江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司提供。分析級(jí)甲醇、正己烷、乙酸乙酯、氯仿、正丁醇、二氯甲烷、丙酮，天津大茂化學(xué)試劑廠(chǎng);工業(yè)級(jí)甲醇、氯仿、丙酮，天津科密歐化學(xué)試劑有限公司;色譜級(jí)乙腈，美國(guó)Tedia 公司;超純水，實(shí)驗(yàn)室自制。

高效液相色譜儀UltiMate3000，美國(guó)戴安公司;R502B 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、SHZ-D (Ⅲ)循環(huán)水式真空泵，鞏義予華儀器責(zé)任有限公司;升降恒溫水浴鍋，英峪高科儀器廠(chǎng);硅膠GF254板、薄層層析硅膠，青島海洋化工有限公司;制備柱4 cm ×40 cm，實(shí)驗(yàn)室自制;P270 高壓恒流泵，大連依利特公司。

圖1 牡丹皮化學(xué)成分系統(tǒng)分離流程Fig.1 Systematic separation flow chart of chemical components from Moutan Cortex

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 HPLC 分析條件

HPLC 條件:Diamonsil C18(250 mm×4.6 mm i.d.，5 μm);進(jìn)樣量20 μL，流速0.8 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm，柱溫為室溫。流動(dòng)相0.01% 甲酸-水(A)和乙腈(B)。線(xiàn)形梯度洗脫程序?yàn)?0～2 min，5% B;2～30 min，5%～16% B;30～70 min，16%～33% B;70～80 min，33%～80% B。

1.2.2 系統(tǒng)化色譜分離方法研究路線(xiàn)

總體思路:甲醇提取牡丹皮藥材得到提取物，對(duì)提取物進(jìn)行系統(tǒng)溶劑萃取評(píng)價(jià);經(jīng)TLC 和HPLC 分析選出適宜的前處理萃取溶劑。再對(duì)每個(gè)部位進(jìn)行色譜分離條件篩選。選定其中一個(gè)部位，研究色譜分離條件的篩選方法，利用薄層色譜中Rf值與柱色譜洗脫速度之間的關(guān)系，進(jìn)行多階梯梯度分離預(yù)測(cè);同時(shí)進(jìn)行制備柱色譜分離驗(yàn)證預(yù)測(cè)結(jié)果。本文以牡丹皮正己烷相經(jīng)真空液相層析后得到的Fr1.3 組分為例，論證色譜分離洗脫體系及洗脫強(qiáng)度篩選，確定組分的色譜分離條件的過(guò)程?？傮w路線(xiàn)如圖1 所示。

1.2.3 藥材提取

牡丹皮藥材8.90 kg，粉碎過(guò)篩后甲醇加熱回流提取(料液比1∶6)3 次，每次2 h，合并濃縮得到甲醇提取物。

1.2.4 系統(tǒng)溶劑萃取評(píng)價(jià)

分別稱(chēng)取4.0 g 牡丹皮甲醇提取物三份，加水至320 mL，用50%碳酸氫鈉溶液調(diào)節(jié)pH 分別至4、7、9。按照?qǐng)D2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行萃取評(píng)價(jià)，TLC、HPLC分析所得樣品成分變化，確定色譜前處理的萃取溶劑。TLC 分析條件:有機(jī)相為V正己烷:V丙酮=7∶3，水相為V氯仿:V甲醇=8∶2，顯色劑為5%香草醛濃硫酸。

圖2 牡丹皮甲醇提取物系統(tǒng)溶劑萃取評(píng)價(jià)Fig.2 Evaluation of systematic solvent extraction of Moutan Cortex methanol extract

圖3 正相色譜分離條件系統(tǒng)篩選Fig.3 Systemic screening of separation condition in normal phase chromatography

表1 TLC 展開(kāi)溶劑系統(tǒng)篩選實(shí)驗(yàn)條件Table 1 Systemic screening of TLC solvent system

1.2.5 色譜分離條件研究

1.2.5.1 待分離組分準(zhǔn)備

牡丹皮甲醇提取物經(jīng)正己烷、乙酸乙酯依次萃取，得到正己烷相、乙酸乙酯相和水相三個(gè)組分。正己烷相樣品(240 g)經(jīng)硅膠真空液相柱層析V正己烷∶∶V丙酮=100∶0、90∶1、70∶1、50∶1、20∶1、1∶1 洗脫，合并各洗脫液，共得Fr1.1～Fr1.5 五個(gè)組分。

1.2.5.2 牡丹皮各部位色譜分離填料及流動(dòng)相篩選

牡丹皮正己烷、乙酸乙酯、氯仿、正丁醇、水相部位、正己烷相部位的Fr 1.3 分別用硅膠板、聚酰胺板和中性Al2O3板進(jìn)行薄層色譜分析，以斑點(diǎn)個(gè)數(shù)(N)、難分離物質(zhì)對(duì)ΔRf為指標(biāo)，考察三種填料的分離情況。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)見(jiàn)圖3。

1.2.5.3 流動(dòng)相洗脫比例篩選

在選定洗脫溶劑的基礎(chǔ)上進(jìn)行二元溶劑100∶0、99∶1、98∶2、97∶3 等的依次展開(kāi)，同時(shí)對(duì)洗脫初始條件進(jìn)行連續(xù)四次展開(kāi)，Rf考察范圍為0.10～0.70。

1.2.6 多階梯梯度分離預(yù)測(cè)

圖4 一階梯度(A)、二階梯度(B)洗脫色譜柱內(nèi)溶質(zhì)X、Y 預(yù)測(cè)分離圖Fig.4 Predicted column chromatography charts of first step gradient (A)and second step gradient (B)of compound X and Y

依據(jù)色譜理論［6］，容量因子k 與TLC 中比移值Rf滿(mǎn)足關(guān)系式k=1/Rf-1(1)，多階梯梯度洗脫色譜中［7］，溶質(zhì)在色譜柱內(nèi)的移動(dòng)速率滿(mǎn)足Ux=U0/(1+k)(2)(其中U0、Ux為色譜柱內(nèi)流動(dòng)相流速、化合物X移動(dòng)速度，圖4)，由(1)、(2)可得Ux=U0·Rf(3)，則第一個(gè)臺(tái)階洗脫下化合物X 的保留時(shí)間tRx=L/Ux=L/(U0·Rfx)=t0/Rfx，保留體積VRx=tRx·U0;第二個(gè)臺(tái)階梯度時(shí):在前一個(gè)臺(tái)階洗脫基礎(chǔ)上，未洗脫化合物Y 的保留時(shí)間tRy=(L-tRx·Uy1)/Uy2;VR2=tRy·U0。Uy1、Uy2分別是Y 在色譜柱內(nèi)第一、第二階梯洗脫下的移動(dòng)速度。選擇正己烷相Fr

1.3 進(jìn)行臺(tái)階梯度洗脫分離下保留值預(yù)測(cè)。

1.2.7 制備柱色譜分離

制備柱為4 ×40 cm，薄層硅膠干法裝柱，初始溶劑90 mL/min 沖洗至柱壓恒定，空柱體積V0=490 mL，洗脫流速25 mL/min，柱壓2.2～2.4 MPa，柱硅膠235～240 g。上樣量分別為0.55 g、1.55 g、3.95 g，參考上樣量公式［4］為SiO2g=151.2Sg+0.5，SiO2g=59.8Sg，洗脫餾分1/5 柱體積(約100 mL)。

2 結(jié)果與討論

2.1 藥材提取與分析

牡丹皮藥材8.90 kg 提取得到2.54 kg 浸膏，得率28.5%。液相色譜檢測(cè)結(jié)果(圖5)顯示牡丹皮甲醇提取物成分復(fù)雜，對(duì)化合物的分離制備需借助萃取等前處理技術(shù)及系統(tǒng)色譜條件篩選來(lái)完成復(fù)雜化學(xué)成分的系統(tǒng)性分離。

圖5 牡丹皮甲醇提取物HPLCFig.5 HPLC chromatogram of Moutan Cortex methanol extract

2.2 系統(tǒng)溶劑萃取評(píng)價(jià)

TLC 結(jié)果顯示:有機(jī)相與水相成分明顯不同，其中丹皮酚主要集中于正己烷相，且以酸性溶液中最顯著，pH 增大過(guò)程中，化合物的萃取效率增大(圖6，每個(gè)板點(diǎn)樣樣品依次為正己烷相、氯仿相、乙酸乙酯相、正丁醇相、丹皮酚、牡丹皮甲醇提取物)，氯仿相、乙酸乙酯相、正丁醇相成分區(qū)別不大;各水相成分則在pH 變大過(guò)程中斑點(diǎn)減少。說(shuō)明堿性條件利于提高萃取效率。HPLC 結(jié)果(圖7)顯示pH 改變對(duì)于正己烷相、氯仿相的影響不大，而乙酸乙酯相和正丁醇相變化顯著，以正丁醇萃取有機(jī)相為例，色譜峰明顯減少，說(shuō)明pH 增大牡丹皮化學(xué)成分改變，萃取適宜在原pH 下進(jìn)行。牡丹皮甲醇提取物系統(tǒng)萃取最終選擇在pH=4 下采用正己烷、乙酸乙酯依次萃取。

圖6 萃取評(píng)價(jià)有機(jī)相、水相TLC 結(jié)果Fig.6 TLC results of organic phase and water phase of Moutan Cortex methanol extract

圖7 不同pH 溶液有機(jī)萃取相HPLC 譜圖Fig.7 HPLC chromatograms of organic phase extract with different pH

2.3 柱色譜分離條件篩選

2.3.1 待分離組分分析

TLC 分析結(jié)果顯示正己烷相的Fr1.3 組分在香草醛濃硫酸顯色后有6 個(gè)斑點(diǎn)，HPLC 結(jié)果顯示主要有三個(gè)色譜峰，通過(guò)薄層制備對(duì)6 個(gè)化合物進(jìn)行分離，得到6 個(gè)化合物的單點(diǎn)，用同樣的HPLC 條件進(jìn)行分析對(duì)照，確定了TLC 與HPLC 的對(duì)應(yīng)關(guān)系。如圖8 所示，TLC 中2、3、4 斑點(diǎn)分別對(duì)應(yīng)HPLC 三個(gè)色譜峰。

圖8 Fr1.3 組分TLC、HPLC 分析Fig.8 TLC and HPLC analysis results of Fr1.3

2.3.2 分離流動(dòng)相篩選

采用1.2.5.2 流動(dòng)相篩選體系，以斑點(diǎn)個(gè)數(shù)、難分離物質(zhì)的分離度以及斑點(diǎn)是否拖尾作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，篩選Fr1.3 分離體系。結(jié)果顯示S2 氯仿-丙酮體系，斑點(diǎn)數(shù)目最多，難分離物質(zhì)對(duì)ΔRf為0.06，確定氯仿-丙酮體系為Fr1.3 組分的洗脫溶劑體系。

2.3.3 洗脫流動(dòng)相比例篩選

分別以V氯仿:V丙酮=100∶0、99∶1、98∶2、97∶3、95∶5 為展開(kāi)劑對(duì)Fr1.3 組分依次層析展開(kāi)Rf的結(jié)果見(jiàn)表3，待分離化合物為1～6 的Rf在0.10 ＜Rf≤0.85，初始展開(kāi)劑下的Rf在0.10 ＜Rf≤0.65，初始條件四次展開(kāi)化合物1～6 的Rf變化在0.06 ＜Rf≤0.89(見(jiàn)表4)，難分離化合物對(duì)5、6 的ΔRf經(jīng)后由0.06 增大為0.10，預(yù)示梯度洗脫分離6 個(gè)化合物是可能的。

表2 Fr1.3 組分分離系統(tǒng)TLC 溶劑篩選結(jié)果Table 2 Systemic screening results of TLC developing solvents for Fr 1.3

表3 Fr1.3 組分不同溶劑梯度連續(xù)展開(kāi)TLC 的Rf值Table 3 Rf values of the six components in Fr1.3 under different developing solvents

表4 Fr1.3 組分初始洗脫條件下的四次展開(kāi)結(jié)果Table 4 Rfvalues of the six components in Fr1.3 with four times development with initial solvent

2.4 臺(tái)階梯梯度預(yù)測(cè)結(jié)果

由臺(tái)階梯梯度公式計(jì)算Fr1.3 中目標(biāo)化合物在兩臺(tái)階梯度洗脫分離時(shí)的保留體積VR，結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 多階梯梯度保留體積預(yù)測(cè)結(jié)果Table 5 Prediction results of retention volume by multi-step gradients

2.5 制備柱色譜分離

選定臺(tái)階梯度洗脫條件下，1/3 理論上樣量0.55 g、理論上樣量1.65 g、最大上樣量3.95 g 的三次制備柱色譜分離實(shí)踐表明，F(xiàn)r1.3 組分中的6 個(gè)化合物均得到TLC 單點(diǎn)的純化合物，其中2、3、4 等3 個(gè)化合物的HPLC 純度在95%以上。臺(tái)階梯度預(yù)測(cè)結(jié)果與實(shí)際保留體積一致(表6)，1、5、6 號(hào)化合物無(wú)紫外吸收。

圖9 從Fr1.3 分離出的化合物1～6 的TLC 圖Fig.9 TLC chromatograms of compounds 1-6 separated from Fr 1.3

表6 Fr1.3 組分三次制備柱分離結(jié)果Table 6 Results of three times medium-pressure liquid chromatography separation experiments

3 結(jié)論

本文以牡丹皮甲醇提取物為對(duì)象，研究建立了中藥復(fù)雜體系中化學(xué)成分系統(tǒng)色譜分離的前處理方法，構(gòu)建了基于TLC、HPLC 分析的復(fù)雜體系制備色譜分離條件篩選體系，確定了牡丹皮正己烷相的色譜分離填料、洗脫溶劑體系和系統(tǒng)化色譜分離等條件;建立的系統(tǒng)化TLC 方法可以快速選定制備柱色譜的分離條件;臺(tái)階梯度洗脫分離情況下，分離目標(biāo)化合物在初始洗脫溶劑下，其0.10 ＜Rf≤0.65 時(shí)，多階梯梯度預(yù)測(cè)方法準(zhǔn)確預(yù)測(cè)了Fr1.3 組分制備柱分離各化合物的保留體積。該研究方法同樣適用于其他中藥組分的系統(tǒng)分離。

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